沈薩薩,姜靈,陸杰,于洪巍
(1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122;2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系,浙江 杭州 310028)
酶法動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜?/p>
沈薩薩1,姜靈2,陸杰1,于洪巍2
(1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122;2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系,浙江 杭州 310028)
采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙酰基鄰氯扁桃酸進(jìn)行不對(duì)稱水解,利用突變后的扁桃酸消旋酶(V29I)對(duì)拆分后的產(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸進(jìn)行消旋,消旋后的鄰氯扁桃酸經(jīng)過(guò)酰化重新被利用到水解反應(yīng)中,實(shí)現(xiàn)了酶法動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜?。通過(guò)對(duì)拆分反應(yīng)、拆分混合物的分離回收以及消旋反應(yīng)的工藝優(yōu)化,最終獲得光學(xué)純度ee>99.9%的R-(-)-乙?;徛缺馓宜?,其收率達(dá)80%。本研究建立的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膭?dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分工藝,對(duì)其工業(yè)化應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。
酶法動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分;脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011;扁桃酸消旋酶;乙?;徛缺馓宜?;鄰氯扁桃酸
鄰氯扁桃酸是一種重要的精細(xì)化學(xué)品,在醫(yī)藥化學(xué)品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。其中,R-(-)-鄰氯扁桃酸是合成新型血小板聚集抑制劑氯吡格雷的重要中間體[1-3]。隨著氯吡格雷、鄰氯扁桃酸及其衍生物用途的進(jìn)一步開(kāi)發(fā),R-(-)-鄰氯扁桃酸的需求量日益增加,但由于受到傳統(tǒng)工藝的限制,市場(chǎng)需求難以得到滿足。
目前,R-(-)-鄰氯扁桃酸的制備主要有以下幾種方法。①直接利用不對(duì)稱合成或還原的方法制備光學(xué)活性的R-(-)-鄰氯扁桃酸。2009年,Yin等[4]利用金屬釕(Ru)作為催化劑催化不對(duì)稱氫化法合成R-(-)-鄰氯扁桃酸甲酯,產(chǎn)物的ee值為92%。但反應(yīng)條件較苛刻,且有毒的重金屬易污染底物。②非對(duì)映體鹽結(jié)晶法是目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一種拆分技術(shù)。它是利用手性試劑將外消旋體混合物中的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對(duì)映異構(gòu)體,然后利用其物理性質(zhì)的差異將非對(duì)映異構(gòu)體分開(kāi),從而得到單一異構(gòu)體。但其面臨的共同問(wèn)題是拆分劑價(jià)格昂貴,且有一定的毒性,因此在一定的程度上造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。③酶催化拆分方法是利用具有立體選擇性的酶作為催化劑,在此催化劑的作用下,底物的其中一種異構(gòu)體優(yōu)先反應(yīng),從而達(dá)到把兩種對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化成非對(duì)映異構(gòu)體,實(shí)現(xiàn)拆分的目的。如報(bào)道的商品酶CAL-A(Novozym 735)可以水解拆分鄰氯扁桃酸甲酯,產(chǎn)物ee值高達(dá)99%以上[5]。但這種方法的理論收率最多50%,造成了資源的浪費(fèi)。然而動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分技術(shù)的出現(xiàn)為解決這個(gè)問(wèn)題提出了新的思路。動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分在動(dòng)力學(xué)拆分的基礎(chǔ)上添加了反應(yīng)活性較弱的對(duì)映體的原位消旋,拆分過(guò)程與反應(yīng)活性較弱的對(duì)映體原位消旋相繼或同時(shí)進(jìn)行,即某一對(duì)映體不斷轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品,而另一對(duì)映體則不斷地消旋化補(bǔ)充原料,最終得到理論產(chǎn)率100%的光學(xué)純化合物[6-11]。
目前利用動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分制備R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。如圖1所示,本研究采用假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011催化乙酰基鄰氯扁桃酸進(jìn)行不對(duì)稱水解,獲得未反應(yīng)的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和產(chǎn)物S-(-)-鄰氯扁桃酸[12-13]。R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸經(jīng)過(guò)水解就可獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸。同時(shí),利用扁桃酸消旋酶使鄰氯扁桃酸產(chǎn)物消旋化,形成鄰氯扁桃酸消旋體,經(jīng)過(guò)乙?;铣刹鸱值孜镆阴;徛缺馓宜幔匦伦鳛樵线M(jìn)入反應(yīng)體系。因此,通過(guò)對(duì)乙酰基鄰氯扁桃酸進(jìn)行動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分獲得R-(-)-鄰氯扁桃酸前體物是R-(-)-乙?;徛缺馓宜嶂苽涞囊环N有前景的新工藝。
1.1 試劑
Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶、乙酰基鄰氯扁桃酸(純度為99.9%)和扁桃酸消旋酶(突變體V29I)由實(shí)驗(yàn)室制備。R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜幔ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%),由上海精純?cè)噭┯邢薰举?gòu)得。氯仿,分析純,購(gòu)自上海精純?cè)噭┯邢薰?。乙酸乙酯,分析純,?gòu)自杭州化工有限公司。其他試劑均為分析純。
圖1 乙?;徛缺馓宜岬膭?dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 乙酰基鄰氯扁桃酸的拆分反應(yīng)
配制磷酸緩沖液(200mmol/L,pH=6.2),取10mL置于25mL的錐形瓶中,加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙?;徛缺馓宜幔磻?yīng)體系為密閉體系,將反應(yīng)體系置于45℃,200r/min的恒溫?fù)u床中,反應(yīng)5h,獲得R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬孜锖袜徛缺馓宜岙a(chǎn)物。
1.2.2S-(-)-鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)
配制磷酸緩沖液(200mmol/L,pH=7.5)和濃度10mmol/L的S-(-)-鄰氯扁桃酸。加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液,封閉反應(yīng)體系,將反應(yīng)體系置于30℃,200r/min的恒溫?fù)u床中,反應(yīng)3.5h,獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。
1.2.3 拆分反應(yīng)后的混合物分離實(shí)驗(yàn)
首先,向拆分反應(yīng)液中加入不同體積的氯仿萃取溶劑,將該密閉體系置30℃,200r/min的恒溫?fù)u床中,萃取30min。通過(guò)萃取收率的大小來(lái)確定萃取劑的使用量。然后,根據(jù)確定的萃取劑的使用量,分別研究了在20℃、30℃、40℃下,10min、20min、30min、40min、50min時(shí)的萃取收率,篩選出最佳萃取溫度和時(shí)間。在以上優(yōu)化條件下,本實(shí)驗(yàn)還研究了萃取次數(shù)對(duì)萃取效果的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行樣,取平均值。
1.2.4 乙?;徛缺馓宜岬腄KR反應(yīng)
配制磷酸緩沖液(200mmol/L,pH=6.2),取100mL置于250mL的錐形瓶中,加入50g/L的脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011凍干粉和20mmol/L的底物乙?;徛缺馓宜幔瑢⒎磻?yīng)體系置于45℃、200r/min的恒溫?fù)u床中,反應(yīng)5h,獲得R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬孜锖袜徛缺馓宜岙a(chǎn)物。拆分反應(yīng)結(jié)束后,將體系中的酶離心去除,調(diào)節(jié)pH值至7.5,加入10%的鄰氯扁桃酸消旋酶的酶液,將反應(yīng)體系置于30℃、200r/min的恒溫?fù)u床中,反應(yīng)3.5h,獲得鄰氯扁桃酸的消旋體。采用溶劑萃取法將未反應(yīng)的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜嵯w分離。將鄰氯扁桃酸的消旋體?;蟮玫降囊阴;徛缺馓宜嶂匦掠糜诓鸱址磻?yīng)。最終實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分的整個(gè)過(guò)程。
1.3 分析方法
分析方法為液相分析法。液相色譜儀為Agilent 1100 series(美國(guó)),AD-H柱(4.6nm×250mm),柱溫保持在25℃,流動(dòng)相為正己烷和異丙醇,流動(dòng)相配比為90∶10,流速1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)λ=254nm,進(jìn)樣量保持在20~50μL。在此液相條件下,測(cè)得S-(+)-乙酰基鄰氯扁桃酸和R-(-)-乙?;徛缺馓宜帷-(+)-鄰氯扁桃酸和R-(-)-鄰氯扁桃酸的保留時(shí)間分別為7.847min、8.450min、13.234min、14.378min。
底物對(duì)映體過(guò)量值eeS=(CSR-CSS)/(CSR+CSS)× 100%,產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值eeP=(CPS-CPR)/(CPR+CPS)× 100%,轉(zhuǎn)化率由根據(jù)底物的減少計(jì)算而得,式中CSS、CSR、CPR和CPS分別為S-(+)-乙?;徛缺馓宜帷-(-)-乙?;徛缺馓宜帷-(-)-鄰氯扁桃酸和S-(+)-鄰氯扁桃酸的含量。
2.1 乙酰基鄰氯扁桃酸的拆分反應(yīng)
徐建和課題組[11-12]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌脂肪酶Pseudomonassp. ECU1011可以催化乙?;徛缺馓宜岬牟粚?duì)稱水解,得到R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷彤a(chǎn)物鄰氯扁桃酸。此脂肪酶可以優(yōu)先水解S-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸,并且產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的對(duì)映體過(guò)量值最高可達(dá)99%。此反應(yīng)也可同時(shí)得到對(duì)映體過(guò)量值較高的R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸。在徐建和課題組研究的基礎(chǔ)上,為了獲得高產(chǎn)率的光學(xué)高純度R-(-)-乙?;徛缺馓宜?,對(duì)脂肪酶催化拆分反應(yīng)的條件進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。
2.1.1 拆分反應(yīng)的溫度
為了提高R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率,對(duì)拆分反應(yīng)的溫度進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化研究。如圖2所示,在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi),在40℃和45℃反應(yīng)時(shí)R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膃e值較高,消旋效果較好。而反應(yīng)溫度在30℃或55℃時(shí)酶活受到溫度的影響,導(dǎo)致R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶?duì)映體過(guò)量值明顯偏低。因此進(jìn)一步對(duì)40℃和45℃下的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)由于底物自水解的發(fā)生,R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的產(chǎn)率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,而在45℃的反應(yīng)條件下,反應(yīng)3.5h內(nèi)(R)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率已經(jīng)開(kāi)始降低,此時(shí)R-(-)-乙?;徛缺馓宜釋?duì)映體過(guò)量值還沒(méi)有達(dá)到理想值。而在溫度為40℃時(shí),自水解比較緩慢,當(dāng)R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膃e>99%時(shí),R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬乃饬窟€很少,見(jiàn)圖3。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對(duì)映體過(guò)量和產(chǎn)率的最優(yōu)值,確定了最佳反應(yīng)溫度為40℃。
圖2 溫度對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶?duì)映體過(guò)量值的影響
圖3 溫度對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜岙a(chǎn)率的影響
表1R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶?duì)映體過(guò)量值和產(chǎn)率隨時(shí)間的變化
2.1.2 拆分反應(yīng)時(shí)間
拆分反應(yīng)時(shí)間對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶?duì)映體過(guò)量值和產(chǎn)率的影響如表1所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,(R)-乙?;徛缺馓宜岬膶?duì)映體過(guò)量值也隨之增大,當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)化率超過(guò)50%時(shí),eeS>99%。但是隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行,底物轉(zhuǎn)化率繼續(xù)升高的同時(shí)還伴隨著R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬牧恐饾u減少。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間少于4.25h時(shí),未反應(yīng)的(R)-乙?;徛缺馓宜岬氖章驶颈3肿畲笫章剩菍?duì)映體過(guò)量值不高。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于4.25h時(shí),未反應(yīng)的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬氖章书_(kāi)始下降,但其對(duì)映體過(guò)量值穩(wěn)定在eeS>99.9%。綜合考慮拆分反應(yīng)后R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬膶?duì)映體過(guò)量和收率的最優(yōu)值,確定最佳反應(yīng)時(shí)間為4.25h。
綜合考慮以上影響拆分效果的因素,從拆分反應(yīng)中R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的對(duì)映體過(guò)量和收率值的角度,確定了拆分反應(yīng)的最佳條件:以20mmol/L乙?;徛缺馓宜嶙鳛椴鸱值孜?,將反應(yīng)體系置于40℃、200r/min的恒溫?fù)u床中,反應(yīng)4.25h。
2.2 鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)
消旋酶是一種催化底物產(chǎn)生消旋化的酶,它可以將單一的對(duì)映體轉(zhuǎn)化為消旋體。本實(shí)驗(yàn)中鄰氯扁桃酸的消旋反應(yīng)就是通過(guò)扁桃酸消旋酶催化的。將拆分后產(chǎn)生的鄰氯扁桃酸單一對(duì)映體經(jīng)過(guò)扁桃酸消旋酶催化產(chǎn)生消旋體鄰氯扁桃酸。得到的消旋體又可經(jīng)過(guò)乙?;磻?yīng)轉(zhuǎn)化為拆分底物繼續(xù)進(jìn)行拆分反應(yīng)。從而在理論上可以使R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的轉(zhuǎn)化率提高至100%。因此消旋反應(yīng)是動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分過(guò)程中的重要反應(yīng)。為此本實(shí)驗(yàn)對(duì)消旋反應(yīng)的條件進(jìn)行了優(yōu)化,研究了pH值、溫度和鄰氯扁桃酸濃度對(duì)消旋反應(yīng)的影響,確定了消旋反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。
2.2.1 溫度對(duì)消旋反應(yīng)的影響
推力桿由推力桿頭、柱管、橡膠襯套總成、彈性擋圈組成,其中橡膠襯套總成由橡膠、銷軸構(gòu)成。平衡懸架中的推力桿結(jié)構(gòu)如圖2所示。
一般情況下,溫度的變化會(huì)使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致選擇性和反應(yīng)活性發(fā)生變化,因此必須考察反應(yīng)溫度對(duì)消旋反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)采用相同反應(yīng)體系,分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的搖床內(nèi)反應(yīng)2h。結(jié)果如圖4所示:鄰氯扁桃酸的轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高而逐漸增加,當(dāng)溫度在25℃~30℃時(shí),消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高,而隨著溫度的進(jìn)一步升高,酶活隨著溫度的升高而降低,導(dǎo)致消旋效果進(jìn)降低,使得消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率減少。因此消旋反應(yīng)的最佳溫度范圍為25~30℃。以下實(shí)驗(yàn)溫度均采用30℃。
圖4 溫度對(duì)消旋反應(yīng)的影響
圖5 底物濃度對(duì)消旋反應(yīng)的影響
2.2.2 底物濃度對(duì)消旋反應(yīng)的影響
配制不同濃度的底物S-鄰氯扁桃酸,在相同的反應(yīng)條件下反應(yīng)2h。結(jié)果如圖5所示:隨著底物濃度的增加,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸減少,消旋效果逐漸降低。原因可能是當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)產(chǎn)生底物抑制效應(yīng),對(duì)酶促反應(yīng)的活性產(chǎn)生了消極影響。雖然當(dāng)?shù)孜餄舛葹?mmol/L時(shí)消旋效果最好,可實(shí)際得到的產(chǎn)物太少,不利于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和回收純化,因此確定10mmol/L為適宜的底物濃度。
2.2.3 pH值對(duì)消旋反應(yīng)的影響
配制不同pH值(6.0~8.0)的緩沖液,在相同反應(yīng)條件下反應(yīng)2h,結(jié)果如圖6所示:隨著反應(yīng)體系pH值的增大,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加,而當(dāng)pH=7.5時(shí),反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最大,達(dá)到39.4%。但隨著pH值的進(jìn)一步增加,反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率反而下降。當(dāng)繼續(xù)增加消旋反應(yīng)的時(shí)間(從2h延長(zhǎng)到8h),使反應(yīng)完全進(jìn)行,結(jié)果顯示:當(dāng)pH值在6~7范圍或大于7.5時(shí),都有一定的消旋效果。在pH=7.5時(shí),消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50%,底物幾乎完全消旋。因此,消旋反應(yīng)的最佳pH值為7.5。
圖6 pH值對(duì)消旋反應(yīng)的影響
2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響
綜合以上的各項(xiàng)因素,采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行消旋反應(yīng),考察了完全反應(yīng)所需要的時(shí)間。結(jié)果如圖7所示:隨著反應(yīng)的進(jìn)行,消旋反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸增加,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)3h后,反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率接近50%,并且趨于平衡狀態(tài)。因此反應(yīng)3h時(shí),消旋反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行完全。
2.3 拆分產(chǎn)物的溶劑萃取分離過(guò)程
圖7 pH值7.5時(shí),轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的變化
目前對(duì)于拆分反應(yīng)后的混合物主要采用柱層析的方法進(jìn)行分離。但是此方法分離過(guò)程繁瑣,分離量較少,經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較高,不適合工業(yè)化應(yīng)用。工業(yè)上較常用結(jié)晶和萃取的方法進(jìn)行分離。從節(jié)約成本和降低耗能的角度,采用溶劑萃取法對(duì)乙?;徛缺馓宜岵鸱趾蟮幕旌衔镞M(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)對(duì)萃取劑進(jìn)行了篩選,然后對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿┑氖褂昧俊⑤腿r(shí)的溫度和時(shí)間、萃取的次數(shù)進(jìn)行了研究。
2.3.1 萃取劑的選擇
本研究從幾種實(shí)驗(yàn)室較常用的有機(jī)溶劑中選擇合適的萃取劑,采用乙醚、石油醚、正己烷、氯仿、乙酸乙酯作為萃取劑,分別考察了他們的萃取效果。取相同的酶法制備液,在室溫下,分別加入等體積的上述5種有機(jī)溶劑進(jìn)行1次萃取。萃取結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明:石油醚和正己烷對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜峋鶝](méi)有萃取作用,乙醚和乙酸乙酯對(duì)兩種物質(zhì)都有較高的萃取效果,但這兩種有機(jī)溶劑無(wú)法達(dá)到讓兩者分離的效果。只有氯仿能夠有選擇性的萃取R-(-)-乙?;徛缺馓宜?,而對(duì)鄰氯扁桃酸無(wú)萃取效果,因此可以實(shí)現(xiàn)前者的有效分離。而乙酸乙酯對(duì)兩種物質(zhì)的萃取收率都達(dá)到96%以上,因此后續(xù)制備余液中的產(chǎn)物鄰氯扁桃酸可直接用乙酸乙酯萃取回收。為達(dá)到兩者的有效分離,首先采用氯仿對(duì)酶制備液中的R-(-)-乙?;徛缺馓宜徇M(jìn)行萃取分離,再對(duì)剩余的余液直接用乙酸乙酯進(jìn)行萃取,分離回收余液中的鄰氯扁桃酸。
2.3.2 萃取劑用量
表2 不同有機(jī)溶劑對(duì)R(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬妮腿⌒Ч?/p>
工業(yè)中采用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取時(shí),為了減少有機(jī)溶劑的用量,減少環(huán)境污染,降低成本,會(huì)采用最優(yōu)的萃取劑量進(jìn)行萃取,以期獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。因此對(duì)萃取劑氯仿在萃取過(guò)程中的使用量進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)考察了氯仿/制備液體積比在(1∶4) ~(2∶1)(即氯仿量為2.5~20mL)時(shí)對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿⌒Ч挠绊?,見(jiàn)圖8。結(jié)果表明,當(dāng)萃取劑氯仿的體積為10~20mL時(shí),對(duì)制備液中R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬妮腿⌒Ч颈3植蛔?,萃取收率大約在65%。隨著萃取劑體積的增加,萃取收率也不再提高;但萃取劑的體積低于10mL時(shí),由于萃取劑體積比的減小,影響了物質(zhì)在兩相中的分配,導(dǎo)致萃取收率下降。綜合考慮氯仿對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬妮腿』厥招Ч约斑^(guò)程中的能耗,宜選用等體積的氯仿(10mL)進(jìn)行萃取,在此條件下的萃取收率為65%。
圖8 氯仿用量對(duì)R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸萃取收率的影響
2.3.3 萃取溫度和時(shí)間
萃取過(guò)程中溫度的改變會(huì)導(dǎo)致萃取物的擴(kuò)散速度以及在兩相分配系數(shù)的改變,從而使萃取效果受到較大影響;萃取物在兩相中達(dá)到一個(gè)分配平衡的狀態(tài)需要一定的時(shí)間。因此,萃取時(shí)需考慮溫度和時(shí)間對(duì)萃取效果的影響,期望節(jié)約成本和能耗,并獲得最好的萃取收率。由于萃取的制備液中有Pseudomonassp. ECU1011脂肪酶的存在,考慮到在萃取過(guò)程中水解仍在緩慢進(jìn)行,為避免R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬倪M(jìn)一步損失,實(shí)驗(yàn)應(yīng)避開(kāi)酶催化反應(yīng)的最佳溫度(50℃),因此選取20~40℃的溫度范圍進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)。溫度以及時(shí)間對(duì)萃取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖9。結(jié)果表明:隨著萃取溫度的升高,萃取收率也在提高,而40℃時(shí)的萃取收率明顯高于其他兩個(gè)溫度下的萃取收率。同時(shí)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),同溫度下的萃取收率逐漸提高。當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)40min時(shí),萃取效果趨于穩(wěn)定。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇的萃取條件為:溫度40℃,時(shí)間40min。
圖9 萃取溫度和時(shí)間對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
2.3.4 萃取次數(shù)
根據(jù)前面確定的萃取條件,氯仿對(duì)制備液?jiǎn)未屋腿r(shí),R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬孜锏妮腿∈章蕛H為75%,為了進(jìn)一步提高萃取收率,研究考察了萃取次數(shù)對(duì)底物萃取效果的影響。在40℃的實(shí)驗(yàn)溫度下,采用等體積的氯仿進(jìn)行萃取,每次萃取時(shí)間均為40min。萃取次數(shù)對(duì)萃取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖10。結(jié)果表明:在相同的條件下,對(duì)酶制備液萃取不同次數(shù)后,底物R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬妮腿∈章首罡呖蛇_(dá)到94%。在第2次萃取后,萃取收率明顯升高;而當(dāng)萃取次數(shù)大于2次時(shí),萃取收率變化不大。因此,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中確定適宜的萃取次數(shù)為2次。
綜合考慮以上影響萃取效果的各因素,從節(jié)約成本和降低耗能的角度,確定R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的最優(yōu)萃取條件為:等體積的氯仿進(jìn)行萃取,萃取溫度為40℃,萃取次數(shù)2次,每次萃取時(shí)間均為40min。最終獲得的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬妮腿∈章蕿?6%。
2.4 產(chǎn)物鄰氯扁桃酸的萃取
圖10 萃取次數(shù)對(duì)R-(-)-乙?;徛缺馓宜彷腿∈章实挠绊?/p>
萃取劑篩選實(shí)驗(yàn)證明乙酸乙酯對(duì)鄰氯扁桃酸具有很好的分離效果(室溫萃取收率達(dá)到96%以上),因此采用等體積的乙酸乙酯直接對(duì)剩余液進(jìn)行萃取??紤]一次萃取可能無(wú)法達(dá)到完美的萃取效果,為了進(jìn)一步提高產(chǎn)物的萃取收率,將萃取次數(shù)提高到2次。最終獲得鄰氯扁桃酸產(chǎn)物的萃取收率為98%。
對(duì)溶劑萃取各條件進(jìn)行優(yōu)化后,進(jìn)一步考察了萃取過(guò)程對(duì)酶反應(yīng)混合物的實(shí)際分離效果。采用乙酸乙酯直接萃取酶法制備液得到的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岷袜徛缺馓宜岬幕旌衔颷圖11(a)]作為對(duì)照,在實(shí)驗(yàn)研究的最優(yōu)萃取條件下,通過(guò)氯仿萃取得到高純度的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬孜颷圖11(b)],萃取收率為96%。并通過(guò)乙酸乙酯萃取剩余液得到高純度的鄰氯扁桃酸產(chǎn)物[圖11(c)],萃取收率為98%。用液相色譜分別對(duì)3種萃取物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:采用氯仿和乙酸乙酯依次萃取后,可有效地分離R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸的混合物,兩者的純度均達(dá)到99.9%。
圖11 液相色譜檢測(cè)結(jié)果
采用以上實(shí)驗(yàn)獲得的優(yōu)化條件,最終得到R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的收率為80%,eeS>99.9%。
采用動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)方法對(duì)乙酰基鄰氯扁桃酸消旋體進(jìn)行拆分制備R-(-)-乙?;徛缺馓宜帷楂@得高產(chǎn)率光學(xué)純的R-(-)-乙?;徛缺馓宜幔瑢?shí)驗(yàn)對(duì)拆分反應(yīng)和消旋反應(yīng)過(guò)程分別進(jìn)行了條件優(yōu)化。在此優(yōu)化條件下,乙?;徛缺馓宜嵯w拆分獲得R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬漠a(chǎn)率為47%,對(duì)映體過(guò)量值ee>99%。將拆分后的混合物通過(guò)氯仿和乙酸乙酯進(jìn)行萃取分離后,將反應(yīng)得到的鄰氯扁桃酸進(jìn)行消旋化,經(jīng)過(guò)3h后就可獲得完全消旋化的鄰氯扁桃酸消旋體。將消旋體鄰氯扁桃酸轉(zhuǎn)化成乙?;馓宜嵯w原料后,繼續(xù)作為原料用于拆分反應(yīng)。反應(yīng)循環(huán)4次,最終得到的R-(-)-乙?;徛缺馓宜岬氖章蕿?0%。此試驗(yàn)研究打破了傳統(tǒng)動(dòng)力學(xué)拆分反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率低的局限,實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)率光學(xué)純R-(-)-乙酰基鄰氯扁桃酸的制備分離過(guò)程。
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R-(-)-acetyl-o-mandelic acid preparation via enzymatic dynamic kinetic resolution
SHEN Sasa1,JIANG Ling2,LU Jie1,YU Hongwei2
(1School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China;2School of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310028,Zhejiang,China)
In this study,asymmetric hydrolysis of acetyl chloromandelic acid was catalyzed byPseudomonassp. ECU1011,and theS-(-)-chloromandelic acid in the resolution mixture was then racemerized using the mutated mandelate racemase and fed back into the hydrolysis reaction after acylation,realizing enzymatic dynamic kinetic resolution for preparation ofR-(-)-acetyl chloromandelic acid. Firstly,the conditions for enzymatic resolution,separation of resolution mixture,and enzymatic racemization were optimized. Subsequently,dynamic kinetic resolution of acetyl chloromandelic acid was conducted under the optimal conditions,obtaining optically pureR-(-)-acetyl chloromandelic acid with final yield of 80%. The conditions for enzymatic resolution,chloromandelic acid recycling and racemization were optimized in this study,leading to preliminary establishment of the dynamic kinetic resolution process forR-(-)-acetyl chloromandelic acid preparation,with guiding significance for future industrial applications.
enzymatic dynamic kinetic resolution;Pseudomonassp. ECU1011 lipase;mandelate racemase;R-(-)-acetyl-o-mandelic acid;chloromandelic acid
TQ 463;Q 819
A
1000-6613(2014)09-2425-07
10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.032
2014-01-02;修改稿日期:2014-01-22。
國(guó)家自然科學(xué)基金(21176102、21176215、GZ935)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131100)、江蘇省環(huán)??蒲姓n題基金(2012004)及浙江省自然科學(xué)基金杰出青年基金(21076181)項(xiàng)目。
沈薩薩(1985—),女,碩士。E-mail sasashen@163.com。聯(lián)系人:陸杰,男,教授,從事結(jié)晶分離和藥物合成等研究。E-mail lujie@jiangnan.edu.cn。