張永旺　武振華　馮少勇　柯鑫文　張雁鋼

【摘要】 目的：研究前列腺癌和前列腺增生組織中GSTP1和RASSF1A基因的甲基化差異及其蛋白表達情況，探討GSTP1和RASSF1A基因甲基化作為前列腺癌早期診斷的價值，并揭示該基因甲基化與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法：采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）方法檢測GSTP1和RASSF1A基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，并運用免疫組化SP染色法檢測前列腺癌組織中GSTP1和RASSF1A基因的蛋白表達情況。結(jié)果：前列腺癌組織中GSTP1和RASSF1A基因甲基化檢出率均明顯高于前列腺增生組織，差異均有統(tǒng)計學意義（GSTP1：76.00%vs3.33%，P<0.001；RASSF1A：68.00%vs16.67%，P<0.001）。在前列腺癌中，GSTP1和RASSF1A蛋白陽性表達均明顯低于前列腺增生組織，差異均有統(tǒng)計學意義（GSTP1：20.00%vs76.67%，P<0.001；RASSF1A：38.00%vs90.00%，P<0.001）。結(jié)論：GSTP1和RASSF1A基因異常甲基化可導致靶基因的蛋白表達降低，促進前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，GSTP1和RASSF1A基因在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，檢測GSTP1和RASSF1A基因的甲基化有望成為前列腺癌早期診斷的分子標志物。

【關(guān)鍵詞】 前列腺癌； GSTP1； RASSF1A； 甲基化； 甲基化特異性聚合酶鏈反應

前列腺癌（PCa）是老年男性的常見疾病。PCa在歐美地區(qū)占男性惡性腫瘤首位，是導致發(fā)達國家男性癌死亡的主要原因[1]。我國PCa發(fā)病率較歐美低，但近年來，我國PCa的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢。目前，血清前列腺特異性抗原（PSA）作為PCa的單一檢測指標，雖然具有較高的PCa陽性診斷預測率，但它受到年齡、前列腺按摩、穿刺、感染、藥物等因素的影響，致使其診斷的敏感性、特異性不高，不能充分滿足臨床需要，因此，PCa急需要敏感特異的生物標記物。

腫瘤是多因素參與、多基因變異積累、多階段發(fā)生的復雜的病理過程。PCa的發(fā)病機制尚未明確，探索PCa的發(fā)病機制，將為PCa的早期診斷與治療提供理論依據(jù)。DNA甲基化是表觀遺傳學的主要修飾方式之一，在基因表達的調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等方面有重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PCa的臨床分期與DNA甲基化密切相關(guān)，甲基化往往發(fā)生在腫瘤的早期，且甲基化頻率隨著疾病的進展而增高[3]。通過筆者對國內(nèi)外PCa的甲基化研究文獻進行檢索，同時參考Ahmed[4]對PCa生物標記基因的預測。筆者預測GSTP1和RASSFIA最有可能成為PCa的早期生物標記，同時也有可能為疾病的預后提供更多提示。本研究旨在采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）方法檢測PCa組織和前列腺增生（BPH）組織中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶1（GSTP1）和RAS相關(guān)區(qū)域家族1（RASSF1）基因啟動子區(qū)CpG島甲基化改變；采用免疫組化SP染色法檢測PCa組織和BPH組織中GSTP1和RASSF1的蛋白表達情況，進一步研究GSTP1和RASSF1A基因異常甲基化及靶蛋白的表達情況，探討GSTP1和RASSFIA基因甲基化作為PCa早期診斷的價值及在PCa中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集山西醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)學院病理科PCa組織石蠟標本及BPH組織石蠟標本，分別進行組織DNA甲基化檢測及免疫組化。其中經(jīng)前列腺根治手術(shù)切除的PCa組織石蠟標本50例，患者年齡為51-82歲，平均（65.72±9.09）歲；BPH組織石蠟標本30例，患者年齡52-83歲，平均（66.13±10.23）歲。所有樣本均經(jīng)病理學診斷證實，且PCa患者術(shù)前均未進行化療或放療治療。

1.2 主要試劑和儀器 OMEGA FFPE DNA Kit（50）；

Realtime PCR Master Mix；EpiTect Bisulfite Kits（48）；EpiTect Control DNA（100）；2×NI-Taq PCR MasterMix；鼠抗人GSTP1單克隆抗體、鼠抗人RASSF1A單克隆抗體；全自動酶標儀DG3022A型；PCR儀Applied Biosystems；凝膠成像系統(tǒng)AlphaImager HP。

1.3 方法

1.3.1 MSP方法 根據(jù)文獻[5-6]設(shè)計引物，具體序列如表1所示，ACTB引物參考文獻；所有引物由Invitrogen公司合成。

PCa組織BPH組織分別進行DNA常規(guī)提取。提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計測定A260/A280比值在1.7～20之間的為合格標本，計算標本DNA濃度，按亞硫酸鹽處理試劑盒說明書進行DNA甲基化修飾；取約50 ng亞硫酸處理后DNA作為模板，以NEB公司2×NI-Taq PCR MasterMix作為原料，以ACTB為內(nèi)參，應用PCR儀器（Applied Biosystems）進行擴增反應。每次反應均設(shè)陽性對照，空白對照（雙蒸水為陰性對照），每個樣本重復3次。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，53/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45個循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min。然后在3%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)束后，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，分析結(jié)果。

1.3.2 免疫組織化學方法 PCa和BPH石蠟組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后，放入3%雙氧水-甲醇溶液中浸泡10 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)高壓抗原熱修復之后，滴加抗體（詳細步驟按照說明書進行），經(jīng)DAB顯色，蘇木精復染。每批染色用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察，結(jié)果采用半定量計分法判斷，陽性細胞數(shù)打分：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度打分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再由陽性細胞數(shù)及染色強度的乘積判斷陽性等級：0～2分為陰性（-），3～8分為弱陽性（+），9～12分為強陽性（++）。endprint

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用 字2檢驗對GSTP1及RASSF1A基因在PCa與BPH組織中的甲基化率進行比較分析，同時采用相同的方法對靶蛋白的陽性強度進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MSP法檢測結(jié)果比較 采用MSP法對50例PCa組織和30例BPH組織中的GSTP1基因及RASSF1A基因進行甲基化檢測，50例PCa組織中GSTP1基因及RASSF1A基因啟動子區(qū)高甲基化例數(shù)分別為38例和34例，甲基化率分別為76.00%和68.00%。30例BPH組織中，GSTP1基因及RASSF1A基因啟動子區(qū)高甲基化例數(shù)分別為1例和5例，甲基化率分別為3.33%和16.67%，見表2。結(jié)果顯示，PCa組織中GSTP1基因及RASSF1A基因啟動子甲基化頻率均明顯高于BPH組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

表2 PCa組織和BPH組織中GSTP1和RASSF1A基因的甲基化檢測

結(jié)果比較 例

組別 GSTP1

RASSF1A

陽性 陰性 陽性 陰性

Pca（n=50） 38 12 34 16

BPH（n=30） 1 29 5 25

字2值 39.628 19.776

P值 <0.001 <0.001

2.2 免疫組織化學法檢測結(jié)果比較 采用SP染色法對50例PCa組織和30例BPH組織中的GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白進行檢測，50例PCa組織中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白陽性反應的例數(shù)分別為10例和19例，陽性率分別為20.00%和38.00%。30例BPH組織中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白陽性反應的例數(shù)分別為23例和27例，陽性率分別為76.67%和90.00%，見表3。結(jié)果顯示，GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白在PCa組織中的表達均明顯低于BPH組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

表3 GSTP1和RASSF1A基因在PCa組織和BPH組織中的

表達比較 例

組別 GSTP1

RASSF1A

陽性 陰性 陽性 陰性

PCa（n=50） 10 40 19 31

BPH（n=30） 23 7 27 3

字2值 24.844 20.747

P值 <0.001 <0.001

3 討論

DNA甲基化是一種調(diào)節(jié)基因表達的表觀遺傳學機制，它通過甲基化使抑癌基因和相關(guān)保護基因沉默，致使靶蛋白表達缺失，促進了PCa的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過對GSTP1和RASSF1A基因在PCa組織中的甲基化檢測及其靶蛋白表達研究，分析探討GSTP1和RASSF1A基因甲基化在PCa的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

GSTP1基因定位于染色體11q13，GSTP1參與代謝、解毒和消除潛在的具有基因毒性的外來復合物，它能夠代謝多種致癌化合物，起到保護細胞避免DNA損傷和癌細胞形成的作用，抑制GSTP1活性可以導致DNA損傷的敏感性增強和癌變發(fā)生的幾率增加。筆者對GSTP1基因啟動子區(qū)甲基化檢測顯示：PCa與BPH相比，GSTP1甲基化頻率較高；這說明GSTP1在正常前列腺組織中以非甲基化形式存在，在PCa中多以高甲基化形式存在。結(jié)合免疫組化結(jié)果：GSTP1在正常前列腺上皮多呈現(xiàn)強陽性或陽性反應，而在PCa惡性上皮多呈陰性反應。結(jié)合以上研究，說明在BPH組織中GSTP1高表達而在PCa組織細胞中存在GSTP1低表達或表達缺失。研究提示在PCa中GSTP1啟動子區(qū)高甲基化導致了靶蛋白表達降低甚至缺失，促進PCa的發(fā)生發(fā)展。

RASSF1A是Dammann等[6]與2000年發(fā)現(xiàn)的一種新型的抑癌基因，該基因的表達失活在人類多重腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。然而基因突變、缺失及DNA啟動子區(qū)異常甲基化均可能導致RASSF1A基因的失活，人類腫瘤中的RASSF1A表達缺失是一個普遍事件，至少在37種腫瘤中存在RASSF1A啟動子的異常甲基化[7-8]?，F(xiàn)已有關(guān)于該基因的表達及其甲基化的檢測報道[9-11]。筆者對RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化檢測顯示：PCa組織中RASSF1A基因啟動子甲基化率明顯高于BPH，但是BPH中也有部分甲基化的發(fā)生。說明RASSF1A在PCa發(fā)生進展的過程中，RASSF1A基因的甲基化頻率逐步增高。免疫組化方面：RASSF1A在BPH組織中的表達明顯高于PCa組織，癌組織RASSF1A蛋白表達明顯降低或缺失。結(jié)合上述兩種方法，筆者認為RASSF1A基因啟動子高甲基化可能造成該基因表達降低或失活，導致靶蛋白表達減少或缺失。這樣的結(jié)果提示，RASSF1A基因可作為PCa早期診斷的分子標記物，同時為PCa的臨床分期提供依據(jù)。

通過對GSTP1和RASSF1A基因的研究，筆者發(fā)現(xiàn)DNA啟動子區(qū)CpG島甲基化的發(fā)生致使蛋白低表達進而導致PCa的發(fā)生和進展。本研究中GSTP1基因的研究結(jié)果與國外Ellinger[12]報道結(jié)果基本一致，而與國內(nèi)張彥等[13]研究結(jié)果不盡相同，這種差異的存在可能與樣本量、實驗方法或地域不同等因素有關(guān)，也有可能為樣本有PCa和BPH組織并存、混雜等因素，因此檢測GSTP1和RASSF1A基因甲基化作為PCa早期診斷的分子標記物，仍需進一步的擴大樣本含量、改變實驗方法或擴大研究范圍來研究證實。

目前，在其他腫瘤中，遺傳學和表觀遺傳學的改變已經(jīng)應用于臨床。PCa也需要新的檢測和治療方法。以上結(jié)果表明，在PCa的發(fā)生和發(fā)展中，GSTP1和RASSF1A最有可能成為PCa的早期生物標記，同時也將為PCa的診斷、治療、預后提供重要價值。endprint

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（收稿日期：2014-03-06） （本文編輯：歐麗）endprint

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