宮磊，周麗，崔文璟，劉中美，周哲敏

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

攪拌槳組合數(shù)值模擬優(yōu)化及在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵中的應(yīng)用

宮磊，周麗，崔文璟，劉中美，周哲敏

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

攪拌是影響發(fā)酵過程的主要因素之一，組合不同類型攪拌槳、發(fā)揮其各自優(yōu)勢(shì)，勢(shì)必能夠優(yōu)化攪拌性能、提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)效率。本研究采用計(jì)算流體力學(xué)（CFD）方法，模擬六直葉渦輪槳（DT）和DT、DT和拋物線槳（BT6）、六斜葉槳（CM6）和DT以及CM6和BT6四種攪拌槳組合對(duì)流場(chǎng)和混合時(shí)間的影響。對(duì)模擬得到的混合時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，最優(yōu)組合為：上槳葉為CM6槳，下槳葉為BT6槳。吸水鏈霉菌WSH03-13產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（TG）的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CM6和BT6槳組合可獲得最高的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性和生物量，分別為4.7U/mL和42.9g/L，較優(yōu)化前（DT和DT槳）分別提高了53%和40.9%，說明優(yōu)化后的攪拌槳組合更有利于微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵。研究結(jié)果為組合攪拌槳在微生物發(fā)酵過程中的應(yīng)用提供了借鑒。

槳葉組合；數(shù)值模擬；谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶；發(fā)酵；計(jì)算流體力學(xué)

攪拌在微生物的發(fā)酵過程中不可或缺，主要體現(xiàn)在三個(gè)方面：①加強(qiáng)氣液傳質(zhì)和分散；②保持發(fā)酵液的均一穩(wěn)定，避免局部菌體或原料濃度過高；③使發(fā)酵過程中產(chǎn)生的熱量快速分散，維持發(fā)酵溫度的穩(wěn)定。不同類型的攪拌槳能夠在發(fā)酵罐中產(chǎn)生不同的流體形態(tài)、剪切力分布、湍流強(qiáng)度、氣含率分布等，進(jìn)而影響微生物的菌體形態(tài)、生物量甚至產(chǎn)物量。傳統(tǒng)的徑向流圓盤渦輪式攪拌槳湍流程度強(qiáng)，但存在著全罐混合差、槳葉區(qū)剪切力過強(qiáng)、能耗大等缺點(diǎn)。例如，六直葉渦輪槳DT槳和BT6槳屬于典型的徑流式槳。DT槳結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于加工，應(yīng)用較廣泛[1]，但在進(jìn)行氣液分散時(shí)會(huì)形成氣穴，氣穴的存在會(huì)降低槳葉的泵送能力和氣液傳質(zhì)能力[2]。多層槳葉組合，底層槳決定氣液分散效率，BT6槳葉采用拋物線設(shè)計(jì)，常被用作下槳葉來分散氣體，能避免氣體過早的從葉輪區(qū)上升逃逸，并能明顯降低氣穴的生成。另一方面，軸向流攪拌槳能改善全罐混合效果，且剪切力分布較均勻，但對(duì)高黏度流體的混合效果較徑向流槳差。CM6槳屬于軸向式流槳葉，對(duì)流體具有下壓作用，在實(shí)際發(fā)酵中可以增加通入氣體在流體中的停留時(shí)間，從而獲得更高的溶解氧，常被用作上槳葉。因此，將不同類型槳葉進(jìn)行組合，發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢(shì)，勢(shì)必改善攪拌效果。對(duì)攪拌槳的研究也逐漸從單一槳葉向組合優(yōu)化方向發(fā)展[3]。李艷等[4]對(duì)不同的槳葉組合在非牛頓流體中的各項(xiàng)特性進(jìn)行比較，得到一種最優(yōu)組合MBTD-MA315-MA315，在提高全罐傳氧效果、增強(qiáng)氣體分散和減少能耗等方面都有顯著優(yōu)越性。郝惠娣等[5]對(duì)自吸式攪拌槽中3種不同的槳葉（6P、6DT、6PDTU）進(jìn)行組合優(yōu)化，提高了氣含率和容積傳氧系數(shù)，更加有利于氣液兩相的傳質(zhì)。但未見DT、CM6和BT6三種槳葉組合提高發(fā)酵水平的報(bào)道。

計(jì)算流體力學(xué)（computational fluid dynamics，簡(jiǎn)稱CFD）是運(yùn)用計(jì)算機(jī)數(shù)值計(jì)算的方法來研究流體的運(yùn)動(dòng)、傳質(zhì)、傳熱等規(guī)律，它能夠預(yù)測(cè)不同實(shí)驗(yàn)條件下，反應(yīng)器內(nèi)部的流場(chǎng)情況[6]。與傳統(tǒng)半經(jīng)驗(yàn)半理論的方法相比，其在研究攪拌器方面有兩大優(yōu)勢(shì)：①節(jié)省時(shí)間和投入；②由于是計(jì)算機(jī)模擬，所以不受物理模型和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南拗?，并且能給出詳細(xì)的流場(chǎng)參數(shù)和一些實(shí)驗(yàn)中無法獲得的數(shù)據(jù)[7]。該方法在生物反應(yīng)器領(lǐng)域中的應(yīng)用，為攪拌槳的設(shè)計(jì)開辟了新的道路。

微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（microbial transglutaminase，EC.2.3.2.13，簡(jiǎn)稱MTG），能夠催化體外大部分的蛋白質(zhì)發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)反應(yīng)，從而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[8]。吸水鏈霉菌可發(fā)酵合成較高水平的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，然而發(fā)酵中后期，發(fā)酵液黏度較高，嚴(yán)重影響傳質(zhì)過程，不利于酶的合成。目前人們對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的研究多集中在生物化學(xué)方面，尚無通過攪拌槳組合優(yōu)化來提高攪拌效率，進(jìn)而提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵水平的報(bào)道。

本工作設(shè)計(jì)了DT+DT、DT+BT6、CM6+DT和CM6+BT6 4種槳葉組合形式，通過CFD模擬，研究其流體力學(xué)特征，并通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的發(fā)酵過程，對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料方法

1.1 物理模型

發(fā)酵罐為美國(guó)NBS公司BioFlow110發(fā)酵罐；DT槳為發(fā)酵罐自帶，CM6槳和BT6槳由常州西瑪公司提供（圖1）。

下槳葉距槽底距離為直徑的1/3[9]。實(shí)驗(yàn)中模擬的4種槳葉組合如圖2。

發(fā)酵罐及各個(gè)攪拌槳的尺寸參數(shù)如表1。

1.2 網(wǎng)格劃分

攪拌槳及發(fā)酵罐模型的建立、網(wǎng)格的劃分、邊界條件的確定均采用前處理軟件Gambit○R（Version 2.3，F(xiàn)luent Inc.，USA）。采用分區(qū)域網(wǎng)格劃分方法，槳葉區(qū)采用適應(yīng)性更好的四面體結(jié)構(gòu)化網(wǎng)格，并進(jìn)行加密處理；非槳葉區(qū)采用四面體與六面體相結(jié)合的網(wǎng)格方法。對(duì)不同的網(wǎng)格劃分方案進(jìn)行計(jì)算，得到網(wǎng)格無關(guān)解，確定網(wǎng)格方案。最終的網(wǎng)格數(shù)目分別為： DT+DT組合412328； DT+BT6組合503965；CM6+DT組合529200；CM6+BT6組合503279。

圖1 攪拌槳結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 不同槳葉組合示意圖

表1 發(fā)酵罐及槳葉參數(shù)

1.3 模擬方法

1.3.1 控制方程

流體的流動(dòng)遵循質(zhì)量守恒、能量守恒、動(dòng)量守恒三大定律以及流體的連續(xù)性方程[10]。本研究不考慮溫度的影響，因此不考慮能量守恒方程。

質(zhì)量守恒方程如式（1）。

該方程是質(zhì)量守恒方程的一般形式，適用于不可壓流和可壓流。Sm是廣義源項(xiàng)；ρ是密度；ui是速度矢量。

動(dòng)量守恒方程如式（2）。

式中，?代表張量積；ρ是密度；v是速度。

1.3.2 計(jì)算條件

使用FLUENT○R（Version 2.3，F(xiàn)luent Inc.，USA） 軟件進(jìn)行計(jì)算，液面為壓力出口，攪拌槳、擋板、罐體均為無滑移壁面。采用多重參考系法（multiple reference frame，MRF）處理動(dòng)槳葉和靜止罐體之間的相互作用，湍流模型為標(biāo)準(zhǔn)k-ε模型[11]。收斂標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為每步變量的殘差值小于10-4。

1.4 混合時(shí)間的測(cè)定方法

攪拌槳穩(wěn)定于某一轉(zhuǎn)速，采用鹽酸作為示蹤劑，在加料點(diǎn)處加入，計(jì)算機(jī)記錄發(fā)酵液pH值變化，直到pH值重新穩(wěn)定為止。從加入示蹤劑開始到pH值重新穩(wěn)定，這段時(shí)間記為混合時(shí)間[12]。

1.5 發(fā)酵條件和方法

1.5.1 菌種

吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.5.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：糊精20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，CaCl21g/L，MgSO42g/L，K2HPO42g/L，KH2PO42g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油15g/L，葡萄糖10g/L，玉米淀粉10g/L，蛋白胨15g/L，大豆粉20g/L，MgSO42g/L，Na2HPO42g/L，NaH2PO42g/L，CaCO35g/L。

1.5.3 發(fā)酵條件

吸水鏈霉菌孢子接種至50mL種子培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)28 h；以4%（體積比）接種量將種子接種至發(fā)酵罐，初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積4 L，初始pH值6.5，通氣量1.25 vvm[vvm表示單位液體體積在單位時(shí)間內(nèi)的通氣量，m3/(m3·min)]，攪拌槳轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián)（控制在200～600r/min），維持溶氧濃度在25%～30%。

1.5.4 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活測(cè)定方法

酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13]。一個(gè)單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活定義（U/mL）：37℃時(shí)每分鐘催化形成 1μmol L-谷氨酸-γ-單羥肟酸的酶量。

1.5.5 菌體干重測(cè)定方法

取15mL發(fā)酵液，10000r/min離心10min，去離子水洗3次，105℃烘干至恒重稱量。

2 結(jié)果和討論

2.1 4種槳型組合宏觀速度場(chǎng)比較

圖3 不同槳型組合的速度云圖

4種組合的宏觀速度場(chǎng)比較如圖3。由圖3可見，各種組合的高速區(qū)都集中在葉端。低轉(zhuǎn)速時(shí)，DT+DT組合與DT+BT6組合由于都為徑流槳組合，所產(chǎn)生的流體形態(tài)相似，全罐出現(xiàn)速度分層現(xiàn)象嚴(yán)重，整體速度較其他兩組小，而將上槳葉更換為軸流槳CM6之后，全罐的混合程度明顯提高，其中CM6+BT6組合的速度分布更加均勻；轉(zhuǎn)速提高后，DT+DT組合、DT+BT6組合與CM6+DT組合的速度分層現(xiàn)象并無較大改善，而CM6+BT6組合的速度場(chǎng)均勻程度明顯增加。綜上，CM6+BT6組合在高低轉(zhuǎn)速下都能產(chǎn)生更加均勻的速度場(chǎng)，并且隨著轉(zhuǎn)速的提高均勻程度增加。

2.2 4種槳型組合速度分布

由圖4可以看出轉(zhuǎn)速為600r/min時(shí)，DT+DT組合的流體流速有90%的區(qū)域集中在0.5m/s以下，且1m/s以上的高速區(qū)域很少；DT+BT6和CM6+DT兩種組合的流體流速絕大多數(shù)集中在0.25～0.75；而CM6+BT6組合有80%處在0.5～1m/s，且在高速區(qū)所占比例在4種槳葉組合中也是最高。這表明在相同轉(zhuǎn)速條件下，CM6+BT6組合能產(chǎn)生更高且更均勻的速度場(chǎng)分布。

2.3 混合時(shí)間比較

圖4 轉(zhuǎn)速600r/min時(shí)各組合罐內(nèi)速度分布

混合時(shí)間是表征攪拌槽內(nèi)流體混合狀況的重要參數(shù)，能夠反映攪拌槳的性能，指導(dǎo)攪拌反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及放大。物料的混合主要由主體流動(dòng)、湍流和分子擴(kuò)散3種機(jī)理共同作用[14]，而由不同的槳型產(chǎn)生的主體流動(dòng)影響尤為突出。

分別對(duì)4種組合的混合時(shí)間進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測(cè)定和數(shù)值模擬（圖5）。低轉(zhuǎn)速時(shí)，4種組合的混合時(shí)間相差較大，混合時(shí)間由DT+DT，CM6+DT，DT+BT6，CM6+BT6依次縮短。隨著轉(zhuǎn)速的提高而混合時(shí)間逐漸縮短，并且不同組合之間的差別縮小。模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)趨勢(shì)相吻合。

由不同轉(zhuǎn)速下的速度場(chǎng)分布（圖3）可見，低轉(zhuǎn)速時(shí)，流體的湍流程度較小，此時(shí)的流體形態(tài)對(duì)混合起主導(dǎo)作用。其中CM6與BT6的槳型組合混合時(shí)間最短，說明此種組合產(chǎn)生的主體流動(dòng)更有利于罐中流體的混合。當(dāng)轉(zhuǎn)速提高后，不同組合下流體的湍流程度都很大，此時(shí)湍流大小對(duì)混合起主導(dǎo)作用，各組合的混合時(shí)間趨向一致。表2給出模擬結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差比較，結(jié)果要優(yōu)于文獻(xiàn)值[15]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較模擬值要小，主要有幾方面原因：①模擬過程所用的標(biāo)準(zhǔn)k-ε模型是針對(duì)理想狀態(tài)流體，只適用于各項(xiàng)同性湍流，而實(shí)際情況下的流場(chǎng)一直在不斷的變化，這種流場(chǎng)的不穩(wěn)定可以促進(jìn)傳質(zhì)，縮短混合時(shí)間；②本研究槳葉區(qū)采用非結(jié)構(gòu)化網(wǎng)格，應(yīng)用此網(wǎng)格時(shí)，網(wǎng)格質(zhì)量會(huì)影響計(jì)算結(jié)果，導(dǎo)致出現(xiàn)誤差；③模擬所取的加料點(diǎn)跟監(jiān)測(cè)點(diǎn)會(huì)和實(shí)驗(yàn)有所差別。

圖5 混合時(shí)間比較

表2 混合時(shí)間模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差比較

圖6 不同槳葉組合發(fā)酵過程

2.4 不同組合對(duì)TG酶發(fā)酵的影響

4種不同槳葉組合的發(fā)酵結(jié)果如圖6。發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值存在先下降后上升的現(xiàn)象，是吸水鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的標(biāo)志[16]。

在吸水鏈霉菌發(fā)酵合成谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶過程中，在發(fā)酵的前中期，為了確保菌絲體的完整性，避免剪切力過大，轉(zhuǎn)速一般控制在200～400r/min；而在發(fā)酵中后期，菌體黏度很高，溶氧對(duì)生物量和產(chǎn)酶量影響很大，需要確保攪拌充分，轉(zhuǎn)速控制在600r/min。在這兩個(gè)階段，與對(duì)照槳相比，其他3種組合的流場(chǎng)速度更大、混合時(shí)間更短（圖3、圖5），所獲得的發(fā)酵結(jié)果也都優(yōu)于原始組合。其中CM6+BT6的組合獲得了最高的酶活和生物量，分別達(dá)到4.7U/mL和42.9g/L，較對(duì)照槳分別提高了53.0%和40.9%。

野生型吸水鏈霉菌WSH03-13最初的產(chǎn)酶水平僅為1.09U/mL。柏映國(guó)等[17]通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件將產(chǎn)酶水平大幅度提高至4.46U/mL（發(fā)酵40h時(shí)）。程力等[18]進(jìn)一步在發(fā)酵液中添加不同的添加劑，最終將酶活提高至6.61U/mL。本工作以吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵為例，考察攪拌槳組合優(yōu)化對(duì)發(fā)酵過程的影響，僅通過攪拌槳組合優(yōu)化，同樣較大幅度地提高了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)酶水平，并縮短發(fā)酵周期至30 h左右，提高了其生產(chǎn)強(qiáng)度。這一優(yōu)化方式對(duì)其他發(fā)酵過程有一定的借鑒意義。

圖7 酶活和生物量比較

3 結(jié) 論

（1）與DT+DT、DT+BT6、CM6+DT槳葉組合相比，CM6+BT6組合在低轉(zhuǎn)速和高轉(zhuǎn)速下都能產(chǎn)生更加均勻的速度場(chǎng)，并且隨著轉(zhuǎn)速的提高均勻程度增加。

（2）在相同轉(zhuǎn)速條件下，CM6+BT6組合形成的流體集中分布于更高速度區(qū)。

（3）在低轉(zhuǎn)速條件下，CM6+BT6的混合時(shí)間明顯小于其他槳葉組合；在高轉(zhuǎn)速條件下，各個(gè)組合的混合時(shí)間趨向一致。

（4）用CM6+BT6組合進(jìn)行吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵，所獲得的最大酶活與最大生物量比原始組合（DT+DT槳）分別提高了53.0%和40.9%，且優(yōu)于其他槳葉組合。

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Numerical simulation of different impellers and its effect on transglutaminase fermentation process

GONG Lei，ZHOU Li，CUI Wenjing，LIU Zhongmei，ZHOU Zhemin
（State Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Agitation is one of the main factors affecting fermentation process. To take advantage of advantages of individual impellers，impeller combination is necessary in improving agitation and fermentation efficiency. Four different impeller combinations (DT and DT，DT and BT6，CM6 and DT as well as CM6 and BT6) were simulated with the commercial fluid dynamics (CFD) software Fluent and their flow patterns and mixing times were compared. Mixing time was also validated by experiments. The optimal combination was the CM6 (upper impeller) and BT6 (lower impeller). Using this impeller combination，the maximal transglutaminase activity and biomass ofStreptomyces hygroscopicusWSH03-13 reached 4.7U/mL and 42.9g/L respectively，which were 53% and 40.9% higher than the control group (DT and DT). The optimized impeller combination could promote microbial growth and fermentation process. The results in this study will be useful for further application of impeller combination in microbial fermentation.

impeller combination；numerical simulation；transglutaminase；fermentation；computational fluid dynamics

TQ 027.2

A

1000-6613（2014）10-2570-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.10.009

2014-01-17；修改稿日期：2014-02-22。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31070711）及教育部科學(xué)技術(shù)研究重大項(xiàng)目（311023）。

宮磊（1988—），男，碩士研究生。E-mail gonglei0113@ 163.com。聯(lián)系人：周哲敏，博士，教授，研究方向?yàn)槊笇W(xué)與酶工程。E-mail zheminzhou@jiangnan.edu.cn。