王新 李寶華 張明昌 張向東

已知白內(nèi)障是由于人眼接受外源性紫外線照射和內(nèi)源性體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基等導(dǎo)致的晶狀體上皮細胞DNA的損傷超越修復(fù)能力，以致細胞凋亡所引起的[1]。尤其是老年人晶狀體上皮細胞DNA的損傷常年積累導(dǎo)致晶狀體上皮細胞凋亡的幾率更高；因此，白內(nèi)障為老年人最常見的眼病，全球致盲人數(shù)可達1800萬之多[2]。本研究探討吡諾克辛鈉液對H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮SRA01/04細胞凋亡的抑制作用。分析應(yīng)用氧化應(yīng)激抑制藥對白內(nèi)障的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1培養(yǎng)的細胞來源細胞SRA01/04購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院生物檢測中心細胞庫。SRA01/04細胞用含體積分數(shù)為10%FBS(TBD公司，天津)的低糖DMEM(Sigma公司，美國)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度。細胞記數(shù)后稀釋成30×106L-1的細胞懸液，用吸管吸出單細胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶里。當細胞鋪滿瓶底達80%以上處于對數(shù)生長期時，進行傳代培養(yǎng)，當細胞達到一定數(shù)量時即可進行實驗。

1.2主要試劑及儀器吡諾克辛鈉液(武漢五景藥業(yè)有限公司)、低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，美國)、Bcl-2鼠單抗(SantaCruz公司，美國)、Bax鼠單抗(SantaCruz公司，美國)、Caspase-3的兔多抗(Zymed，美國)；圖像分析儀(上海山富科技儀器廠)。

1.3實驗分組將培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞SRA01/04使用一次性六孔無菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)(30×106L-1的細胞懸液，每孔2 mL)。隨機分為3組，每組2個復(fù)孔，分別為：先加藥組，即先在細胞培養(yǎng)液內(nèi)加入吡諾克辛鈉液300 μL培養(yǎng)23.5 h后，再加0.5 μmol·L-1H2O2培養(yǎng)30 min；后加藥組，即在細胞培養(yǎng)液內(nèi)先加入0.5 μmol·L-1H2O2，30 min后再加吡諾克辛鈉液300 μL培養(yǎng)23.5 h；對照組，即不加H2O2及藥物培養(yǎng)24 h。

1.4應(yīng)激反應(yīng)檢測羥自由基水平檢測：應(yīng)用試劑盒(建成生物工程研究所，南京)嚴格按照其說明書檢測各組細胞的羥自由基水平。

一氧化氮合酶(NOS)活性檢測：各組完整細胞的滴片標本以40 g·L-1多聚甲醛固定10 min后，PBS洗3遍，加底物37 ℃放置1 h，水洗終止反應(yīng)，油鏡下觀察照相。同時進行以PBS代替底物的陰性對照。

1.5免疫組織化學(xué)反應(yīng)檢測(1)將細胞滴片標本從-20 ℃冰箱取出，用冷風吹3 h，使其徹底干燥。將玻片放入3 g·L-1Triton X-100/PBS溶液中，室溫放置10～20 min。(2)取出玻片，各組細胞的滴片標本以40 g·L-1多聚甲醛固定10 min后，室溫下PBS溶液漂洗3次，每次5 min。(3)將玻片用吸水紙吸干后，用體積分數(shù)10%正常山羊血清封閉液封閉20～30 min。(4)用吸紙吸除多余血清，分別加入1100稀釋的一抗工作液：Bcl-2鼠單抗及Bax鼠單抗，Caspase-3的兔多抗。置封閉濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。次日，將濕盒從4 ℃冰箱中取出，室溫放置20 min。然后室溫下免疫組織化學(xué)用PBS溶液漂洗3次，每次5 min。(5)加入1200稀釋的HRP/ALP標記羊抗鼠或抗兔二抗，室溫放置30 min。然后室溫下免疫組織化學(xué)用PBS溶液漂洗3次，每次5 min。(6)應(yīng)用ABC試劑盒和DAB底物(中杉)顯色，37 ℃顯色20 min，顯色后立即用蒸餾水將DAB和H2O2洗去。(7)油鏡下觀察照相，同時設(shè)不加一抗(用PBS溶液代替)的空白對照。

1.6凋亡情況檢測各組細胞的滴片標本用40 g·L-1多聚甲醛固定10 min后，PBS洗3遍，首先用5 ng·mL-1蛋白酶K 37 ℃消化5 min，PBS洗3遍，用40 g·L-1多聚甲醛復(fù)固定，對每個標本加15 μL TdT 緩沖液，內(nèi)含0.5 μL的TdT酶和0.5 μL Bio-dUTP，4 ℃過夜。次晨以1300稀釋的鏈酶親和素-堿性磷酸酶37 ℃放置20 min，用pH 7.5 Tris-HCl緩沖液洗3次，再用pH 9.5 Tris-Cl 緩沖液洗2次，NBT/BCIP顯色，鏡下觀察顯色情況，水洗終止反應(yīng)，照相。同時做不加TdT酶的陰性對照。計數(shù)各組200個細胞，計算細胞中凋亡細胞的百分率。

2 結(jié)果

2.1應(yīng)激反應(yīng)NOS染色呈粉紫色細顆粒(圖1)，加藥組細胞，尤其后加藥組細胞由于凋亡的緣故，細胞體積多小于對照組。NOS分布于胞質(zhì)；先加藥組NOS染色呈淡紫色細顆粒狀；后加藥組NOS染色呈紫色細顆粒者較多；對照組NOS染色呈陰性。各組NOS活性值和羥自由基檢測水平見表1。由表1知，后加藥組的NOS活性及羥自由基檢測值高于先加藥組，更高于對照組，兩組檢測指標之間呈正相關(guān)(r=0.88，P<0.01)。

2.2Bcl-2、Bax及Caspase-3表達情況Bcl-2、Bax表達于胞質(zhì)，染色呈棕黃色細顆粒狀(圖2)，Bcl-2-IR(免疫反應(yīng)性) 分布于胞質(zhì)，先加藥組染色呈淡棕色細顆粒狀，比對照組減弱；后加藥組Bcl-2-IR的著色更弱；對照組Bcl-2-IR染色呈較明顯棕色細顆粒。Bax-IR分布于胞質(zhì)：先加藥組Bax-IR呈棕色細顆粒狀，比對照組著色深；后加藥組比對照組著色顯著增強；對照組Bax-IR染色呈淡棕色細顆粒狀。Caspase-3-IR主要分布于胞核：先加藥組Caspase-3-IR染色呈深棕色細顆粒狀，比對照組著色較深；后加藥組Caspase-3-IR呈深棕色細顆粒狀，比對照組著色深；對照組呈棕色細顆粒狀(圖2)。其各自表達的灰度值見表2。

表1 各組細胞NOS活性值及羥自由基檢測水平的比較

表2 各組細胞Bax、Bcl-2及Caspase-3表達的灰度值比較

Figure 1 Activity of NOS showed pinkish purple fine particles in the cytoplasm.The post-drug group showed more pinkish fine particle,and the cell capacity was smaller than the control group.The control group had no NOS activity.It was negative.Pre:Pre-drug group;Post:Post-drug group;Control:Control group(×1000) NOS染色呈粉紫色細顆粒狀分布于胞質(zhì)，后加藥組紫色細顆粒較多，細胞體積多小于對照組，對照組未見NOS活性，呈陰性。Pre代表先加藥組，Post代表后加藥組，Control代表對照組

2.3凋亡情況檢測TUNEL法檢測凋亡的信號呈藍紫色細顆粒狀，分布于胞核，可呈半月狀移位于細胞邊緣，有時可見凋亡小體，凋亡的細胞體積縮小(圖3)。先加藥組TUNEL染色呈紫色細顆粒狀，主要分布于胞核；后加藥組亦主要分布于胞核，且胞核多偏于細胞一側(cè)，有時可附有凋亡小體；對照組圖中未見TUNEL陽性信號。

對照組的凋亡率為5%，先加藥組為25%；后加藥組為50%，3組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=103.98，P<0.01)。

3 討論

產(chǎn)生和降解氧化產(chǎn)物之間失衡會引起氧化應(yīng)激，這個名詞有近20 a的歷史并且在醫(yī)學(xué)文獻中經(jīng)常出現(xiàn)[3]。從生物氧化反應(yīng)的分子過程看，氧作為一種必需物質(zhì)具有益害兩重性。一方面，氧作為呼吸鏈的終端電子受體參與產(chǎn)生的氧化磷酸化反應(yīng)，是維持生命的重要能量代謝過程；另一方面，氧可通過一系列化學(xué)反應(yīng)生成有害的超氧歧化物和各種不同的反應(yīng)氧中介物(自由基、反應(yīng)氧簇)，造成細胞損傷并導(dǎo)致疾病和衰老。近年研究發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細胞凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的重要原因，它發(fā)生于混濁之前，自由基是晶狀體上皮細胞凋亡的重要激發(fā)因素。

細胞凋亡即程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)早在20世紀70年代初已被提出。細胞凋亡是多細胞生物生命活動中，在生理或外界因素刺激下進行的自身調(diào)節(jié)機制。bcl-2是公認的長壽基因，最初從人的濾泡性B細胞淋巴瘤中分離出來，通過轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)。bcl-2基因?qū)υS多原因引起的細胞凋亡具有明顯的抑制作用。bcl-2基因編碼的蛋白是跨膜蛋白，位于線粒體膜、核膜及胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。bcl-2能抑制多種模型中的細胞凋亡。細胞凋亡是由于細胞中活性氧類物質(zhì)積累引起的，一些抗氧化劑能阻斷生長因子缺失引起的凋亡，而bcl-2能抑制過氧化物誘導(dǎo)的凋亡。bcl-2家族還包括bcl-x、bax及bad，其中bcl-2和bcl-x抑制細胞凋亡，而bax及bad則促進細胞凋亡[4]。

Figure 2 Signal of Bcl-2,Bax in each group were located in cytoplasm.In Bcl-2-IR there were lest pinkish fine particle in post-drug group.The control group had more pinkish fine particle.And in Bax-IR we could get the adverse results.The signal of caspase-3 in each group was located in nuclei.It was just like the result in Bax-IR.Comparing about the immunostaining In each group.We can compare the value of each group through the detection index.Pre:Pre-drug group;Post:Post-drug group;Control:Control group (×1000) Bcl-2、Bax表達于胞質(zhì)呈棕黃色細顆粒著染：Bcl-2-IR先加藥組呈淡棕色細顆粒狀，比對照組著色弱，后加藥組Bcl-2-IR的著色更弱，對照組Bcl-2-IR的棕色細顆粒較明顯；Bax-IR則剛好相反。Caspase-3-IR主要表達于胞核，先加藥組Caspase-3-IR呈深棕色細顆粒狀，著色深；后加藥組Caspase-3-IR亦呈深棕色細顆粒著染。Pre代表先加藥組，Post代表后加藥組，Control代表對照組(×1000)

Figure 3 Apoptotic signal of TUNEL in each group were dyed to amethyst and all located in nuclei.There were the amethyst particles in the nuclei in the pre-drug group,and there were the amethyst particle in the side of the nuclei,sometimes the apoptotic body could be seen in the post-drug group.No positive signal in the control group.Pre:Pre-drug group;Post:Post-drug group;Control:Control group(×1000) TUNEL檢測凋亡的染色呈紫色細顆粒狀，主要分布于胞核。先加藥組TUNEL染色呈紫色細顆粒狀，主要分布于胞核；后加藥組TUNEL染色呈紫色細顆粒狀，主要分布于胞核，有時可附有凋亡小體；對照組圖中未見TUNEL陽性染色。Pre代表先加藥組，Post代表后加藥組，Control代表對照組(×1000)

在對哺乳動物細胞凋亡進行研究時，發(fā)現(xiàn)一組ICE類蛋白。它們均具有在天冬氨酸殘基后切斷肽鍵的能力，轉(zhuǎn)染不同細胞后可誘導(dǎo)凋亡，統(tǒng)稱為Caspase家族[3]。迄今為止已鑒定了14種此類蛋白酶，按其被發(fā)現(xiàn)的先后順序分別稱為Caspase 1～14。Caspase被譽為“殺手”蛋白酶或“凋亡步兵”，是細胞凋亡的重要標志，也是凋亡的最終共同通路。Caspase-3 mRNA水平在晶狀體上皮細胞凋亡過程中無明顯改變。這說明在凋亡信號作用下Caspase主要通過增強酶活性介導(dǎo)晶狀體上皮細胞凋亡，而非依賴增加自身的合成。細胞凋亡是一種很復(fù)雜的生理及病理現(xiàn)象，細胞凋亡的線粒體途徑與死亡受體途徑是相互作用的。早期研究發(fā)現(xiàn)兩者可在Caspase-3處會合，并通過Caspase-3激活下游底物而誘導(dǎo)細胞凋亡。兩條途徑在bcl-2基因產(chǎn)物處也發(fā)生會合[5]。

0.5 mmol·L-1H2O2是體外氧化實驗中常用的濃度[6]，有關(guān)H2O2對體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞及其抑制藥物的作用是氧化反應(yīng)研究領(lǐng)域的熱點之一。Wang等[7]報道水楊酸鈉抑制H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)的人晶狀體上皮HLB-3細胞凋亡，與其上調(diào)熱休克蛋白27有關(guān)。Chen等[8]報道?；撬嵋种艸2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細胞凋亡，可延緩或減輕白內(nèi)障的發(fā)病和進程。Huang等[9]報道Co-SZ滴眼液抑制H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞凋亡的機制與上調(diào)Bcl-2 表達和下調(diào)Bax 表達有關(guān)。Peterson等[10]報道晶狀體上皮細胞凋亡與Caspase-3激活有關(guān)。在H2O2引起的人晶狀體上皮細胞的氧化應(yīng)激下細胞的糖分解、線粒體活性被破壞[11]，甚至可導(dǎo)致DNA損傷，細胞凋亡。

本實驗應(yīng)用的含有?；撬岬倪林Z克辛鈉液為醛糖還原酶抑制物，具有抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)；加此抑制藥后與凋亡相關(guān)的Bax與Bcl-2的表達和Caspase-3表達水平減低，細胞凋亡率也降低。Burch等[12]指出氧化應(yīng)激反應(yīng)包括兩類：反應(yīng)氧簇和反應(yīng)氮簇，因此本實驗以羥自由基水平和NOS酶活性各檢測氧化應(yīng)激反應(yīng)的反應(yīng)氧簇和反應(yīng)氮簇；結(jié)果顯示預(yù)先加藥組的反應(yīng)氧簇和反應(yīng)氮簇均低于后加藥組，其抑制效應(yīng)更強于后加藥組。此研究結(jié)果提示在晶狀體出現(xiàn)混濁之前應(yīng)用抑制藥物的預(yù)防效應(yīng)可能更優(yōu)于晶狀體出現(xiàn)混濁之后，更具有延緩白內(nèi)障發(fā)病的作用。

1 Pendergrass W，Penn P，Possin D，Wolf N.Accumulation of DNA nuclear and mitochondrial debris，and ROS at sites of sites of age-related cortical cataract in mice[J].InvestOphthalmolVisSci，2005，46(12)：4661-4670.

3 Vinson JA.Oxidative stress in cataracts[J].Pathophysiology，2006，13(3)：151-162.

4 張永香，郭蘊琦，王團結(jié)，張健，朱鳳蓮，李樹軍，等.長程服用苯巴比妥對幼鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白的影響[J].中華實用兒科臨床雜志，2013，28(12)：923-926.

5 丁小艷，張林，馬波，王從毅，吳利安.胰島素樣生長因子-1對人晶狀體上皮細胞增殖的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，29(9)：653-655.

6 Choi YJ，Kong JS，Park JH，Lee YJ，Choi JS，Kang YH.Polyphenolic flavonoids differ in their antiapoptotic efficacy in hydrogen peroxide-treated human vascular endothelial cells[J].JNutr，2003，133(4)：985-991.

7 Wang Z，Zhou Y.Effects of sodium salicylate on the expression of HSP27 protein during oxidative stress in tissue-cultured human lens epithelial cells[J].JHuazhongUnivSciTechnologMedSci，2006，26(6)：753-755.

8 Chen F，Chen C.An experimental research of taurine on H2O2-induced bovine lens epithelial cell apoptosis[J].ZhonghuaYanKeZaZhi，2000，36(4)：272-274.

9 Huang XR，Qi MX，Wang ZY，Chen Y.Inhibition effects of compound leech eye drops on apoptosis of lens epithelial cells and expressions of Bcl-2 and Bax genes in rats[J].ZhongXiYiJieHeXueBao，2007，5(6)：681-685.

10 Peterson A，Carlsson T，Karlsson JO，Zetterberg M.The proteasome and intracellular redox status：Implications for apoptotic regulation in lens epithelial cells[J].CurrEyeRes，2007，32(10)：871-882.

11 Spector A，Ma W，Sun F，Li D，Kleiman NJ.The effect of H2O2and tertiary butyl hydroperoxide upon a murine immortal lens epithelial cell line，alpha TN4-1[J].ExpEyeRes，2002，75(5)：573-582.

12 Burch PM，Heinitz NH.Redox regulation of cell-cycle re-entry：cyclin D1 as a primary target for the mitogenic effects of reactive oxygen and nitrogen species[J].AntioxidRedoxSignal，2005，7(5-6)：741-751.