劉和風，徐 華，王駿飛，陳東陽，蔣 青

（1.安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院骨二科，安徽 巢湖 238000；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院關節(jié)外科，江蘇 南京 210008）

蠶絲人工肌腱止點轉歸的觀察

劉和風1，徐 華2，王駿飛2，陳東陽2，蔣 青2

（1.安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院骨二科，安徽 巢湖 238000；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院關節(jié)外科，江蘇 南京 210008）

目的 通過動物實驗分析蠶絲人工肌腱止點的生物學過程，評價腱骨愈合與腱腱愈合的生物學轉歸，進一步研究蠶絲材料在骨科中應用的可行性。方法 在兔脛骨中上1／3處鉆孔，實驗側用脫膠的蠶絲，一端穿過骨道固定，另一端與趾長屈肌腱在輕微張力下編織縫合；對照側以趾長屈肌腱內側1／3的近斷端穿過骨道固定。分別于術后6、12、24周獲取標本，行 HE、甲苯胺藍及Ⅰ型和Ⅲ型膠原免疫組化染色，觀察蠶絲人工肌腱止點的組織學轉歸，與對照側相比，評價蠶絲人工肌腱與骨及腱愈合的生物學轉歸。結果 蠶絲人工肌腱與骨隧道逐漸形成膠原連接，隨著時間延長，愈合越明顯，以膜內成骨及軟骨內成骨的方式向正常肌腱止點轉歸的趨勢；亦發(fā)現Ⅰ型膠原染色隨時間延長從少到多，Ⅲ型膠原染色從多到少，具有與對照側自體肌腱移植相似的改變，但速度較慢。結論 蠶絲人工肌腱可以形成腱骨及腱腱愈合，日后加以改進，有望成為一種新的骨科組織工程人工材料，具有良好的發(fā)展前景。

蠶絲；肌腱；組織工程；止點

文獻大量報道了組織工程肌腱、韌帶的實驗研究，但應用于臨床的報道甚少。眾多學者通過組織工程學方法來研究人工肌腱，探究如何解決臨床所面臨的肌腱重建問題。研究［1-2］表明：絲素（脫膠的蠶絲）具有良好的機械性能和良好生物相容性，在生物醫(yī)學領域獲得了廣泛應用和研究，研究結果表明修飾含精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸三種氨基酸（RGD）的聚合物后蠶絲能促進細胞吸附、增生、分化及促進腱骨愈合的能力。通過我們先前建立蠶絲人工腱止點轉歸動物模型的方法［3］獲取標本進行研究，初步探討其腱骨愈合及腱腱愈合的生物學轉歸，探討蠶絲人工肌腱在骨科組織工程方面的應用前景。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Ⅰ型膠原抗體（Sigma公司），Ⅲ型膠原抗體（Calbiochem公司），鼠兩步法檢測試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.2 蠶絲制備 用桑蠶絲編織成人工肌腱，0.5%的碳酸鈉（Na2CO3）溶液，100℃，30 min，脫膠兩次，洗凈，干燥。術前預先將人工腱用含 0.4 g丁胺卡那的生理鹽水浸泡30 min，備用。

1.3 手術方法 動物模型的建立同我們先前的研究［3］。取新西蘭成年大白兔20只，體重2～3 kg，雌雄隨機。采取氟哌利多、氯胺酮肌注誘導麻醉后耳緣靜脈維持。術區(qū)備皮后嚴格消毒、鋪洞巾，以脛骨中上1／3為中心，作前側一約2 cm縱形切口，切開筋膜、骨膜，以直徑2.0 mm克氏針在脛骨中上1／3處鉆孔。隨機以一側后肢作實驗組，對側為對照組。實驗側取人工肌腱一端穿過骨道后回轉，在輕微張力下以 1號絲線固定于穿過骨道前的蠶絲上，模擬臨床人工腱與骨固定要求，另一端與趾長屈肌腱在輕微張力下編織縫合。對照側分離趾長屈肌腱內側1／3，在切口遠側切斷，近端穿過骨道亦回轉，在輕微張力下以1號絲線固定。分層縫合切口。術后當天及第1天，第 2天皆肌注丁胺卡那0.2 g，給予正?；顒?。術后按6、12、24周各處死大白兔6只并獲取標本。

1.4 觀察方法 獲取標本后，經過修剪并用等滲鹽水沖洗、固定24 h以上（10%中性甲醛）、沖洗、脫鈣（10%乙二氨四乙酸二鈉，EDTANa2）、脫水、包埋成蠟塊、切片、染色觀察（HE、甲苯胺藍及Ⅰ、Ⅲ型膠原染色）。

2 結果

2.1 對照側 術后 6周：肉眼觀察肌腱形態(tài)良好，有部分黏連，未發(fā)現骨道中的移植肌腱組織壞死。HE染色可見移植肌腱內有較多的排列紊亂的成纖維細胞分布，可見骨髓腔開放伴纖維化，在肌腱與骨道處新的骨髓腔逐漸形成。移植物內膠原分布的免疫組織化學染色結果顯示：移植肌腱內Ⅰ型膠原在成纖維細胞聚集處和移植物周邊分布顯著；Ⅲ型膠原的分布情況與Ⅰ型膠原分布結果類似。

術后12周：肉眼觀察可見肌腱在骨道處明顯的腱骨愈合征，移植肌腱在骨道處形成與正常腱骨止點結構相同的止點結構。染色示移植物中細胞和纖維分布依然紊亂，但出現散在膜內成骨。甲苯胺藍異染發(fā)現骨道出口處較多的軟骨內成骨（圖1）。免疫組織化學染色可見移植物內Ⅲ型膠原均勻分布，染色較淺。Ⅰ型膠原隨纖維排列分布。

圖1 對照側12周甲苯胺藍染色：×100，纖維軟骨（↖）呈異染性，其上方為肌腱及纖維組織，下方為骨組織，為纖維軟骨內成骨

術后 24周：可見細胞數量顯著減少，移植腱骨止點結構趨向正常并在隧道深部位的肌腱形成骨質（圖2），甲苯胺藍異染發(fā)現在新形成的骨髓腔之間仍有部分軟骨性組織尚未成為骨質。免疫組織化學染色可見Ⅰ型膠原染色深并均勻分布；Ⅲ型膠原染色淺，分布較不均勻（圖3）。

圖2 對照側 24周 HE染色：×100，骨道內腱骨愈合，為膜內成骨，骨化逐漸向肌腱側推進

2.2 實驗側 術后6周：在軟組織和骨道中的蠶絲呈嗜酸性，蠶絲中間部分未見細胞、其他細胞間質及血管浸潤，蠶絲周邊部分可見肉芽組織、大量成纖維細胞、新生毛細血管、少量巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，未見嗜酸性粒細胞。免疫組織化學染色結果顯示：Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的分布同肉芽組織，在成纖維細胞聚集處分布很明顯（圖4）。

圖3 對照側 24周Ⅲ型膠原免疫組化染色：×100，骨道內膜內成骨

圖4 實驗側6周 I型膠原免疫組化染色：×200，蠶絲被 I型膠原和成纖維細胞包埋，左側蠶絲明顯變細（↖），表明部分已被降解

術后12周：在軟組織和骨道中的蠶絲中間部分呈嗜酸性，未見細胞、細胞間質及血管浸潤；而蠶絲周邊部分呈嗜堿性，肉芽組織纖維化明顯，蠶絲通過纖維組織形成腱骨及腱腱愈合趨勢，但細胞減少，主要為成纖維細胞、巨噬細胞和淋巴細胞，部分區(qū)域纖維軟骨化或骨化。甲苯胺藍染色可見骨道出口處部分包埋蠶絲的纖維組織開始軟骨化。免疫組化可見Ⅰ型膠原包繞周邊部分的蠶絲，并與骨質及肌腱中Ⅰ型膠原相延續(xù)，Ⅲ型膠原染色較淺（圖5），分布與Ⅰ型膠原一致。

術后 24周：在軟組織和骨道中蠶絲的中間部分呈嗜酸性，未見細胞、細胞間質及血管浸潤。骨道蠶絲周邊部分呈嗜堿性，未見炎性細胞浸潤，被纖維組織包埋，并逐漸軟骨化或骨化形成腱骨愈合趨勢（圖6，7）。在軟組織中蠶絲周邊部分被纖維組織包繞，亦呈嗜堿性，未見炎性細胞浸潤，亦無軟骨化、骨化跡象（圖8）。甲苯胺藍染色示在骨道出口處以軟骨化的方式形成腱骨愈合。免疫組織化學染色結果顯示在蠶絲周邊部分 I型膠原分布均勻，排列有序，并與周圍骨質或肌腱中 I型膠原相延續(xù)，染色較深；Ⅲ型膠原僅局部染色陽性，染色淺。

圖5 實驗側12周Ⅲ型膠原免疫組化染色：×100，蠶絲（↙）被Ⅲ型膠原和成纖維細胞包埋，形成較典型的止點：按蠶絲，纖維軟骨，軟骨鈣化，骨質排列

圖6 實驗側24周 HE染色：×100，蠶絲被骨質包埋，呈嗜堿性，為膜內成骨，右側蠶絲（←）已開始降解變細

圖7 實驗側24周 HE染色：×100，蠶絲（↙）與骨質形成較典型的止點：按蠶絲，纖維軟骨，軟骨鈣化，骨質排列

3 討論

自體肌腱存在著供體肌腱的解剖變異、新的創(chuàng)傷、原肌腱處功能受損、自體腱移植后可能有供體組織特異性存在等缺點［4］；同種異體肌腱移植也存在一些缺點：供體來源受限、排斥反應、潛在的傳染性疾病感染、移植后遠期效果不肯定。隨著醫(yī)學研究的深入，尤其是組織工程興起，人們逐漸聚焦于人工腱材料的研究。

圖8 實驗側24周 HE染色：×100，蠶絲（↘）與肌腱間通過纖維連接

至今國內外大量文獻報道了關于蠶絲的研究結果。研究表明：絲素（脫膠的蠶絲）具有良好的機械性能和良好生物相容性，絲素蛋白對細胞有良好的吸附作用，且能促進細胞增生、分化及腱骨愈合的能力［1-2，5］。把多股絲素纖維編織成帶，模擬前十字韌帶（ACL）的力學特性，在體外加骨髓基質細胞（MSCs）培養(yǎng)發(fā)現，蠶絲不僅保持原有的良好機械性能和生物相容性，低降解率，而且促進 MSCs在基質上黏附，分化，增殖，并分泌基質（Ⅰ、Ⅲ型膠原和C型粘蛋白）［6］。本實驗證實蠶絲人工腱植入后無明顯炎細胞浸潤，生物相容性好；可以逐漸被自體肌腱組織代替，并能形成腱骨及腱腱愈合。人工腱中間部分蠶絲仍呈嗜酸性，無明顯細胞、血管浸潤，與蠶絲編織太緊，無孔隙有關，有待改進。

蠶絲可以作為骨組織形成的支架，Meinel等［7-8］應用蠶絲作為人工材料，以人間充質干細胞為種子細胞，骨形成蛋白（BMP-2）誘導細胞分化，體外構建組織工程骨組織并進行動物試驗，獲得成功。其后，他們又應用腺病毒轉染人間充質干細胞，使其表達BMP-2，并構建人工骨組織也取得了較好的成果［9］。本研究發(fā)現蠶絲人工腱與骨隧道逐漸形成纖維連接，隨著時間的延長，腱骨愈合越明顯，并通過膜內成骨及軟骨內成骨的方式向正常肌腱止點轉歸的趨勢。本實驗亦發(fā)現在腱骨愈合過程中，骨道中主要為膜內成骨，骨道出口處主要為纖維軟骨成骨。王健等［10］研究發(fā)現：在后交叉韌帶重建中，移植物中Ⅰ型膠原含量隨時間的推移逐漸升高，移植物中Ⅲ型膠原表現為初期表達濃度低，中期表達濃度高且均勻，后期在局部呈表達濃度亦低。Ⅰ型膠原染色隨時間延長從少到多，Ⅲ型膠原染色從多到少，具有與對照側自體肌腱移植相似的改變，但速度較慢。

本研究表明，蠶絲作為組織工程人工肌腱，有較好的腱骨及腱腱愈合，有形成正常肌腱止點的趨勢。日后對蠶絲加以改進，可以成為一種新的骨科組織工程人工材料，應用于人工肌腱、韌帶、半月板以及人工骨的研制。

在肌腱韌帶重建中，許多支架材料降解速度與新組織形成不匹配。體外實驗表明［11］：在生物機械性能方面蠶絲相似于生物肌腱，且絲素具有較低的降解速度和生物相容性良好，1年后其抗張強度大部分下降，2年后在體內的植入位點檢測中沒有發(fā)現異體識別。本實驗觀察時間有限，最長僅 24周，為不足之處；形成正常肌腱止點的速度較對照組慢，也是需要改進的地方。

隨著組織工程理論日益完善，技術不斷改進，相信今后對蠶絲進行合理改進，解決種子細胞來源問題，加入適當生長因子，并施以符合條件的組織構建，蠶絲人工腱修復肌腱缺損是一種指日可待的方法，蠶絲人工材料在骨科組織工程方面有著廣闊的前景。

［1］ Chen J，Altman GH，Karageorgiou V，et al.Human bone marrow stromal cell and ligament fibroblast responses on RGD-modified silk fibers［J］.J Biomed Mater Res A，2003，67（2）：559-570.

［2］ Kardestuncer T，Mc Carthy MB，Karageorgiou V，et al.RGD-tethered Silk Substrate Stimulates the Differentiation of Human Tendon Cells［J］.Clin Orthop Relat Res，2006，448：234-239.

［3］ 徐 華，蔣 青，王駿飛，等.蠶絲人工腱止點轉歸動物模型的建立［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2007，17（5）：285-287，291.

［4］ Kleiner JB，Amiel D，Roux RD，et al.Origin of replacement cells for the anterior cruciate ligament autograft［J］.J Orthop Res，1986，4（4）：466-474.

［5］ Cai K，Yao K，Lin S，et al.Poly（D，L-lactic acid）surfaces modified by silk fibroin：effects on the culture of osteoblast in vitro［J］.Biomaterials，2002，23（4）：1153-1160.

［6］ Altman GH，Horan RL，Lu HH，et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments［J］.Biomaterials，2002，23 （20）：4131-4141.

［7］ Meinel L，Betz O，Fajardo R，et al.Silk based biomaterials to heal critical sized femur defects［J］.Bone，2006，39（4）：922-931.

［8］ Meinel L，Fajardo R，Hofmann S，et al.Silk implants for the healing of critical size bone defects［J］.Bone，2005，37（5）：688-698.

［9］ Meinel L，Hofmann S，Betz O，et al.Osteogenesis by human mesenchymal stem cells cultured on silk biomaterials：Comparison of adenovirus mediated gene transfer and protein delivery of BMP-2［J］.Biomaterials，2006，27（28）：4993-5002.

［10］王 健，敖英芳.后十字韌帶重建后移植物組織學與膠原表型的變化［J］.中華骨科雜志，2006，26（1）：47-50.

［11］Altman GH，Diaz F，Jakuba C，et al.Silk-based biomaterials［J］.Biomaterials，2003，24（3）：401-416.

Outcome of silk artificial tendon insertion formation

LIU He-Feng1，XU Hua2，WANG Jun-fei2，et al
（1.Department of Orthopedic Surgery，Drum Tower Chaohu Hospital of Anhui Medical University，Chaohu，Anhui 238000，China；2.Nanjing Drum Tower Hospital The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing，Jiangsu 210008，China）

Objective To analyze the biological process of silk artificial tendon by animal experiment and to evaluate the biological outcomes of the healing of tendon to bone and tendon to tendon of silk artificial tendon insertion after implantation，so as to further investigate the feasibility of silk materials application in orthopedics.Methods New Zealand rabbit was treated by drilling in between the upper and middle third of tibia.At the experiment side，one extremity of silk fibers was fixed after threaded through the tibial tunnel，while the other extremity was taken and woven to the flexor digitorum longus muscle tendon；at the control side，the proximal end of one third of flexor digitorum longus muscle tendon was fixed after threaded through the tibial tunnel.The animal was sacrificed to get specimen in 6，12，24 weeks after operation.Standard HE stain，toluidine blue stain and immunohistochemical analysis of type I and III collagens monoclonal antibody were processed to observe histologically the outcome of silk artificial tendon insertion formation.The biological process of the healing of tendon to bone and tendon to tendon of silk artificial tendon insertion after implantation was also evaluated by comparison with the control side.Results The connection of artificial tendon to bone tunnel via collagens was more and more widespread with the gradual emergence of cartilaginous ossification and intramembranous ossification in fibrous tissue，along with time going on.There was a trend of normal tendon insertion formation.Immunohistochemistry result demonstrated that the staining of type I collagen in graft was low at first，then increased gradually；the staining of type III collagen was high at first，then decreased gradually.This change was similar to the control side which was tendon autograft，although slower.Conclusions Silk artificial tendon which has satisfactory consequence in the healing of tendon to bone and tendon to tendon may become a novel tissue engineered material in orthopedics and has good prospects if improved on in the future.

silk；tissue engineering；tendons；insertion

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.021

2013-11-27）

蔣 青，男，教授，博士生導師，研究方向：關節(jié)外科，E-mail：jiangqing112＠hotmail.com