倪曉燕，王榮海，宋禮華，儲(chǔ)成風(fēng)，李增禮，周樂春

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031；2.安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司，安徽 合肥 230088；3.安徽省生物研究所，安徽 合肥 230088）

重組人干擾素α2b注射液穩(wěn)定性研究

倪曉燕1，2，王榮海2，3，宋禮華2，3，儲(chǔ)成風(fēng)2，李增禮2，周樂春2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031；2.安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司，安徽 合肥 230088；3.安徽省生物研究所，安徽 合肥 230088）

目的 考察重組人干擾素α2b注射液的穩(wěn)定性。方法 按照《中國藥典》2010年三部的方法進(jìn)行檢測(cè)，其中干擾素蛋白純度采用高效液相法測(cè)定，光照試驗(yàn)、振搖試驗(yàn)、凍融試驗(yàn)、加速試驗(yàn)、低溫長期留樣觀察方法均采用藥典方法。結(jié)果 除了凍融試驗(yàn)中反復(fù)凍融8次后和加速試驗(yàn)中（37±2）℃放置3個(gè)月，干擾素 α2b效價(jià)下降至理論值的80%以下，其余試驗(yàn)抽樣點(diǎn)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。結(jié)論 該品在避光，2～8℃密閉的儲(chǔ)存條件下性質(zhì)穩(wěn)定，貯存期可為2年左右。

重組人干擾素 α2b注射液；穩(wěn)定性；無血清處方

重組人干擾素被廣泛的應(yīng)用于治療毛細(xì)管白血病、喉多發(fā)性乳頭瘤病、艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）相關(guān)的卡波西肉瘤、急慢性病毒性肝炎、病毒性角膜炎［1-2］疾病，通常被制成凍干制劑或液體制劑。為保護(hù)干擾素活性，通常在制劑配方中加入人血白蛋白（Human Sero Albumin，HSA）或白蛋白替代品羥乙基淀粉、葡聚糖、聚山梨酯80、聚乙二醇等。HSA價(jià)格昂貴，并且會(huì)帶來感染血液病毒的風(fēng)險(xiǎn)。聚山梨酯80屬于親水型非離子表面活性劑，常用作助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑等。有研究發(fā)現(xiàn)聚山梨酯80可能會(huì)造成囊狀細(xì)胞的退化，從而引起外周神經(jīng)毒性［3］。聚山梨酯 80本身具有不穩(wěn)定性［4］，還能導(dǎo)致溶血發(fā)生，應(yīng)慎用含吐溫80的靜脈注射劑［5-6］。因此，本課題旨在尋找一種既不含有 HSA也不含有吐溫80，并且能保持干擾素生物活性的液體制劑配方。在參考國內(nèi)外文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，通過研究確定了以組氨酸、EDTA二鈉、氯化鈉、磷酸鹽緩沖液等組成重組人干擾素 α2b注射液的處方，以下是對(duì)此處方穩(wěn)定性進(jìn)行的系統(tǒng)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司），CO2培養(yǎng)箱（2406-2，Shel Lab），倒置顯微鏡（XPS-1B，重慶光電儀器有限公司），Waters 1525高效液相色譜儀，Waters 1489紫外-可見檢測(cè)器，Breeze 2數(shù)據(jù)采集軟件控制（Waters），TSK G2000SWXL色譜柱，實(shí)驗(yàn)室 pH計(jì)（FE20，Mettler Toledo），萬分之一電子天平（ML203，Mettler Toledo），恒溫培養(yǎng)箱（BSC-150，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥 重組人干擾素 α2b注射液［安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司提供，規(guī)格：每支600 萬IU，批號(hào)20110607、20110611、20110615］，異丙醇為色譜純，其余試劑均為分析純。WISH細(xì)胞株，VSV病毒［安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司提供］。IFN-α標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所（批號(hào)：07-01）。

2 方法

2.1 試驗(yàn)方法

2.1.1 光照試驗(yàn) 將重組人干擾素 α2b注射液置于裝有日光燈的冰箱里，照度條件為（4 500±500）Lx，溫度2～8℃，與第5天和第10天取樣，按考察項(xiàng)目檢測(cè)。

2.1.2 振搖試驗(yàn) 避光，室溫下，將重組人干擾素α2b注射液置于搖床（250 r·min-1）中振搖，第4天、第8天取樣按考察項(xiàng)目檢測(cè)。

2.1.3 凍融試驗(yàn) 重組人干擾素α2b注射液反復(fù)凍融0、2、4、6、8次后，按考察項(xiàng)目檢測(cè)。反復(fù)凍融試驗(yàn)的具體操作方法是：將供試品置于 -20℃冰箱中12 h使供試品溶液完全凍結(jié)，然后取出置于 2～8℃冰箱中8 h使供試品溶液完全融化成液體狀態(tài)，如此反復(fù)多次，分別取樣檢測(cè)。

2.1.4 加速試驗(yàn) 將重組人干擾素 α2b注射液置于（25±2）℃條件下，于0、1、2、3、6月分別取樣；將重組人干擾素 α2b注射液置于（37±2）℃條件下，于0、1、2、3月分別取樣，上述樣品按考察項(xiàng)目檢測(cè)。2.1.5 低溫長期試驗(yàn) 將重組人干擾素 α2b注射液置于（6±2）℃條件下，于0、3、6、9、12、18、24月分別取樣，按考察項(xiàng)目檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)項(xiàng)目 外觀性狀、干擾素效價(jià)（生物學(xué)活性）、pH值、蛋白純度、無菌檢查。長期試驗(yàn)最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)增加異常毒性檢測(cè)。

2.3 檢測(cè)方法 蛋白純度采用高效液相色譜法檢測(cè)。色譜條件為：色譜柱TSK G2000SWXL；流動(dòng)相為20 mmol·L-1磷酸鹽—145 mmol·L-1氯化鈉—5%異丙醇緩沖液，pH 7.0；上樣量200 μL；在波長280 nm處檢測(cè)，按面積歸一化法計(jì)算。其余檢測(cè)項(xiàng)均按照 2010《中國藥典》三部［7］的規(guī)定檢查。

3 結(jié)果

3.1 光照試驗(yàn) 重組人干擾素α2b注射液強(qiáng)光照射第5天和第10天取樣按考察項(xiàng)目檢測(cè)，結(jié)果表明強(qiáng)光照射后，干擾素效價(jià)沒有降低，在合格范圍內(nèi)，結(jié)果見圖1。注射液外觀性狀、pH值、蛋白純度均無明顯變化，無菌試驗(yàn)合格，結(jié)果見表1。

3.2 振搖試驗(yàn) 重組人干擾素α2b注射液在室溫下振搖第4天、第8天后取樣檢測(cè)，結(jié)果表明干擾素效價(jià)沒有降低，在合格范圍內(nèi)，結(jié)果見圖 2；其它項(xiàng)均無明顯變化，結(jié)果見表2。

圖1 光照試驗(yàn)干擾素效價(jià)結(jié)果

表1 重組人干擾素α2b注射液在強(qiáng)光下的穩(wěn)定性結(jié)果

圖2 振搖試驗(yàn)干擾素效價(jià)結(jié)果

表2 重組人干擾素α2b注射液在振搖下的穩(wěn)定性結(jié)果

3.3 凍融試驗(yàn) 重組人干擾素 α2b注射液反復(fù)凍融2、4、6、8次后分別取樣檢測(cè)，結(jié)果表明反復(fù)凍融6次，干擾素效價(jià)雖有降低但仍在合格范圍內(nèi)，但反復(fù)凍融8次后，干擾素效價(jià)大幅度降低，且已低于0時(shí)效價(jià)的80%，結(jié)果見圖3；樣品其余檢測(cè)項(xiàng)均無明顯變化，結(jié)果見表3。

3.4 加速試驗(yàn) 重組人干擾素 α2b注射液分別在（25±2）℃條件下儲(chǔ)存6個(gè)月和在（37±2）℃條件下儲(chǔ)存2個(gè)月，干擾素效價(jià)均在合格范圍內(nèi)，但在（37±2）℃條件下儲(chǔ)存 3個(gè)月干擾素效價(jià)降低至 0時(shí)效價(jià)的80%以下，結(jié)果見圖4-1、4-2；樣品其余檢測(cè)項(xiàng)均無明顯變化，結(jié)果見表4-1、4-2。

圖3 凍融試驗(yàn)干擾素效價(jià)結(jié)果

表3 重組人干擾素α2b注射液在反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性結(jié)果

圖4-1 加速試驗(yàn)干擾素效價(jià)結(jié)果（25±2℃）

圖4-2 加速試驗(yàn)干擾素效價(jià)結(jié)果（37±2℃）

3.5 低溫長期試驗(yàn) 取3批重組人干擾素α2b注

表4-1 重組人干擾素 α2b注射液加速試驗(yàn)結(jié)果（25±2℃）

表4-2 重組人干擾素 α2b注射液加速試驗(yàn)結(jié)果（37±2℃）

射液置于（6±2）℃條件下，于 0、3、6、9、12、18、24月取樣檢測(cè)的結(jié)果見表 5。結(jié)果表明，本品在低溫環(huán)境下留樣 24個(gè)月，干擾素效價(jià)在合格范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，結(jié)果見圖5；本品 24月異常毒性試驗(yàn)結(jié)果合格；其余各項(xiàng)指標(biāo)與 0時(shí)相比無明顯變化，均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表5。

圖5 低溫長期試驗(yàn)干擾素效價(jià)結(jié)果

4 討論

重組人干擾素 α2b凍干制劑雖具有保存期長、生物活性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但其冷凍干燥的過程非常復(fù)雜，藥物的結(jié)構(gòu)可能受其中的物理化學(xué)變化影響而發(fā)生變化，特別是蛋白質(zhì)多肽類藥物的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)易受破壞［8-10］。并且凍干制劑病人使用之前還需要復(fù)溶，依從性差。因此從經(jīng)濟(jì)和使用便捷性方面考慮，市場更青睞可長期穩(wěn)定保存干擾素液體制劑。

表5 重組人干擾素 α2b注射液低溫長期試驗(yàn)結(jié)果（6±2℃）

本課題通過研究確定了由組氨酸、EDTA二鈉、氯化鈉、磷酸鹽緩沖液等組分構(gòu)成的重組人干擾素α2b注射液，不含HSA和聚山梨酯80。L-組氨酸是一種半必需氨基酸，氨基酸是一種常見的蛋白質(zhì)保護(hù)劑［11］，有文獻(xiàn)報(bào)道其用于重組人紅細(xì)胞生成素中［12］。EDTA二鈉作為絡(luò)和劑、洗滌劑、血液抗凝劑及金屬掩蔽劑廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域，每天攝入量不得超過2.5 mg·kg-1［13］，在干擾素注射液中EDTA二鈉的含量可以通過 HPLC法準(zhǔn) 確 測(cè) 定［14］。

我們篩選出的此種不含 HSA、吐溫 80的重組人干擾素α2b注射液，在強(qiáng)光照射、室溫振搖、反復(fù)凍融、加速試驗(yàn)中，均保持較好的穩(wěn)定性。在 6±2℃儲(chǔ)存條件下，干擾素活性能保持2年基本不變。通過系統(tǒng)穩(wěn)定性研究結(jié)果，我們可知由組氨酸、EDTA二鈉、氯化鈉、磷酸鹽緩沖液組成的制劑配方能較好的保護(hù)重組人干擾素 α2b生物活性，其制劑在避光、2～8℃密閉儲(chǔ)存 2年質(zhì)量符合《中國藥典》2010版規(guī)定。

［1］ Perrillo R.Benefits and risks of interferon therapy for hepatitis B ［J］.Hepatology，2009，49（5 Suppl）：S103-111.

［2］ 蘇曉鋒.干擾素在不同類型病毒性角膜炎中的療效和安全性觀察［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（5）：852-853.

［3］ Freilich RJ，Balmaceda C，Seidnan AD，et a1.Motor neuropathy due to docetaxel and paclitaxel［J］.Neurology，1996，47：l15.

［4］ 譚志高，巢志茂，劉海萍，等.聚山梨脂80的化學(xué)穩(wěn)定性研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（1）：251-254.

［5］ 李寅超，郭 琰，吳翠萍，等.6種不同來源的注射用吐溫 80致敏性和溶血性實(shí)驗(yàn)研究［C］.上海：首屆中國藥物毒理學(xué)年會(huì)（2011年）暨國際藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究論壇，2010：160 -164.

［6］ 吳 毅，金少鴻.藥用輔料吐溫80的藥理、藥動(dòng)學(xué)及分析方法研究進(jìn)展［J］.中國藥事，2008，22（8）：717-719.

［7］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典：三部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：268-269.

［8］ 劉占杰，華澤釗.蛋白質(zhì)藥品冷凍干燥過程中變性機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.中國生化藥物雜志，2000，21（5）：263-265.

［9］ 武華麗，胡一橋.冷凍干燥制劑的穩(wěn)定性研究進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，2001，36（7）：436-438.

［10］張玉華，凌沛學(xué)，籍保平.糖類在生物活性物質(zhì)冷凍干燥中的保護(hù)作用及其作用機(jī)制［J］.中國生化藥物雜志，2006，27（4）：247-249.

［11］Pikal-Cleland KA，Cleland JL，Anchordoquy TJ，et al.Effect of glycine on pH changes and protein stability during freeze-thawing in phosphate buffer systems［J］.J Pharm Sci，2002，91（9）：1969-1979.

［12］侯緒鳳，侯劍英，唐其鳳.重組人紅細(xì)胞生成素新制劑及其穩(wěn)定性研究［J］.微生物學(xué)雜志，2003，23（1）：15-17.

［13］Bhavil Narola AS，Singh M，Mitra PR，et al.A validated reverse phase HPLC method for the determination of disodium EDTA in meropenem drug substance with uv-detection using precolumn derivatization technique［J］.Anal Chem Insights，2011，6：7-13.

［14］李增禮，周樂春，趙 輝，等.高效液相色譜法測(cè)定重組人干擾素α-2b注射液中乙二胺四乙酸二鈉含量［J］.生物技術(shù)通訊，2012，23（3）：419-422.

Study on Stability of Recombinant Human Interferon α2b Injection

NI Xiao-yan1，2，WANG Rong-hai2，3，SONG Li-hua2，3，et al
（1.Anhui University of Chinese Medicine，Hefei，Anhui 230031，China；2.Anhui Anke Biotechnology （Group）Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230088，China，3.Anhui Biological Institute，Hefei，Anhui 230088，China）

Objective To study the stability of recombinant human interferon α2b injection.Methods According to the methods of Ch.P for testing，the protein purity of interferon were determined by HPLC.The stability of the samples were tested by strong-light，shaking，freeze thaw，accelerating experiment and prolonged low-temperature storage.Results After being exposured to repeated freezing and thawing 8 times and accelerating test for 3 months in 37℃，interferon potency was reduced to less than 80%of the theoretical value，but on other experiments，it was rather stable.Conclusion This injection should be kept away from high light and may be stored for 2 years at 2～8℃.

recombinant human interferon α2b injection；stability；serum free formula

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.008

2013-11-21，

2014-02-08）

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No 2011ZX09202-301-02）

倪曉燕，女，碩士研究生

宋禮華，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物技術(shù)領(lǐng)域的研究、產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，E-mail：songlh＠ankebio.com