賀煜星，丁選勝

（中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室，江蘇 南京 210009）

吐溫80體外溶血研究

賀煜星，丁選勝

（中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室，江蘇 南京 210009）

目的 考察吐溫80的體外溶血作用，為制劑生產(chǎn)和臨床安全用藥提供依據(jù)。方法 在570 nm波長(zhǎng)下，采用紫外分光光度法評(píng)價(jià)吐溫80對(duì)家兔紅細(xì)胞的體外溶血作用。結(jié)果 吐溫80可引起家兔紅細(xì)胞體外溶血和紅細(xì)胞形態(tài)改變。結(jié)論 吐溫80具有一定的體外溶血性。

吐溫80；藥用輔料；溶血性

吐溫80（Tween 80，polyoxyethylene 80）又名聚山梨醇酯80，是一種聚氧乙烯衍生的非離子型表面活性劑，為藥物制劑中常用的輔料之一［1］。很多常用中藥注射劑有效成分是水難溶性物質(zhì)，在成型工藝中一般多采用適量吐溫80作為增溶劑。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有吐溫80作為增溶性藥用輔料引起不良反應(yīng)的報(bào)道［2-4］，普遍認(rèn)為其存在溶血性［5-6］。本文通過(guò)對(duì)吐溫 80體外溶血規(guī)律的研究，為吐溫80在注射劑中安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Multiskan_FC酶標(biāo)儀（Thermo（中國(guó)）有限公司）；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）；80-2型電動(dòng)離心機(jī)（金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 家兔 6只，雄性，體重 1.8～2.2 kg，普通級(jí)，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2007-0008。

1.3 藥品 吐溫80（江蘇晨牌藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)130824）；0.9%氯化鈉注射液（江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，批號(hào)1304802）。

2 方法

2.1 紅細(xì)胞懸液制備 6只家兔均從耳中動(dòng)脈采血約6 mL，肝素抗凝，加適量0.9%氯化鈉注射液1 500 rpm離心15 min，棄去上清液，反復(fù)3～4次，至上清液呈無(wú)色透明為止。將所得紅細(xì)胞稀釋為5%紅細(xì)胞懸液，4℃保存，備用。

2.2 供試品溶液配制 精密量取吐溫80，用0.9%氯化鈉注射液配置成0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%濃度吐溫80溶液作為供試品溶液，備用。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)確定 取 5%紅細(xì)胞懸液 0.25 mL，加入蒸餾水 1 mL，混勻，于 37℃水浴孵育 30 min后，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行 UV掃描，在570 nm處有最大吸收；同法分別將配置的0.1% ～2%吐溫80溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，各濃度的吐溫80溶液在570 nm波長(zhǎng)處均無(wú)干擾吸收。

2.4 體外溶血實(shí)驗(yàn) 取試管10支，分別編號(hào) 1～10號(hào)。1～8號(hào)管為樣品管，分別加入 1 mL 0.1% ～2%吐溫80溶液；9號(hào)管為陰性對(duì)照管，加入1 mL 0.9%氯化鈉注射液；10號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管，加入 1 mL蒸餾水。各管分別加入0.25 mL 5%紅細(xì)胞懸液，搖勻后置37℃水浴鍋中孵育?？疾旆跤?1、3和6 h的溶血情況。孵育后，輕震搖勻，置于光學(xué)顯微鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)。各試管于1 500 rpm離心15 min［7］，取上清液測(cè)定吸光度（A），波長(zhǎng) 570 nm，光徑1 cm。按照公式：溶血率（%）＝（A樣-A陰）／（A陽(yáng)-A陰）×100%計(jì)算溶血率，其中A樣、A陰和 A陽(yáng)分別為樣品管、陰性對(duì)照管和陽(yáng)性對(duì)照管的吸光度。溶血率 ＞5%表明有溶血發(fā)生，平行觀察6只家兔。

3 結(jié)果

3.1 吐溫80體外溶血規(guī)律 吐溫 80溶液可引起家兔紅細(xì)胞體外溶血，且溶血率呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。體外孵育3 h和6 h，0.1%吐溫80溶液即可引起溶血率大于5%，即引起紅細(xì)胞溶血。隨吐溫80溶液濃度增大、孵育時(shí)間延長(zhǎng)，溶血率呈增高趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 孵育1、3、6 h后家兔紅細(xì)胞溶血率（%，±s，n＝6）

表1 孵育1、3、6 h后家兔紅細(xì)胞溶血率（%，±s，n＝6）

注：與孵育1 h相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與孵育3 h相比，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

孵育時(shí)間吐溫80濃度／% 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5 2 1 h -2.33±0.66 0.03±3.98 6.47±10.5 17.3±17.38 27.00±18.38 40.07±21.80 57.6±21.75 61.26±19.21 3 h 6.31±7.93*＃25.63±14.82**42.07±18.43**56.89±15.94**64.18±15.14**73.42±11.16**80.08±6.41* 84.49±3.40*6 h 14.48±9.03**45.02±15.47**＃74.97±6.78**＃78.58±8.14**＃82.73±7.68**＃86.32±6.22**＃87.51±5.70**＃89.61±3.78**＃

圖1 孵育1、3、6 h后家兔紅細(xì)胞溶血率曲線（%，±s，n＝6）

3.2 吐溫80致紅細(xì)胞形態(tài)變化觀察 家兔正常紅細(xì)胞形態(tài)呈雙面微凹之圓盤(pán)狀。孵育后，陰性管紅細(xì)胞形態(tài)與孵育前基本一致。低濃度吐溫 80溶液可引起紅細(xì)胞皺縮，并產(chǎn)生棘狀紅細(xì)胞。隨濃度升高，可見(jiàn)圓形紅細(xì)胞、變形紅細(xì)胞。高濃度吐溫 80溶液可致影泡狀紅細(xì)胞產(chǎn)生。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4 討論

目前，《部頒中藥標(biāo)準(zhǔn)》收載的中藥注射劑注明添加的增溶劑全部為吐溫 80，使用量為 0.1%～2%［8］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在該濃度范圍內(nèi)，吐溫 80可引起家兔紅細(xì)胞溶血和紅細(xì)胞形變，且溶血率呈濃度和時(shí)間相關(guān)性增加。因此，在制劑生產(chǎn)中使用吐溫80作為增溶性輔料需注意其溶血性。

吐溫 80并非單一結(jié)構(gòu)的純凈物質(zhì)，而是由多種結(jié)構(gòu)組成的同系混合物［9-10］，因此原料純度和雜質(zhì)殘留可能與其溶血性相關(guān)。同時(shí)，吐溫 80作為增溶劑，在解決注射劑主要成分水溶性差的同時(shí)，有可能成為制劑發(fā)生溶血反應(yīng)的因素之一。因此，深入進(jìn)行吐溫80的溶血性研究，有助于建立其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，在有效增溶的同時(shí)提高安全性，為中藥注射劑中吐溫80的合理使用提供依據(jù)。吐溫80的體內(nèi)溶血過(guò)程與機(jī)制、藥物與輔料的相互作用等尚待進(jìn)一步研究。

圖2 吐溫80孵育1、3、6 h后家兔紅細(xì)胞形態(tài)變化（光鏡，40×10）

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Study on the hemolysis of Tween 80 in vitro

HE Yu-xing，DING Xuan-sheng （Department of Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 210009，China）

Objective To investigate the hemolysis of tween 80 in vitro，providing the basis for preparation of production and safety of clinical medication.Methods To evaluate the hemolysis of tween 80 in vitro on rabbit erythrocytes by UV spectrophotometry at 570nm wave length.Results Tween 80 could cause hemolysis and morphological changes of rabbit erythrocytes in vitro.Conclusion Tween 80 can cause hemolysis in vitro.

Tween 80；pharmaceutical excipients；hemolysis

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.011

2014-01-05，

2014-01-28）

賀煜星，女，碩士研究生

丁選勝，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：dxs0162＠sina.com