張立光，李 揚(yáng)

（1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2.江蘇省昆山市虹橋醫(yī)院，江蘇 昆山 215300）

GC法測(cè)定鹽酸乙胺丁醇原料中殘留溶劑的含量

張立光1，李 揚(yáng)2

（1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2.江蘇省昆山市虹橋醫(yī)院，江蘇 昆山 215300）

目的 建立測(cè)定鹽酸乙胺丁醇原料中殘留溶劑含量的方法。方法 氣相色譜法與頂空進(jìn)樣法。色譜柱為 DB-624毛細(xì)管柱，柱溫為50℃，進(jìn)樣口溫度為150℃；檢測(cè)器為FID，溫度為200℃；載氣為氮?dú)猓魉贋?2 KP；進(jìn)樣量100 μL。結(jié)果 結(jié)果表現(xiàn)出了良好的線(xiàn)性關(guān)系，甲醇、異丙醇、1，2-二氯乙烷、環(huán)己烷檢測(cè)濃度線(xiàn)性范圍分別為2.5～20 mg·L-1（r＝0.998 5）、250～1 000 mg·L-1（r＝0.998 1）、0.25～2 mg·L-1（r＝0.995 3）、2.5～20 mg·L-1（r＝0.996 2），平均回收率分別為101.54%、103.66%、103.07%、99.17%，RSD分別為2.1%、1.8%、4.4%、3.8%，最低檢測(cè)限分別為0.5、25、0.05、0.5 mg· L-1。結(jié)論 建立的方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于鹽酸乙胺丁醇原料的殘留溶劑含量的測(cè)定。

氣相色譜法；鹽酸乙胺丁醇；殘留溶劑；頂空進(jìn)樣

The method is simple，sensitive and accurate，which is suitable for content determination of residual solvents in ethambutol hydrochloride.Key words：GC；ethambutol hydrochloride；residual solvents；headspace sample injection

結(jié)核病是一種古老的慢性傳染病，它在全世界廣泛流行，奪去了數(shù)億人的生命。自 20世紀(jì)50年代以來(lái)，由于不斷發(fā)現(xiàn)有效的抗結(jié)核藥物，使結(jié)核病流行得到了一定的控制。鹽酸乙胺丁醇是 R G Wikinson于 1962年在研究1，2-亞乙胺衍生物時(shí)發(fā)現(xiàn)的抗結(jié)核藥物，現(xiàn)已成為一線(xiàn)四大抗結(jié)核藥之一［1-3］。該藥可滲入分枝桿菌體內(nèi)干擾 RNA的合成，從而抑制細(xì)菌的繁殖，只對(duì)生長(zhǎng)繁殖期的分枝桿菌有效，對(duì)結(jié)核桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)其他細(xì)菌作用不明顯，而且與其它抗結(jié)核藥無(wú)交叉耐藥性，長(zhǎng)期服用可緩慢產(chǎn)生耐藥性，廣泛應(yīng)用于治療各型肺結(jié)核及肺外結(jié)核，其用量占市場(chǎng)份額的13%以上。該藥單獨(dú)使用時(shí)細(xì)菌可迅速產(chǎn)生耐藥性，因此必須與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合應(yīng)用，用于曾接受抗結(jié)核藥的患者時(shí)，應(yīng)至少與一種以上藥物合用，臨床可用于對(duì)鏈霉素或異煙肼產(chǎn)生耐藥的患者，其與利福平或異煙肼聯(lián)用可增強(qiáng)療效并延緩耐藥性的產(chǎn)生。該藥的合成過(guò)程中一般都使用甲醇、異丙醇、1，2-二氯乙烷與環(huán)己烷。藥物中的殘留溶劑系指在原料藥或輔料的生產(chǎn)中，以及在制劑制備過(guò)程中使用或產(chǎn)生而又未能完全去除的有機(jī)溶劑。藥品殘留溶劑分析是當(dāng)今藥物分析的熱點(diǎn)之一，已經(jīng)成為藥品質(zhì)量控制的重要組成部分，是藥品檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。根據(jù)國(guó)際化學(xué)品安全性綱要以及美國(guó)環(huán)境保護(hù)機(jī)構(gòu)、世界衛(wèi)生組織等公布的研究結(jié)果，很多有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境、人體都有一定的危害，因此，為保障藥物的質(zhì)量和用藥安全，以及保護(hù)環(huán)境，需要對(duì)殘留溶劑進(jìn)行研究和控制。中國(guó)藥典2010年版附錄［4］中《殘留溶劑測(cè)定法》和美國(guó)藥典［5］中均規(guī)定了溶劑的類(lèi)別和限度，各國(guó)藥典收載的殘留溶劑種類(lèi)和限度是一致的，目前均遵守人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）指導(dǎo)原則。ICH根據(jù)危害程度對(duì)殘留溶劑進(jìn)行了系統(tǒng)分類(lèi)，依據(jù)毒性的不同，將 69種殘留溶劑分成了四類(lèi)。第一類(lèi)溶劑為人體致癌物、疑為人體致癌物或環(huán)境危害物，第二類(lèi)溶劑為有非遺傳致癌毒性或其他不可逆毒性、或其他嚴(yán)重的可逆毒性，第三類(lèi)溶劑為對(duì)人體低毒，第四類(lèi)溶劑為尚無(wú)足夠毒理學(xué)資料的溶劑。查閱文獻(xiàn)大都是鹽酸乙胺丁醇含量測(cè)定的方法［6-11］，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有對(duì)鹽酸乙胺丁醇?xì)埩羧軇┑膱?bào)道，世界各國(guó)藥典均首選氣相色譜法測(cè)定有機(jī)殘留溶劑，但是具體在測(cè)定方法、色譜條件、供試品和對(duì)照品的制備、系統(tǒng)適用性方面有差別，參考ICH和《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定以及所查的相關(guān)文獻(xiàn)［12-18］，筆者建立了氣相色譜法（GC）測(cè)定鹽酸乙胺丁醇原料中的四種有機(jī)溶劑的殘留量。

1 儀器與試藥

GC-14C氣相色譜儀（島津公司）、氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）（島津公司）、ClarityShimadzu色譜工作站（島津公司）、DK-3001A頂空進(jìn)樣器（北京中興分析儀器有限公司）；BP121S分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ-100DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸乙胺丁醇原料（印度卡迪拉制藥有限公司，批號(hào)：201205056、201205057、201205058）；1，2-二氯乙烷（天津市化學(xué)試劑廠(chǎng) 色譜純）；異丙醇（天津百世化工有限公司 色譜純）；甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司 色譜純）；環(huán)己烷（天津市博迪化工有限公司 色譜純）；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)定甲醇 0.1 g異丙醇10 g、1，2-二氯乙烷0.01 g、環(huán)己烷0.1 g，用水溶解并定容至 100 mL，分別取溶液 1 mL定容至 100 mL，超聲5 min，冷卻至室溫。量取上述溶液5 mL，置頂空瓶中，密封，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取供試品1.0 g，精密稱(chēng)定，置頂空瓶中，精密加入水5 mL，密封，搖勻，作為供試品溶液。

2.2 殘留溶劑測(cè)定方法學(xué)的驗(yàn)證

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱為 DB-624毛細(xì)管柱，柱溫為50℃，進(jìn)樣口溫度：150℃；檢測(cè)器為 FID，溫度為 200℃；載氣為氮?dú)?，流速?32 KP；進(jìn)樣方式為頂空進(jìn)樣，取2.1.1項(xiàng)下溶液70℃平衡30 min，進(jìn)樣100 μL。保留時(shí)間為1.16 min的色譜峰為甲醇峰，保留時(shí)間為1.72 min的色譜峰為異丙醇峰，保留時(shí)間為3.44 min的色譜峰為1，2-二氯乙烷峰，保留時(shí)間為3.56 min的色譜峰為環(huán)己烷峰。由色譜圖看出，甲醇、異丙醇、1，2-二氯乙烷，環(huán)己烷得到良好的分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000。

2.2.2 專(zhuān)屬性 取空白溶劑水5 mL，量取2.1.1，2.1.2項(xiàng)下溶液于70℃加熱30 min，分別進(jìn)樣100 μL。由色譜圖（圖1）可以看出，溶劑水不干擾測(cè)定，方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 氣相色譜圖

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍 精密稱(chēng)定甲醇 0.1 g、異丙醇10 g、1，2-二氯乙烷0.01 g、環(huán)己烷 0.1 g，用水溶解并定容至1 000 mL，超聲5 min，冷卻至室溫，做為貯備液。分別量取上述溶液 2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，取5 mL置頂空瓶中，70℃加熱30 min，進(jìn)樣100 μL。記錄峰面積。以峰面積 A對(duì)濃度 C （mg·L-1）作圖并進(jìn)行線(xiàn)性回歸。線(xiàn)性回歸方程、線(xiàn)性范圍及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果表明在各加入量范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 各溶劑的回歸方程、線(xiàn)性范圍及相關(guān)系數(shù)（n＝5）

2.2.4 日內(nèi)精密度試驗(yàn) 取 2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，70℃加熱30 min，測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。甲醇、異丙醇、1，2-二氯乙烷、環(huán)己烷的6次測(cè)定的峰面積的RSD分別為2.1%、1.8%、4.4%、3.8%。

2.2.5 日間精密度試驗(yàn) 連續(xù) 6 d配制對(duì)照品溶液，70℃加熱 30 min，測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的 RSD。甲醇、異丙醇、1，2-二氯乙烷、環(huán)己烷的6 d連續(xù)測(cè)定的峰面積的 RSD分別為 3.1%、4.8%、4.9%、4.8%。

2.2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液5份各5 mL，分別于 0、1、2、4、8 h 70℃加熱 30 min，測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的 RSD。結(jié)果表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 檢測(cè)限試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋得到系列濃度的溶液，按上述色譜條件和方法進(jìn)樣分析。當(dāng)信噪比為 3∶1，確定為檢測(cè)限。甲醇、異丙醇、1，2-二氯乙烷、環(huán)己烷的檢測(cè)限分別為 0.5、25、0.05、0.5 mg·L-1。

2.2.8 定量限試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋得到系列濃度的溶液，按上述色譜條件和方法進(jìn)樣分析。當(dāng)信噪比為10∶1，確定為定量限。甲醇、異丙醇、1，2-二氯乙烷、環(huán)己烷的檢測(cè)限分別為2.0，100，0.2，2.0 mg·L-1。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品（批號(hào)：201205056）1.0 g，分別加入相當(dāng)于對(duì)照品溶液濃度80%，100%，120%的對(duì)照品溶液 b（每個(gè)質(zhì)量濃度3份）5 mL，依法測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3次，根據(jù)峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 殘留溶劑的含量測(cè)定結(jié)果 根據(jù)中國(guó)藥典的規(guī)定并參考 ICH的規(guī)定，確定鹽酸乙胺丁醇原料中甲醇的限度為0.005%，為第二類(lèi)溶劑，異丙醇的限度為0.5%，為第三類(lèi)溶劑，1，2-二氯甲烷的限度為0.000 5%，為第一類(lèi)溶劑，環(huán)己烷的限度為0.05%，為第二類(lèi)溶劑。按照上述經(jīng)驗(yàn)證的方法考察了3批鹽酸乙胺丁醇原料的殘留溶劑，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

GC法具有檢測(cè)靈敏度高，選擇性好的特點(diǎn)，采用此法需要的樣品用量較少，基本可以滿(mǎn)足所有殘留溶劑測(cè)定的要求。GC法包括溶液直接進(jìn)樣和頂空進(jìn)樣兩種進(jìn)樣方法。頂空色譜進(jìn)樣器可與國(guó)內(nèi)外各種氣相色譜儀相連接，它是將液體或固體樣品中的揮發(fā)性組分直接導(dǎo)入氣相色譜儀進(jìn)行分離和檢測(cè)的理想進(jìn)樣裝置，使用頂空技術(shù)，可以免除冗長(zhǎng)煩瑣的樣品前處理過(guò)程，避免有機(jī)溶劑帶入的雜質(zhì)對(duì)分析造成干擾，減少對(duì)色譜柱及進(jìn)樣口的污染。

頂空進(jìn)樣技術(shù)對(duì)溶液中的殘留溶劑有富集作用，提高了對(duì)痕量有機(jī)溶劑的檢測(cè)能力。美國(guó)藥典對(duì)殘留溶劑檢測(cè)分為第一、二類(lèi)殘留溶劑和第三類(lèi)殘留溶劑 2種方法，其中第一、二類(lèi)殘留溶劑采用頂空進(jìn)樣技術(shù)，可以分為水溶性和水不溶性物質(zhì)兩種檢測(cè)方法。

表3 鹽酸乙胺丁醇原料中的殘留溶劑含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

GC法常用檢測(cè)器有熱導(dǎo)檢測(cè)器、氫焰離子化檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器和火焰光度檢測(cè)器?；鹧婀舛葯z測(cè)器主要檢測(cè)含磷或含硫化合物，電子捕獲檢測(cè)器主要是目前分析痕量電負(fù)性有機(jī)化合物最有效的檢測(cè)器。熱導(dǎo)檢測(cè)器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，測(cè)定范圍廣，熱穩(wěn)定性好，線(xiàn)性范圍寬，樣品不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)，是一種通用型檢測(cè)器，但靈敏度較低是其缺點(diǎn)。在用熱導(dǎo)檢測(cè)器時(shí)，選氫氣為載氣，可獲得較高的檢測(cè)靈敏度，但是不安全，氦氣較理想，但是價(jià)格較貴。氫焰離子化檢測(cè)器具有靈敏度高、響應(yīng)快，線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的檢測(cè)器之一，一般用于測(cè)定含碳有機(jī)物。因此，在本實(shí)驗(yàn)中采用氫焰離子化檢測(cè)器。

頂空時(shí)間要確保供試品溶液的氣—液達(dá)到平衡，頂空時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般為 30～45 min。如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能引起頂空瓶的氣密性變差，導(dǎo)致定量的準(zhǔn)確性降低，如果時(shí)間不夠，那么就不能保證氣—液兩相達(dá)到平衡。對(duì)照品溶液與供試品溶液必須使用相同的頂空條件。筆者前期試驗(yàn)中取對(duì)照溶液3份，分別在60、70、80℃下加熱平衡30 min后進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，平衡溫度在 70℃重復(fù)性較好。另取混合對(duì)照溶液 3份，分別在 70℃加熱20、30、40 min后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果在平衡30 min時(shí)測(cè)得4種溶劑的峰面積重復(fù)性較好。故選擇加熱溫度70℃，平衡時(shí)間30 min。

氣相色譜柱的分離效果主要取決于其固定相，柱長(zhǎng)度，柱內(nèi)徑，液膜厚度這幾個(gè)因素，柱徑直接影響柱子的效率、保留特性和樣品容量。小口徑柱比大口徑柱有更高柱效，但柱容量更小。液膜厚度影響柱子的保留特性和柱容量。厚度增加，保留也增加。不同的固定相對(duì)不同的分析物的影響不同，根據(jù)相似相溶原理，性質(zhì)越相近，固定相對(duì)其的流動(dòng)阻力越大，其保留時(shí)間越長(zhǎng).筆者前期試驗(yàn)中曾選用不同極性的毛細(xì)管色譜柱，如聚乙二醇 20000、HP-FFAP（鍵合和改性的交聯(lián)聚乙二醇）和 DB-624色譜柱，經(jīng)多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)前二者的分離效果都不如 DB-624色譜柱，最后選擇了 DB-624色譜柱。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，鹽酸乙胺丁醇原料中 4種有機(jī)溶劑的量均符合相關(guān)規(guī)定，各峰間達(dá)到良好的分離。本方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，能達(dá)到殘留溶劑的檢測(cè)要求，可用于鹽酸乙胺丁醇原料中殘留溶劑的檢測(cè)。

因?yàn)槟骋痪唧w品種各生產(chǎn)企業(yè)引入的溶劑亦有不同而難以統(tǒng)一規(guī)定，殘留溶劑檢查統(tǒng)一在凡例中進(jìn)行要求，即凡在原料和制劑生產(chǎn)中引入有機(jī)溶劑而需要去除者，均應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2010年版附錄（ⅧP）項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定。而美國(guó)藥典有機(jī)殘留溶劑的檢查項(xiàng)下，使用一、二、三類(lèi)有機(jī)溶劑的混合對(duì)照品，可以科學(xué)的測(cè)出樣品中的未知有機(jī)溶劑，這就提示我們?nèi)绻谒幤返臍埩羧軇┑难芯繖z測(cè)中無(wú)法確定整個(gè)生產(chǎn)中都使用了哪些溶劑，我們可以參考美國(guó)藥典，對(duì)殘留溶劑進(jìn)行預(yù)測(cè)，在方法開(kāi)發(fā)時(shí)我們也可以借鑒。

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Determination of residual solvents in material drug of ethambutol hydrochloride by gas chromatography

ZHANG Li-guang1，LI Yang2
（1.Suzhou Health College，Suzhou，Jiangsu 215009，China；2.Hongqiao Hospital，Kunshan，Jiangsu 215300，China）

Objective To establish a GC method for the determination of residual solvents in material drug of ethambutol hydrochloride.Methods GC and headspace sample injection method were adopted.The determination was performed with a DB-624 capillary column （column temperature was 50℃）using nitrogen gas as carrier gas at the flow rate of 32 KP and FID as detector.The injector temperature and detector temperature were controlled at 150℃ and 200℃，respectively.The sample volume was 100 μL.Results The results showed excellent linearity.The linear ranges of residual solvents of methanol，isopropanol，1，2-dichoroethane and cyclohexane were 2.5～20 mg·L-1（r＝0.998 5），250～1 000 mg·L-1（r＝0.998 1），0.25～2 mg·L-1（r＝0.995 3），2.5～20 mg·L-1（r＝0.996 2），respectively.And their recoveries were 101.54%，103.66%，103.07%and 99.17%，respectively.RSDs were 2.1%，1.8%，4.4%and 3.8%，respectively.The minimum detection limits were 0.5，25，0.05 and 0.5 mg·L-1，respectively.Conclusions

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.013

2013-10-28，

2014-01-06）