石珂 趙璐 游志鵬 張倩 汪昌運(yùn)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是全球主要的不可逆致盲性眼病之一，據(jù)調(diào)查在美國(guó)有410萬(wàn)成年人患有DR[1]。目前已公認(rèn)高血糖是DR重要的起始因素，體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖環(huán)境會(huì)損傷視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞等光感受器細(xì)胞。視桿細(xì)胞負(fù)責(zé)暗視覺(jué)，其損傷將嚴(yán)重影響患者的視功能[2]，如何抑制糖尿病患者視桿細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞的損害已成為目前研究的熱點(diǎn)。根皮素是一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT1)抑制劑，早在1986年已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)根皮素可以抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入肝[3]，目前已證實(shí)GLUT1是葡萄糖通過(guò)血-視網(wǎng)膜屏障的唯一載體[4]。我們?cè)O(shè)想利用根皮素限制GLUT1轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入視網(wǎng)膜而降低視網(wǎng)膜組織含糖量，可能對(duì)視桿細(xì)胞等神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用。本研究通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病小鼠模型后予以根皮素，而后檢測(cè)并比較暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)振幅和視網(wǎng)膜外核層厚度，以判斷根皮素對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞功能和形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器復(fù)方托吡卡胺滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社)，重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子眼用凝膠(珠海億勝制藥公司)。STZ、根皮素和葡萄糖含量測(cè)定試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)，檸檬酸緩沖液(北京天根生化科技有限公司)，電子分析天平(上海精科天平廠)，視網(wǎng)膜電圖儀(美國(guó)Diagnosys公司)，光譜分析儀(德國(guó)Spectro公司)，生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康8周齡無(wú)眼疾近交系雄性C57BL/6小鼠18只，體質(zhì)量20～30 g，打上耳釘編號(hào)后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取分為正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組和根皮素治療組，每組6只。建立DM模型方法：小鼠禁食8 h后腹腔注射STZ連續(xù)5 d，注射前將STZ溶于pH 4.5的0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液里，而后糖尿病對(duì)照組和根皮素治療組予以50 mg·kg-1劑量注射，正常對(duì)照組予以等量檸檬酸鹽緩沖液腹腔注射。第7天采尾部靜脈血測(cè)量血糖，大于16.7 mmol·L-1即認(rèn)為建模成功。成模后根皮素治療組予以根皮素100 mg·kg-1灌胃，連續(xù)12周，隔日進(jìn)行1次灌胃；正常對(duì)照組和糖尿病對(duì)照組予以等量生理鹽水灌胃。18周后行暗適應(yīng)ERG檢查。

1.3暗適應(yīng)ERG檢查3組小鼠使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后放于暗室過(guò)夜，第2天予以氯胺酮(10 mg·kg-1)和賽拉嗪(60 mg·kg-1)混合液麻醉。然后將小鼠置于加熱溫板上，參比電極和接地電極插入腭部和尾巴，鉑制角膜電極置于雙眼角膜上并予以重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子眼用凝膠潤(rùn)滑，以上操作均在暗室弱紅光燈照明下完成。ERG儀設(shè)置光照強(qiáng)度0.0004 cd·s-1·m-2、 0.04 cd·s-1·m-2、 4 cd·s-1·m-2、 400 cd·s-1·m-2和 2000 cd·s-1·m-2分別記錄暗視ERG結(jié)果。

1.4視網(wǎng)膜組織含糖量檢測(cè)3組小鼠完成ERG檢查后頸椎脫臼法處死，摘除左眼球(右眼球另有他用)后取視網(wǎng)膜組織并加入50 μL去離子水，加熱至70～75 ℃共15 min，然后超聲裂解30 s，離心20 min后取上清液35 μL加入165 μL葡萄糖含量測(cè)定試劑里，并設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白對(duì)照，應(yīng)用光譜分析儀測(cè)定標(biāo)本的吸光度，然后應(yīng)用SPECTRO STAR NANO MARS軟件計(jì)算葡萄糖濃度。而后再取10 μL上清液加入190 μL蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑中，同樣設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白對(duì)照，應(yīng)用光譜分析儀測(cè)定標(biāo)本的吸光度，然后應(yīng)用SPECTRO STAR NANO MARS軟件計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。視網(wǎng)膜葡萄糖含量以nmol glucose/mg protein表示，其計(jì)算公式為：視網(wǎng)膜組織含糖量=G·GV/(GMW·P·PV)，其中G:葡萄糖濃度(ng·mL-1)、GV：葡萄糖含量測(cè)定反應(yīng)液容積(mL)、P:蛋白質(zhì)濃度(mg·mL-1)、PV：蛋白質(zhì)含量測(cè)定反應(yīng)液容積(mL)、GMW：葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量(180.2)。

1.5視網(wǎng)膜外核層厚度測(cè)量在1.4步驟中摘除小鼠的右眼球后直接放入40 g·L-1多聚甲醛中固定1 h，而后剪除角膜和晶狀體后再次放入40 g·L-1多聚甲醛中固定15 min，PBS清洗后酒精梯度脫水，而后放入二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中透明，浸蠟后包埋，切片(厚5 μm)后烤干。將制備完成的石蠟切片置入二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中脫蠟，無(wú)水酒精漂洗，而后置入梯度酒精，放入蘇木精中染色10～30 min，水洗后放入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇中褪色，再漂洗，放入梯度酒精脫水，再放入體積分?jǐn)?shù)0.5%伊紅乙醇液復(fù)染，再脫水，置入二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中透明，封片。于顯微鏡下觀察切片并應(yīng)用ImagePro軟件分別測(cè)量距離視盤上下方0.48 mm、0.96 mm、1.44 mm、1.92 mm處的視網(wǎng)膜外核層厚度。

2 結(jié)果

2.13組小鼠視網(wǎng)膜組織的含糖量比較18周后正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜含糖量為(39.43±2.17)nmol glucose/mg protein，糖尿病對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜含糖量高達(dá)(142.25±6.92)nmol glucose/mg protein，根皮素治療組小鼠的視網(wǎng)膜含糖量為(97.82±4.12)nmol glucose/mg protein，兩組糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜含糖量均高于正常對(duì)照組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，但根皮素治療組小鼠視網(wǎng)膜含糖量低于糖尿病對(duì)照組，差異也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.23組小鼠的暗適應(yīng)ERG比較糖尿病對(duì)照組和根皮素治療組的小鼠暗適應(yīng)ERG的a波及b波振幅均較正常對(duì)照組低，且差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，但根皮素治療組小鼠的暗適應(yīng)ERG a波及b波振幅較糖尿病對(duì)照組高，差異也均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01，見(jiàn)圖1、表1)。

Figure 1 Scotopic ERG of three groups.A:Normal control group;B:Diabetic control group;C:Phloretin treatment group 三組小鼠的暗適應(yīng)ERG表現(xiàn)。A：正常對(duì)照組；B：糖尿病對(duì)照組；C：根皮素治療組

表1 3組小鼠的暗適應(yīng)ERG振幅

2.33組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度比較成模18周后根皮素治療組和糖尿病對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度較正常對(duì)照組下降(6.28～16.05)%和(20.41～35.38)%，然而根皮素治療組的視網(wǎng)膜外核層厚度較糖尿病對(duì)照組小鼠厚(6.61～29.92)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

Figure 2 Outer nuclear layer thickness of three groups(HE，×400).A:Normal control group;B:Diabetic control group;C:Phloretin treatment group 3組小鼠的視網(wǎng)膜外核層厚度(HE染色，×400)。A：正常對(duì)照組；B：糖尿病對(duì)照組；C：根皮素治療組

3 討論

DR是糖尿病最常見(jiàn)和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但美國(guó)糖尿病多中心試驗(yàn)研究DCCT揭示長(zhǎng)時(shí)期高血糖是發(fā)生DR的決定性因素?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜高糖環(huán)境下產(chǎn)生的過(guò)量氧化應(yīng)激、蛋白激酶C的激活、糖基化終末產(chǎn)物的合成等啟動(dòng)了視網(wǎng)膜組織細(xì)胞包括光感受器等神經(jīng)細(xì)胞的損傷[5-6]。視桿細(xì)胞是光感受器的重要組成部分，它對(duì)光的敏感度較高，負(fù)責(zé)人們?cè)谌豕庀碌囊曈X(jué)即暗視覺(jué)，視桿細(xì)胞損傷將導(dǎo)致夜盲癥等而直接影響患者生活質(zhì)量[7]，因此探索在糖尿病條件下對(duì)視桿細(xì)胞的保護(hù)以盡可能保全患者視功能意義重大。

既然糖尿病條件下視桿細(xì)胞所處的高糖微環(huán)境對(duì)其有損傷效應(yīng)，那么控制視網(wǎng)膜組織含糖量可能是解決此問(wèn)題的一把鑰匙。視網(wǎng)膜中葡萄糖由血液轉(zhuǎn)運(yùn)而來(lái)，但葡萄糖由于其水溶性而無(wú)法通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，視網(wǎng)膜組織細(xì)胞攝取葡萄糖需依靠一類轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體蛋白即GLUT1[8]，在視網(wǎng)膜中GLUT-1除分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、光感受器細(xì)胞、Müller細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞等外，大部分存在于血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞和外屏障的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，GLUT1是葡萄糖通過(guò)血-視網(wǎng)膜屏障的唯一載體[9]。而根皮素可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制GLUT1對(duì)葡萄糖的運(yùn)輸從而減少視網(wǎng)膜含糖量。本研究結(jié)果顯示：建立糖尿病模型后18周，根皮素治療組小鼠視網(wǎng)膜含糖量低于糖尿病對(duì)照組(P<0.01)，證明根皮素可以有效限制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入視網(wǎng)膜。

暗適應(yīng)ERG是閃光ERG檢測(cè)內(nèi)容的一部分，它是在暗適應(yīng)條件下給予弱光刺激時(shí)視桿細(xì)胞產(chǎn)生的電位，可在角膜表面無(wú)創(chuàng)記錄[10]。常用暗適應(yīng)ERG反映視桿細(xì)胞的功能狀態(tài)，研究已發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠在早期即出現(xiàn)暗適應(yīng)ERG異常[11]。同樣國(guó)內(nèi)也有報(bào)道應(yīng)用閃光ERG檢查發(fā)現(xiàn)非增殖期DR患者在未出現(xiàn)眼底新生血管等微血管病變時(shí)已出現(xiàn)視網(wǎng)膜光感受器功能障礙，其中視桿細(xì)胞功能尤為明顯[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病對(duì)照組和根皮素治療組小鼠暗適應(yīng)ERG的a波及b波波幅均比正常對(duì)照組小鼠低，與前述研究一致，但根皮素治療組比糖尿病對(duì)照組暗適應(yīng)ERG的a波及b波高。提示我們應(yīng)用根皮素后糖尿病小鼠視桿細(xì)胞的功能損害相對(duì)較輕，其原因可能是視網(wǎng)膜的相對(duì)低糖環(huán)境對(duì)視桿細(xì)胞產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用。

視網(wǎng)膜外核層厚度主要反映視桿細(xì)胞的數(shù)量變化，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病大鼠建模后其外核層厚度隨著病程的延長(zhǎng)而逐漸降低[13]，視桿細(xì)胞的退行性變及死亡是糖尿病患者在未出現(xiàn)DR之前視功能異常的主要原因，也是DR的重要病理改變[14]。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)18周后兩組糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜外核層厚度均小于正常對(duì)照組，提示我們本研究中糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞在不斷死亡，但根皮素治療組各測(cè)量點(diǎn)的視網(wǎng)膜外核層厚度均較糖尿病對(duì)照組小鼠高，提示我們糖尿病小鼠在應(yīng)用根皮素后視桿細(xì)胞死亡數(shù)量相對(duì)較少，其原因同樣是低糖環(huán)境對(duì)視桿細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，應(yīng)用GLUT1抑制劑根皮素后，糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜含糖量下降，從而形成了一個(gè)視網(wǎng)膜相對(duì)低糖環(huán)境。在此環(huán)境下，視桿細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)病變均較普通糖尿病小鼠有所緩解。這提示我們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制GLUT1從而限制視網(wǎng)膜局部含糖量有可能成為未來(lái)防治DR的一個(gè)新方向。

1 Zhang X,Saaddine JB,Chou CF,Cotch MF,Cheng YJ,Geiss LS,etal.Prevalence of diabetic retinopathy in the United States,2005-2008[J].JAMA,2010,304(6):649-656.

2 李筱榮，主編.糖尿病眼病[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010：181-212.

3 Ibu JO,Short AH.The inhibitory effect of phlorhizin and phloretin on hexose transport in the liver[J].ScandJGastroenterolSuppl,1986,21(s124):75-81.

4 Fernandes R,Hosoya K,Pereira P.Reactive oxygen species dow-nregulate glucose transport system in retinal endothelial cells[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2011,300(4):C927-936.

5 Geraldes P,Hiraoka-Yamamoto J,Matsumoto M,Clermont A,Leitges M,Marette A,etal.Activation of PKC-delta and SHP-1 by hyperglycemia causes vascular cell apoptosis and diabetic retinopathy[J].NatMed,2009,15(11):1298-1306.

6 蘭文，陸燕，王春紅，胡欽瑞，黃振平.糖尿病視網(wǎng)膜病變炎癥的研究新進(jìn)展[J].眼科新進(jìn)展,2013,33(2):197-200.

7 Punzo C,Xiong W,Cepko CL.Loss of daylight vision in retinal degeneration:are oxidative stress and metabolic dysregulation to blame[J]?JBiolChem,2012,287(3):1642-1648.

8 Gospe SM 3rd,Baker SA,Arshavsky VY.Facilitative glucose transporter Glut1 is actively excluded from rod outer segments[J].JCellSci,2010,123(21):3639-3644.

9 Thorens B,Mueckler M.Glucose transporters in the 21st Century[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab,2010,298(2):141-145.

10 黎曉新，趙家良.視網(wǎng)膜[M].天津:天津科技翻譯出版公司,2011：180-203.

11 李琴，謝婷玉，陳雪藝，王清，郭喬茜，具爾提·哈第爾.臭氧灌腸改善糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜電圖表現(xiàn)[J].眼科新進(jìn)展，2014，34(1):34-36.

12 方晏紅.非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜電圖特征研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2012.

13 Lai AK,Lo AC.Animal models of diabetic retinopathy:summary and comparison[J].JDiabetesRes,2013,2013:106594.

14 Verma A,Rani PK,Raman R.Is neuronal dysfunction an early sign of diabetic retinopathy? Microperimetry and spectral domain optical coherence tomography(SD-OCT) study in individuals with diabetes,but no diabetic retinopathy[J].Eye(Lond),2009,23(9):1824-1830.