劉淑云，張 平，林仁勇，張 爽，聶亞雄

（1.廣東省深圳市觀瀾人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518110；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421002；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

TNF-α預(yù)測(cè)高血壓大鼠發(fā)生腦卒中的實(shí)驗(yàn)研究

劉淑云1，張 平2，林仁勇1，張 爽1，聶亞雄3

（1.廣東省深圳市觀瀾人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518110；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421002；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

目的 觀察易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）在經(jīng)歷人工寒潮卒中前血漿 TNF-α含量差異，從而探討 TNF-α能否預(yù)測(cè)高血壓大鼠發(fā)生腦卒中。方法 雙腎雙夾法制作RHRSP模型，經(jīng)歷人工寒潮并于寒潮前取血，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血漿 TNF-α含量。結(jié)果 腦梗死組和腦出血組寒潮前 TNF-α含量明顯高于非卒中組，高血壓各組血壓與 TNF-α成正相關(guān)。結(jié)論 TNF-α有可能成為預(yù)測(cè)卒中的分子標(biāo)志物之一。

腦卒中；易卒中腎血管性高血壓大鼠；腫瘤壞死因子；人工寒潮

腦卒中已上升為我國(guó)第一位致死致殘性疾病。臨床上，腦卒中多發(fā)生于某些特定人群如高血壓、糖尿病患者，但這些具有高危因素的人群，也不是都發(fā)生卒中。高血壓是腦卒中最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，腦卒中發(fā)病率、死亡率與血壓升高有著十分密切的關(guān)系［1-2］。如果能在高血壓患者中篩查出易促發(fā)卒中的高危人群，并進(jìn)行及時(shí)、有效的干預(yù)，無(wú)疑是預(yù)防腦卒中發(fā)作的最佳途徑。

目前對(duì)高血壓患者發(fā)生卒中并無(wú)足夠的預(yù)警手段。本研究采用易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）模型，人工模擬自然寒潮誘導(dǎo)高血壓大鼠自發(fā)腦卒中，通過(guò)檢測(cè) RHRSP在經(jīng)歷寒潮后的卒中組與非卒中組寒潮前血清 TNF-α含量差異，初步探討人工寒潮對(duì) RHRSP發(fā)生卒中的影響及通過(guò)血清中TNF-α的表達(dá)差異來(lái)預(yù)測(cè)RHRSP發(fā)生卒中的情況。旨在為臨床上高血壓患者將來(lái)易發(fā)生相關(guān)性腦血管疾病篩選出有效、簡(jiǎn)便的預(yù)測(cè)指標(biāo)，為個(gè)體化防治提供“風(fēng)向標(biāo)”。

1 材料和方法

1.1 高血壓大鼠模型制備 健康雄性 SD大鼠230只（南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供），體重80～120 g，鼠齡 60～90 d。200只按既定的雙腎雙夾法［3］制成RHRSP模型，用“Ω”環(huán)形銀夾，銀絲直徑為0.5 mm，環(huán)的內(nèi)徑為0.3 mm。術(shù)后常規(guī)用慶大霉素8 000 U·kg-1腹腔內(nèi)注射預(yù)防感染，術(shù)后4～6 h恢復(fù)喂食，以顆粒型普通大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用自來(lái)水，動(dòng)物房溫度控制在20℃左右，光照周期12 h，模擬正常晝夜節(jié)律。用鼠尾測(cè)壓儀（HX-1型），37℃恒溫箱預(yù)熱15 min后，經(jīng)尾動(dòng)脈測(cè)定收縮壓，每只大鼠測(cè)3次，取平均值作為該大鼠的血壓值。腎動(dòng)脈狹窄術(shù)前測(cè)量1次，術(shù)后每周測(cè)量1次，選取術(shù)后12周高血壓形成穩(wěn)定的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組30只，造模方法同高血壓模型組，但不縮窄腎動(dòng)脈。

1.2 模擬人工寒潮 人工寒潮前按 Zealonga 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)學(xué)評(píng)分：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。人工寒潮前剔除 longa≥1的大鼠，將上述大鼠置于RXZ2300A型智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）中，調(diào)節(jié)相對(duì)濕度70%，溫度22℃12 h，4℃ 12 h為1 d循環(huán)，共3 d。每只大鼠寒潮前舌下靜脈取血約1 mL，離心10 min（3 000 r·min-1）分離血漿，分裝后 -80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TNF-α含量測(cè)定 采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定TNF-α，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值，curve-expert 1.3軟件作標(biāo)準(zhǔn)曲線，輸入各OD值，計(jì)算出TNF-α含量。

1.4 大鼠腦組織病理學(xué)檢查 寒潮結(jié)束，將大鼠用 10%水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉，經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈插管，剪開下腔靜脈，同時(shí)快速灌注肝素化生理鹽水（50 U·mL-1），120 mL（滴速為10 mL ·min-1）以清除血管內(nèi)血液，斷頭取腦，-20℃冷凍10 min后將腦切成2 mm厚的冠狀薄片，先肉眼觀察腦組織有無(wú)異常，然后將大鼠腦組織固定于4%的多聚甲醛溶液中 8 h，石臘包埋，連續(xù)石蠟切片，切片厚度 5 μm，HE染色，XDS-1B普通顯微鏡觀察腦卒中情況。根據(jù)寒潮后鏡檢結(jié)果把RHRSP組分為非卒中組，腦梗死組，腦出血組。見(jiàn)圖 1～3。

圖1 大鼠腦組織肉眼觀察注：RHRSP易卒中型腎血管性高血壓大鼠。A：RHSP組腦出血，白色箭頭所示為腦出血病灶；B：RHRSP組腦梗死，白色箭頭所示為腦梗死病灶，C：假手術(shù)組。

圖2 大鼠腦組織光鏡觀察（HE×100）注：RHRSP易卒中型腎血管高血壓大鼠。A：RHRSP組腦出血病灶；B：RHRSP組難梗死病灶。

圖3 腦小動(dòng)脈形態(tài)（HE）注：RHRSP：易卒中型腎血管性高血壓大鼠。A：RHRSP組，黑色箭頭示腦內(nèi)動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄；B：假手術(shù)組，黑色箭頭示正常腦小動(dòng)脈。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用 SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均為正態(tài)資料，寒潮前兩組間比較采用t檢驗(yàn)；寒潮前血壓與 TNF-α水平的的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 卒中情況 術(shù)后RHRSP組因腹部大出血死亡1只，因感染死亡2只，寒潮前 longa≥1的剔除3只，最后經(jīng)歷寒潮的為假手術(shù)組30只，RHRSP組為194只。其中假手術(shù)組經(jīng)歷寒潮后沒(méi)有出現(xiàn)腦卒中；RHRSP組有13只發(fā)生腦梗死，有 35只發(fā)生腦出血，其卒中率為 24.7%，與以往實(shí)驗(yàn)研究［5］基本一致。

2.2 各組大鼠寒潮前血壓與血漿 TNF-α含量的比較 寒潮前手術(shù)組血壓高于假手術(shù)組血壓，有顯著性差異（P＜0.001），且卒中組（包括腦出血組和腦梗死組）高于非卒中組（P＜0.001或 P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。寒潮前手術(shù)組 TNF-α含量高于假手術(shù)組，有顯著性差異（P＜0.001），且卒中組高于非卒中組（P＜0.001），腦出血組TNF-α含量高于腦梗死組，但無(wú)顯著性差異。具體見(jiàn)表1。

圖4 寒潮前各組血壓折線圖注：大鼠數(shù)值（非卒中組將血壓一致的所有大鼠為一個(gè)值，146只共分成32個(gè)值，假手術(shù)組、腦出血組及腦梗死組為實(shí)際的大鼠只數(shù)）。

表1 各組寒潮前例數(shù)、血壓及血漿 TNF-α含量的比較

2.3 寒潮前血壓與 TNF-α水平的的關(guān)系 寒潮前手術(shù)組各組 TNF-α與血壓成正相（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 寒潮前血壓與 TNF-α水平的關(guān)系

3 討論

現(xiàn)有腦卒中模型大多采用正常動(dòng)物，與臨床腦血管病變基礎(chǔ)上發(fā)生的卒中有明顯差異。本研究前期工作顯示，采用雙腎雙夾法制作的 RHRSP模型，2周后血壓明顯升高，以后血壓逐漸升高，術(shù)后12周血壓高達(dá)（215±24）mmHg以上，病理檢查發(fā)現(xiàn)RHRSP腦內(nèi)動(dòng)脈硬化、管壁增厚及管腔狹窄，甚至血管破裂出血［4］；造模 40周自發(fā)性腦卒中的發(fā)生率高達(dá)61.8%，模擬了從高血壓發(fā)生到腦血管結(jié)構(gòu)性破壞以及腦卒中的整個(gè)病理過(guò)程［3］。高血壓持續(xù) 12周后經(jīng)歷人工寒潮，其卒中發(fā)生率為24.5%，其中腦出血占27%，腦梗死占73%。說(shuō)明該模型經(jīng)歷人工寒潮可以模擬高血壓患者在天氣變化時(shí)發(fā)生腦卒中，有利于進(jìn)一步研究氣象因素促發(fā)腦卒中的機(jī)制以及預(yù)防。

近年來(lái)研究表明，炎性機(jī)制在高血壓及腦卒中病理病生過(guò)程中扮演一個(gè)重要的角色。TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞分泌的一種免疫細(xì)胞因子，又是一種重要的炎性細(xì)胞因子，在觸發(fā)高血壓炎癥反應(yīng)中處于中心地位［5］。更為重要的是TNF-α有促動(dòng)脈硬化形成，損傷小動(dòng)脈，介導(dǎo)凋亡機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［6-7］，所以 TNF-α還參與腦血管病的誘發(fā)過(guò)程并影響病程，是缺血性腦卒中復(fù)發(fā)的強(qiáng)力預(yù)測(cè)因子［8］。本文研究顯示：寒潮前手術(shù)組TNF-α含量高于假手術(shù)組，且卒中組高于非卒中組（P＜0.001），腦出血組 TNF-α含量高于腦梗死組，但差異無(wú)顯著性。而TNF-α抑制劑可以透過(guò)血腦屏障，減少腦梗死面積，可能是減少卒中并發(fā)癥一條新途徑［7，9］。

我們進(jìn)一步對(duì)高血壓各組血壓與 TNF-α做簡(jiǎn)單相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：寒潮前手術(shù)組各組 TNF-α與血壓成正相關(guān)。而且血壓越高，這種變化就越明顯。TNF-α升高使得血管收縮和舒張不平衡；同時(shí)高血壓又能造成 TNF-α的過(guò)量釋放，進(jìn)而形成互相促進(jìn)的惡性循環(huán)［10］。無(wú)論是缺血性卒中還是腦出血的發(fā)病過(guò)程中都存在著 TNF-α介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，其中 TNF-α在這一過(guò)程中可能起關(guān)鍵作用。

綜上所述，持續(xù)高血壓使RHRSP血中的TNF-α明顯升高，且增加腦內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)。這些變化達(dá)到一定程度時(shí)在寒潮的刺激下便發(fā)生腦卒中，達(dá)到這種程度可以從 TNF-α的含量上反映，即TNF-α的含量達(dá)到一定程度 RHRSP在寒潮的刺激下發(fā)生腦卒中。我們的研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論發(fā)生腦梗死還是腦出血的RHRSP寒潮前血中TNF-α的含量都較非卒中組明顯升高，且兩者的 TNF-α的含量隨血壓的升高而升高。提示持續(xù)的 TNF-α升高對(duì)高血壓患者發(fā)生腦卒中可能具有一定的預(yù)警作用。

但是 RHRSP經(jīng)歷人工寒潮為什么一部分發(fā)生腦梗死而又有一部分發(fā)生腦出血呢，這需要我們進(jìn)一步研究。

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Tumor necrosis factor-α could be used as the prediction index of stroke in hypertensive rats

LIU Shu-yun1，ZHANG Ping2，LIN Ren-yong1，et al
（1.Guanlan People’s Hospital of Neurology，Shenzhen，Guangdong 518110，China；2.Department of Neurology，Nanhua Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang，Hunan 421002，China）

Objective To investigate changes of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α）in stroke-prone renovascular hypertensive rats （RHRSP）before artificial cold and the possible prediction value of TNF-α.Methods Two-kidney，two-clip methods were used to copy the model of renovascular hypertension in rats.The levels of serum TNF-α were measured by enzyme-linked immunosorbant assay before artificial cold.Results The serum levels in cerebral infarction group and cerebral hemorrhage group were significantly higher than those in the non-stroke group before artificial cold；the contents of TNF-α in hypertension groups positively correlated with blood pressure.Conclusions The serum TNF-α levels could be used as the prediction index of stroke.

stroke；stroke-prone renovascular hypertensive rats；tumor necrosis factor-α；artificial cold

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.018

2013-08-25，

2013-10-30）

湖南省自然科學(xué)基金（No 08JJ3036）

聶亞雄，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腦血管病防治，E-mail：bridgeman1025＠yahoo.com.cn