曹艷花，劉 洋，翟 磊，張明娟，譚望橋，程 池

(1. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京100015;2. 海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司，海南 ?？?70125)

諾尼(Morinda citrifolia L.)，也被稱為海巴戟、椿根、桔葉巴戟天、諾麗等，是一種生長于熱帶、亞熱帶的茜草科植物. 早期的波利尼西亞人將諾尼帶到夏威夷，此后，夏威夷人將其作為最常用的藥材［1］. 諾尼富含160 余種營養(yǎng)成分，具有非常獨特的保健功效與藥用價值［2］，由于諾尼及其相關(guān)提取物在抗腫瘤、改善免疫調(diào)節(jié)功能、減少肝損傷等方面有積極的作用，因此以其為原料的保健食品已被人們用來輔助治療多種疾病［3］.

植物內(nèi)生菌概念是由DeBary 首先提出的，它是指在植物生活史的一定階段存在于活體植物組織內(nèi)，又不引起植物明顯病害的微生物［4］，其中不乏能夠促進植物生長的有益微生物種類［5－6］. 本研究以西沙群島野生諾尼種子中分離和篩選得到的內(nèi)生細菌菌株CICC 10594 為研究對象，對其進行了多相分類鑒定與分析，旨在為進一步了解其生物功能及其相關(guān)機制奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為野生諾尼種子(采集自中國海南省三沙市永興島，具體位置為北緯16.83°，東經(jīng)112.34°)中分離獲得的菌株，目前于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)保藏，菌株保藏編號為CICC 10594.

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L，pH7.0).

1.1.3 主要試劑 細菌基因組DNA 提取試劑盒、dNTPs、Taq DNA 聚合酶及DNA Marker 等購自天根生化科技有限公司;API 50 CHB 和API 20E 檢驗試劑條購自梅里埃公司;其他化學試劑均為進口分析純產(chǎn)品.

1.2 方 法

1.2.1 菌株分離、純化與保藏 采用稀釋平板涂布法對諾尼種子的內(nèi)生細菌進行分離篩選. 稱取10 g野生諾尼種子，采用乙醇－次氯酸鈉聯(lián)合滅菌［3］的方式對其進行表面滅菌. 在無菌超凈工作臺中將表面已徹底滅菌的野生諾尼種子充分研磨，置于裝有90 mL 無菌ddH2O 的三角瓶中，充分振蕩20 ～30 min 后靜置5 ～10 min. 梯度稀釋以已制備的10－6到10－2倍系列稀釋液涂布LB 平板，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h. 待單菌落出現(xiàn)后，以劃線法轉(zhuǎn)接至LB 斜面，并于4 ℃保藏. 同時將所分離的菌株保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC).

1.2.2 形態(tài)學觀察 將供試菌株接種于LB 固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察其在LB 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征;并利用光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察菌體的形態(tài)特征［8］.

1.2.3 16S rRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育分析 采用試劑盒法提取CICC 10594 菌株的基因組DNA(具體方法參見Tiangen 細菌基因組DNA 提取試劑盒的說明書)，提取獲得的基因組DNA 用w=1.0%的瓊脂糖凝膠進行檢測.

以所獲得的CICC 10594 菌株基因組DNA 作為模板，以27F 和1492R 為引物擴增細菌16S rRNA，正向引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，反向引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')［7］.50 μL PCR 反應(yīng)體系:50 ng DNA 模板，1 ×Taq Reaction Buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 單位Taq 酶(Ferments). 反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min. 采用w=1.0%的瓊脂糖凝膠對PCR 擴增產(chǎn)物進行檢測，并通過ABI 3700 基因測序儀測序. 將測序結(jié)果與EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫進行比對并進行近緣種序列相似度計算［8］，同時采用CLUSTAL W 和MEGA 5.0 軟件對CICC 10594 進行近緣種多序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育分析［9－10］.

1.2.4 生理生化特征鑒定 采用API 20E 及API 50CH 試劑條對菌株CICC 10594 的酶活性、碳源利用等生理生化特征進行檢測，具體操作方法按API 試劑條說明書進行.

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學觀察 菌株CICC 10594 在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h 后，菌落直徑為2 ～4 mm，呈白色、圓形、凸起、濕潤、表面光滑、不透明、邊緣整齊(見圖1a);利用光學顯微鏡觀察，結(jié)果顯示菌體呈短桿狀，單個排列，大小為0.4μm ×0.5μm －0.4μm ×0.8μm，革蘭氏陰性(見圖1b);菌體電子顯微鏡成像效果見圖1c和1d.

圖1 菌株CICC 10594 的形態(tài)學觀察結(jié)果

2.2 16S rRNA 序列系統(tǒng)發(fā)育分析 所提取的菌株CICC 10594 的基因組DNA 片段約為23 kb(見圖2)，其16S rRNA 基因PCR 產(chǎn)物的大小約為1 500 bp(見圖3). 待擴增產(chǎn)物經(jīng)測序及分析處理后，將其序列信息提交至GenBank，登錄號為KJ562861. 以大腸桿菌(Escherichia coli)KCTC 2441T(EU014689)為外群，構(gòu)建CICC 10594 與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4). 系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株CICC 10594 歸屬為腸桿菌屬(Enterobacter sp.).

圖2 CICC 10594 基因組DNA

圖3 CICC 10594 16S rRNA 基因擴增產(chǎn)物

圖4 鄰接法構(gòu)建的CICC 10594 16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 生理生化特征鑒定 經(jīng)API 20E 及API 50CH 試劑條對菌株CICC 10594 的酶活性、碳源利用等生理生化特征進行檢測，結(jié)果顯示:CICC 10594 能夠利用檸檬酸鹽;具有β-半乳糖苷酶活性;并能夠利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、蜜二糖、阿拉伯醇等多種碳源物質(zhì);鳥氨酸脫羧酶試驗(+)，精氨酸雙水解酶試驗(+)，賴氨酸脫羧酶試驗(－)，吲哚(－)，具體結(jié)果詳見表1. 根據(jù)生理生化特征鑒定的結(jié)果，對照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》(第9 版)中標準菌株的生理生化特征，并同API 數(shù)據(jù)庫信息進行比對，與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)的相似性為99.9%，表明菌株CICC 10594為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae).

表1 CICC 10594 的生理生化特征

2.4 菌株CICC 10594 分類鑒定結(jié)論 本研究根據(jù)微生物代謝類型的差異，通過形態(tài)學觀察并結(jié)合16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，采用生理生化分析方法，檢測了微生物對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒定和評價了待檢微生物的分類學地位;同時，結(jié)合菌體形態(tài)和菌落形態(tài)特征的觀察結(jié)果以及生理生化試驗的分析結(jié)果，并參考相關(guān)的文獻報道，鑒定西沙群島野生諾尼種子的內(nèi)生細菌菌株CICC 10594 為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae).

3 討 論

本文采用多相分類鑒定技術(shù)對中國西沙群島野生諾尼種子的內(nèi)生細菌菌株(CICC 10594)進行了“種”水平的分類鑒定，在鑒定中綜合利用了微生物表型、基因型和系統(tǒng)發(fā)育分析等多種不同指標信息，從而實現(xiàn)了對微生物的精確分類［11］，這種方法也已廣泛應(yīng)用于微生物分類學領(lǐng)域.

本研究利用細菌通用引物27F 和1492R 對菌株CICC 10594 的16S rRNA 基因進行了擴增與測序，并通過GenBank 數(shù)據(jù)庫及MEGA 5.0 軟件進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育學的分析，得出CICC 10594 為腸桿菌屬(Enterobacter sp.). 經(jīng)API 20E 及API 50CH 試劑條對菌株CICC 10594 的酶活性、碳源利用等生理生化特征進行檢測，結(jié)果顯示:鳥氨酸脫羧酶試驗(+)，精氨酸雙水解酶試驗(+)，賴氨酸脫羧酶試驗(－)，吲哚(－)，同時，CICC 10594 能夠利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、麥芽糖、蔗糖、蜜二糖、阿拉伯醇等多種碳源物質(zhì)，符合陰溝腸桿菌的生理生化特征，與API 數(shù)據(jù)庫信息進行比對，它與陰溝腸桿菌的相似性為99.9%，故API 鑒定其為陰溝腸桿菌. 綜上，通過16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合菌體形態(tài)及菌落形態(tài)特征，參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》(第9 版)生理生化特征及API 鑒定結(jié)果分析，確定CICC 10594 為陰溝腸桿菌.

2005 年，Hoffmann［12］等確定陰溝腸桿菌包含2 個亞種，分別為陰溝腸桿菌陰溝亞種(Enterobacter cloacae subsp. cloacae)和陰溝腸桿菌溶亞種(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens). 腸桿菌屬菌株為多種植物的內(nèi)生優(yōu)勢菌. 楊海蓮等［13］分離獲得的水稻內(nèi)生細菌MR12 經(jīng)鑒定為陰溝腸桿菌，其研究發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌MR12 作為水稻的內(nèi)生細菌，不僅具有固氮活性，而且具有防止水稻病害的能力. 本研究首次自諾尼植物中發(fā)現(xiàn)并分離得到了CICC 10594，并證明其為陰溝腸桿菌，但對于此菌株的固氮活性及其他功能還有待于進一步的研究. 此外，鑒于該菌為分離自野生諾尼種子的內(nèi)生細菌群落中的優(yōu)勢菌，因此，它可能在諾尼植物的生長發(fā)育及功效性成分的產(chǎn)生方面發(fā)揮一定的作用，但是否如此，尚有待進一步的研究.本研究利用微生物多相分類鑒定技術(shù)對其分類地位進行了全面的和準確的鑒定，這為今后開展其生物學功能的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ). 同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，CICC 10594 能夠利用檸檬酸鹽，并具有β －半乳糖苷酶的活性;除此之外，它還能夠利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、麥芽糖、蔗糖、蜜二糖、阿拉伯醇等多種碳源物質(zhì)，這為今后充分利用該菌的生物活性和代謝產(chǎn)物，實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)利用價值奠定了基礎(chǔ).

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