楊曉春 許建彪 唐羅生

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)中起著重要的作用，它是DR血管生成和滲漏必不可少的誘導(dǎo)因子，涉及病變的各個(gè)階段[1]。近年研究表明，DR患者體內(nèi)的一種毒性物質(zhì)非酶糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGE)能促使視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞表達(dá)VEGF增加[2]。P44/42 MAPK和PI3K/Akt是兩個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)VEGF的表達(dá)具有重要作用[3-4]，但它們是否參與了AGE誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞外VEGF的表達(dá)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文通過(guò)研究p44/42 MAPK阻斷劑PD98059和PI3K/Akt阻斷劑LY294002對(duì)AGE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞外VEGF表達(dá)的影響，探討AGE誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人RPE細(xì)胞株ARPE-19由湖南大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，SP法鑒定，取3-5代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物工程技術(shù)有限公司；PD98059和LY294002購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))；VEGF試劑盒、鏈霉親和素-生物素化-過(guò)氧化物酶購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；兔抗人磷酸化Akt單克隆抗體、鼠抗人磷酸化p44/42單克隆抗體為碧云天生物技術(shù)研究所進(jìn)口分裝；羊抗鼠抗兔二抗檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。AGE及AGE對(duì)照物的制備同文獻(xiàn)[5]。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定試劑濃度及干預(yù)時(shí)間。

1.2方法實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、AGE組(包括時(shí)間依賴組、劑量依賴組)、PD98059組、LY294002組和PD98059+LY294002組。人RPE細(xì)胞株ARPE-19細(xì)胞按100×103個(gè)接種于24孔板中，放入經(jīng)體積分?jǐn)?shù)4%多聚賴氨酸處理的蓋玻片，以含體積分?jǐn)?shù)15%FBS的無(wú)糖DMEM液培養(yǎng)至80%融合，換不含F(xiàn)BS的無(wú)糖DMEM液培養(yǎng)24 h。根據(jù)分組分別加入含下述試劑的培養(yǎng)液。

1.2.1AGE處理ARPE-19細(xì)胞時(shí)間依賴組加入100 mg·L-1AGE，每組在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2 h、6 h、8 h、12 h、24 h。劑量依賴組在培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)時(shí)間為8 h，加入AGE濃度分別為50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1。同等濃度AGE對(duì)照物代替AGE作為對(duì)照組。

1.2.2PD98059和LY294002對(duì)ARPE-19細(xì)胞的干預(yù)劑量依賴組分四組，其中兩組分別加入20 μmol·L-1PD98059和30 μmol·L-1LY294002，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后，分別加入0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1的AGE，培養(yǎng)箱孵育8 h。另外兩組分別加入0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1的PD98059和0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、30 μmol·L-1、60 μmol·L-1的LY294002，孵育1 h后都加入100 mg·L-1AGE，孵育8 h。DMSO替代PD98059或LY294002作為空白對(duì)照組。時(shí)間依賴組分三組：分別加入20 μmol·L-1PD98059、30 μmol·L-1LY294002和同時(shí)加入上述兩試劑，孵育1 h后加入100 mg·L-1AGE，分別培養(yǎng)2 h、6 h、8 h、12 h、24 h。AGE對(duì)照物替代AGE作為對(duì)照組。

1.2.3VEGF蛋白表達(dá)的測(cè)定吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按體積比12稀釋。96孔酶標(biāo)板中加入配制的標(biāo)準(zhǔn)品和經(jīng)稀釋的樣品各100 μL，加上蓋，37 ℃反應(yīng)90 min。拍干板內(nèi)液體，按每孔0.1 mL依次加入1100稀釋的生物素標(biāo)記人VEGF抗體，37 ℃反應(yīng)60 min。去酶標(biāo)板內(nèi)液，PBS洗滌3次。按每孔0.1 mL依次加入1100稀釋并在37 ℃平衡30 min的鏈霉親和素-生物素化-過(guò)氧化物酶工作液，37 ℃反應(yīng)30 min。PBS洗滌5次。按每孔90 μL加入37 ℃平衡30 min的TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)20 min。每孔加0.1 mL TMB終止液。酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定樣品濃度值。

1.2.4P44/42、Akt信號(hào)分子表達(dá)的檢測(cè)吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)板各孔加入40 g·L-1多聚甲醛固定10 min。配好洗滌液：1 g·L-1Triton X-100、8 g·L-1NaCl、2.42 g·L-1Tris堿，兌H2O。培養(yǎng)板去固定液，搖床上洗滌液洗滌3次，每次5 min。正常山羊血清封閉60 min。去封閉液，抗體1100稀釋，各實(shí)驗(yàn)組分別加入鼠抗人磷酸化p44/42 MAPK單克隆抗體，或兔抗人磷酸化Akt單克隆抗體。4 ℃濕盒過(guò)夜。去一抗，洗滌液洗3次。分別加結(jié)合FITC的山羊抗兔或抗鼠二抗(1100稀釋)，室溫避光孵育60 min。洗滌液洗滌3次。取出細(xì)胞爬片?？篃晒獯闫馄悍馄?。Zeiss 510 共焦顯微鏡分析免疫熒光結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件，組內(nèi)比較用單因素方差分析(ANOVA)，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)法。P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1AGE對(duì)ARPE-19細(xì)胞外VEGF表達(dá)的影響AGE處理ARPE-19細(xì)胞后，VEGF的表達(dá)改變見(jiàn)表1-表2。由表1-表2可見(jiàn)：隨著AGE濃度或作用時(shí)間的增加，上清液中VEGF表達(dá)增加。當(dāng)AGE濃度為100 mg·L-1或作用時(shí)間為8 h時(shí)，VEGF表達(dá)最高。AGE組VEGF水平與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，各AGE組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：加入AGE后，磷酸化p44/42和磷酸化Akt熒光增強(qiáng)，即表達(dá)增加(圖1-圖2)。

表1 AGE作用不同時(shí)間對(duì)VEGF表達(dá)的影響

表2 不同濃度AGE對(duì)VEGF表達(dá)的影響

Figure 1 Expression of AGE and phosphorylation p44/42.Green fluorescence directed by arrow was phosphorylated p44/42.A:Blank control group;B:100 mg·L-1 AGE group AGE與磷酸化p44/42的表達(dá)。箭頭所指綠色熒光為磷酸化p44/42免疫標(biāo)記熒光。A:空白對(duì)照組；B：100 mg·L-1 AGE組

Figure 2 Expression of AGE and phosphorylation Akt.Green fluorescence directed by arrow was phosphorylated Akt.A:Blank control group;B:100 mg·L-1 AGE group AGE與磷酸化Akt的表達(dá)。箭頭所指綠色熒光為磷酸化Akt免疫標(biāo)記熒光。A：空白對(duì)照組；B：100 mg·L-1 AGE組

2.2PD98059和LY294002對(duì)AGE誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)的影響加入PD98059或LY294002后，VEGF表達(dá)明顯下降，加入0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1PD98059后，100 mg·L-1AGE誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞VEGF表達(dá)分別為(201.40±7.63)pg·L-1、(107.13±4.60)pg·L-1、(57.35±5.29)pg·L-1、(75.77±3.62)pg·L-1；加入0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、30 μmol·L-1、60 μmol·L-1LY294002后，100 mg·L-1AGE誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞VEGF表達(dá)分別為(222.92±6.28)pg·L-1、(133.14±5.06)pg·L-1、(81.51±8.10)pg·L-1、(112.55±4.06)pg·L-1。磷酸化p44/42和磷酸化Akt表達(dá)也下降(圖3-圖4)，其下降程度隨阻斷劑濃度增高而加大，即VEGF表達(dá)與PD98059和LY294002有劑量依賴關(guān)系(P<0.01)。但PD98059和LY294002不能完全阻斷AGE誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)，表現(xiàn)為單獨(dú)加入PD98059或LY294002，VEGF表達(dá)仍與AGE劑量和作用時(shí)間呈依賴關(guān)系(P<0.01，表3-表4，圖3)。同時(shí)加入PD98059和LY294002，VEGF表達(dá)與AGE作用時(shí)間無(wú)關(guān)(P>0.05，見(jiàn)圖5)。

表3 PD98059作用下VEGF表達(dá)與AGE濃度的關(guān)系

表4 LY294002作用下VEGF表達(dá)與AGE濃度的關(guān)系

3 討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控的有序是高等動(dòng)物發(fā)育、生長(zhǎng)、進(jìn)化的必要條件之一。如果信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制失調(diào)，細(xì)胞的運(yùn)行周期和基因表達(dá)就會(huì)失控而導(dǎo)致疾病發(fā)生。DR的發(fā)生涉及一系列信號(hào)分子的激活。p44/42 MAPK和PI3K/Akt是兩個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可被多種胞外刺激信號(hào)如生長(zhǎng)因子、激素等激活。有研究表明它們?cè)谘蹆?nèi)的作用非常廣泛，VEGF的許多生物學(xué)功能都需要它們的參與[6-7]。趙煒等[8]研究證實(shí)，p42/p44 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了缺氧誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞VEGF的表達(dá)。Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以通過(guò)PI3K/Akt/NF-κB通路上調(diào)人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)。組織缺氧和氧化應(yīng)激是DR的重要病理生理機(jī)制[10-11]，那么p42/p44 MAPK和PI3K/Akt兩個(gè)信號(hào)通路是否參與了DR病變過(guò)程中VEGF的表達(dá)呢？

Figure 3 Expression of phosphorylation p44/42 induced by AGE with different concentrations of PD98059.Green fluorescence directed by arrow was phosphorylated p44/42.A:Blank control group;B,C,D:10 μmol·L-1,20 μmol·L-1,40 μmol·L-1 PD98059 group 不同濃度PD98059與AGE誘導(dǎo)下磷酸化p44/42的表達(dá)。箭頭所指綠色熒光為磷酸化p44/42免疫標(biāo)記熒光。A:空白對(duì)照組；B、C、D分別為10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1 PD98059組

Figure 4 Expression of phosphorylation Akt induced by AGE with different concentrations of LY294002.Green fluorescence directed by arrow was phosphorylated Akt.A:Blank control group;B,C,D:10 μmol·L-1,30 μmol·L-1,60 μmol·L-1 LY294002 group 不同濃度LY294002與AGE誘導(dǎo)下磷酸化Akt的表達(dá)。箭頭所指綠色熒光為磷酸化Akt免疫標(biāo)記熒光。A:空白對(duì)照組；B、C、D分別為10 μmol·L-1、30 μmol·L-1、60 μmol·L-1 LY294002組

Figure 5 Expression of VEGF at different time after blocked of p44/42 and/or PI3K 阻斷p44/42和PI3K后不同時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AGE可以使ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF增加，同時(shí)磷酸化p44/42和Akt信號(hào)分子表達(dá)增強(qiáng)。加入p44/42阻斷劑PD98059或PI3K阻斷劑LY294002后，VEGF和兩個(gè)信號(hào)分子的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明p44/42 MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路參與了AGE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞VEGF的表達(dá)。但只阻斷一個(gè)通路，VEGF表達(dá)仍隨AGE濃度和作用時(shí)間而增加，同時(shí)阻斷兩個(gè)信號(hào)通路，AGE介導(dǎo)的VEGF過(guò)表達(dá)被完全阻斷，說(shuō)明AGE誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞過(guò)表達(dá)VEGF是由p44/42 MAPK和PI3K/Akt兩個(gè)信號(hào)通路介導(dǎo)的，只阻斷一個(gè)通路，細(xì)胞仍能通過(guò)另一通路表達(dá)VEGF。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PD98059和LY294002對(duì)人RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF的抑制作用具有劑量依賴關(guān)系，但兩者濃度分別到達(dá)40 μmol·L-1和60 μmol·L-1后，其對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用不再增強(qiáng)。

有研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/P70S6K活化后，p44/42的活化也被抑制，反之不會(huì)出現(xiàn)類似結(jié)果，提示PI3K除作用于Akt外，還位于p44/42的上游，控制p44/42通路[8]。本實(shí)驗(yàn)中，我們比較分別阻斷兩個(gè)通路后AGE作用時(shí)間與VEGF表達(dá)的關(guān)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。可能在本過(guò)程中，PI3K對(duì)p44/42的激活作用并不顯著。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，p44/42 MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路與AGE誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF具有顯著相關(guān)性，p44/42 MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路很可能是DR患者新生血管生成和血管滲漏的重要機(jī)制。PD98059和LY294002可以阻斷這一過(guò)程，但它們能否成為治療DR的有效藥物尚需進(jìn)一步研究。

1 Ozturk BT，Bozkurt B，Kerimoglu H，Okka M，Kamis U，Gunduz K.Effect of serum cytokines and VEGF levels on diabetic retinopathy and macular thickness[J].MolVis，2009，19(15)：1906-1914.

2 Kim YS，Jung DH，Lee IS，Choi SJ，Yu SY，Ku SK，etal.Effects of allium victorialis leaf extracts and its single compounds on aldose reductase，advanced glycation end products and TGF-β1 expression in mesangial cells[J].BMCComplementAlternMed，2013，3(13)：251-254.

3 Binion DG，Otterson MF，Rafiee P.Curcumin inhibits VEGF-mediated angiogenesis in human intestinal microvascular endothelial cells through COX-2 and MAPK inhibition[J].Gut，2008，57(11)：1509-1517.

4 Wu M，Xu T，Zhou Y，Lu H，Gu Z.Pressure and inflammatory stimulation induced increase of cadherin-11 is mediated by PI3K/Akt pathway in synovial fibroblasts from temporomandibular joint[J].OsteoarthrCartilage，2013，21(10)：1605-1612.

5 Li W，Xu H，Hu Y，He P，Ni Z，Xu H，etal.Edaravone protected human brain microvascular endothelial cells from methylglyoxal-induced injury by inhibiting AGEs/RAGE/oxidative stress[J].PLoSOne，2013，8(9)：e76025.

6 Yun SP，Lee MY，Ryu JM，Song CH，Han HJ.Role of HIF-1alpha and VEGF in human mesenchymal stem cell proliferation by 17beta-estradiol：involvement of PKC，PI3K/Akt，and MAPKs[J].AmJPhysiolCellPhysiol，2009，296(2)：317-326.

7 Cheng Y，Jiang S，Hu R，Lv L.Potential mechanism for endothelial progenitor cell therapy in acute myocardial infarction：Activation of VEGF-PI3K/Akte-NOS pathway[J].AnnClinLabSci，2013，43(4)：395-401.

8 趙煒，王雨生，張瑞，張鵬，惠延年.p42/44 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)中的作用[J].眼科新進(jìn)展，2004，24(2)：109-112.

9 Zhou M，Song X，Huang Y，Wei L，Li Z，You Q，etal.Wogonin inhibits H2O2-induced angiogenesis via suppressing PI3K/Akt /NF-κB signaling pathway[J].VasculPharmacol，2014，60(3)：110-119.

10 Rodrigues M，Xin X，Jee K，Babapoor-Farrokhran S，Kashiwabuchi F，Ma T，etal.VEGF secreted by hypoxic müller cells induces MMP-2 expression and activity in endothelial cells to promote retinal neovascularization in proliferative diabetic retinopathy[J].Diabetes，2013，62(11)：3863-3873.

11 Tarr JM，Kaul K，Chopra M，Kohner EM，Chibber R.Pathophysiology of diabetic retinopathy[J].ISRNOphthalmol，2013，2013：343560.

12 Zubilewicz A，Hecquet C，Jeanny J，Soubrane G，Courtois Y，Mascarelli F.Proliferation of CECs requires dual signalling through both MAPK/ERK and PI3K/AKt pathways[J].InvestOphthalmolVisSci，2001，42(2)：488-496.