黎 曄 吳共發(fā) 陳 勍

（增城市人民醫(yī)院；1中山大學(xué)附屬博濟(jì)醫(yī)院婦科，2病理科，廣東 511300；3中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦科，廣州 510120）

子宮內(nèi)膜樣腺癌是婦科常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著女性的健康，其發(fā)病原因及機(jī)制至今尚未闡明。GDF－15又稱巨噬細(xì)胞抑制因子－1（macrophage inhibitory cytokine－1，MIC－1），是人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming group factor－β，TGF－β）超家族的一個(gè)重要成員。近年來大量研究表達(dá)血清GDF－15水平在多種腫瘤患者中顯著增高，并與部分腫瘤患者的預(yù)后和生存期密切相關(guān)，顯示出GDF－15具有作為腫瘤標(biāo)志物的重要潛能［1－3］。在多種上皮源性的腫瘤組織中，GDF－15過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，功能研究發(fā)現(xiàn)其可以通過多種信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)和抑制瘤的雙重作用［4－6］。GDF－15在子宮內(nèi)膜癌患者血清中明顯升高，可以作為子宮內(nèi)膜癌的血清標(biāo)志物，且其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和差的預(yù)后相關(guān)［7］。但GDF－15蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)及與子宮內(nèi)膜樣腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系未見報(bào)道。本文采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)GDF－15在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)情況，探討GDF－15在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的臨床意義。

材料和方法

1.標(biāo)本來源

收集增城市人民醫(yī)院病理科2008年1月1日至2012年12月30日存檔的21例子宮內(nèi)膜樣腺癌患者和購自上海芯超生物科技有限公司的31例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織芯片（陣列編號(hào)OD－CT－RpUtr03－002），共計(jì)子宮內(nèi)膜樣腺癌52例，患者年齡36－77歲，平均53.7±13.4歲，未絕經(jīng)32例，已絕經(jīng)20例；手術(shù)－病理分期統(tǒng)一采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009年修訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新評(píng)估，其中I期24例，Ⅱ期17例、Ⅲ期11例；浸潤(rùn)深度＜1/2肌層組32例，≥1/2肌層組20例；病理分級(jí)GI組10例，G2組28例，G3組14例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，轉(zhuǎn)移者19例。另外選取30例相對(duì)正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照組，其中增生期子宮內(nèi)膜22例，分泌期子宮內(nèi)膜8例，患者年齡27－79歲，平均49.9±15.4歲，兩組患者年齡差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有病例均經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的臨床和病理醫(yī)師確診，選擇的研究對(duì)象在診刮或手術(shù)之前均無激素替代治療及放化療病史。

2.組織芯片制作及免疫組織化學(xué)檢測(cè)

本院存檔的21例子宮內(nèi)膜樣腺癌和30例相對(duì)正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本的組織芯片制作方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［8］，SP法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；GDF－15兔抗人多克隆抗體（購自北京博奧森生物科技有限公司）。免疫組織化學(xué)方法按試劑盒說明書操作，GDF－15抗體的工作濃度為1：50，0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，SP法檢測(cè)試劑盒，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。已知陽性片的切片作陽性對(duì)照，PBS取代一抗作陰性對(duì)照。

3.結(jié)果判斷

GDF－15染色陽性為細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色至棕褐色，400倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察細(xì)胞陽性情況，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：首先將染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，再將陽性細(xì)胞所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%－50%，3分為51%－75%，4分為＞75%，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積＞3分為免疫反應(yīng)陽性［9］。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，GDF－15表達(dá)情況與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關(guān)系采用Pearson卡方檢驗(yàn)分析，雙變量相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.組織芯片制作效果

根據(jù)HE鏡下形態(tài)確定癌所在位置，定位后取其制成組織芯片，制作完成后的芯片陣列整齊，每個(gè)芯片大小一致，經(jīng)HE染色驗(yàn)證每個(gè)芯片均取點(diǎn)正確，能代表所在組織（圖1）。

2.GDF－15在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)

GDF－15陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈淡黃色至棕褐色顆粒樣物質(zhì)（圖2）。正常子宮內(nèi)膜中GDF－15大部分病例呈陰性表達(dá)，30例正常子宮內(nèi)膜組織中僅2例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率是6.7%，在52例子宮內(nèi)膜樣腺癌中有36例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率是69.2%（36/52），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理正常子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜樣腺癌的GDF－15陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝29.947，P＝0.000）。

3.GDF－15與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

子宮內(nèi)膜樣腺癌組織GDF－15陽性表達(dá)率在癌組織浸潤(rùn)深度達(dá)≥1/2肌層組為90.0%（18/20），明顯高于浸潤(rùn)深度＜1/2肌層組的陽性表達(dá)率56.3%（18/32，χ2＝6.581，P＝0.010）；在FIGO分期Ⅲ以上癌組織中GDF－15陽性表達(dá)率為100%（11/11），顯著高于在Ⅰ－Ⅱ期癌組織中陽性表達(dá)率61.0%（25/41，χ2＝6.201，P＝0.013）；GDF－15在出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率為89.5%（17/19），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率57.6%（19/33，χ2＝5.759，P＝0.016）；年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤最大直徑、病理學(xué)分級(jí)均與 GDF－15表達(dá)無關(guān)（分別 χ2＝0.022，P＝0.882；χ2＝1.300，P＝0.254；χ2＝1.781，P＝0.410；χ2＝2.373，P＝0.305，表1）。

圖1 組織芯片外觀及HE染色驗(yàn)證A：組織芯片外觀；B：經(jīng)過HE染色后的組織芯片F(xiàn)ig.1 The appearanc of tissue microarray and validation by HE stainingA：The appearanc of tissue microarray；B：The tissue microarray was verified by HE staining

表1 子宮內(nèi)膜樣腺癌GDF－15的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table1 Relationship of GDF－15expression with clinical pathological charateristics in endometrioid adenocarcinoma

圖2 免疫組化檢測(cè)GDF－15在子宮正常內(nèi)膜和內(nèi)膜樣腺癌組織芯片中的表達(dá)情況。SP兩步法×200A：GDF－15在絕大部分正常子宮內(nèi)膜呈陰性表達(dá)；B：GDF－15在高分化子宮內(nèi)膜樣腺癌表達(dá)；C：GDF－15在中分化子宮內(nèi)膜樣腺癌表達(dá)；D：GDF－15在低分化子宮內(nèi)膜樣腺癌表達(dá)。Fig.2 The expression of GDF－15in endometrioid adenocarcinoma and normal endometrium tissue array by immunohistochemistry.SP method×200A：The expression of GDF－15in most cases with normal endometrium was negative；B：The expression of GDF－15in Well－differentiated endometrial adenocarcinoma；C：The expression of GDF－15in moderately differentiated endometrial adenocarcinoma；D：The expression of GDF－15in poorly differentiated endometrial adenocarcinoma.

討 論

子宮內(nèi)膜癌又稱子宮體癌，是由子宮內(nèi)膜腺體上皮發(fā)生的惡性腫瘤，為女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)。在我國(guó)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率目前僅次于子宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)癌癥的第二位［10］，且有逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害女性健康。在子宮內(nèi)膜癌的病理類型中，子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生率最高，占80%－90%，并且其在子宮內(nèi)膜癌中具有較好的預(yù)后［11－12］。子宮內(nèi)膜樣腺癌作為一種病因尚不明確的疾病，目前懷疑其發(fā)生可能與長(zhǎng)期持續(xù)的雌激素刺激以及肥胖、高血壓、糖尿病、不孕不育或絕經(jīng)延遲等特殊體質(zhì)相關(guān)，但迄今相關(guān)的研究依舊不能很好的解釋子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)病過程。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，人子宮內(nèi)膜樣腺癌GDF－15蛋白表達(dá)的相關(guān)研究未見報(bào)道，因此我們進(jìn)行了本項(xiàng)研究，以期提高該病的臨床診斷率，正確評(píng)估預(yù)后及尋找新的治療靶點(diǎn)。GDF－15作為一種細(xì)胞因子作用于細(xì)胞表面的TGF－β受體，廣泛參與細(xì)胞凋亡、分化、增殖和機(jī)體炎癥反應(yīng)的信號(hào)傳遞，并在抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡、維持胎盤功能和胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)和保護(hù)中樞神經(jīng)等方面具有重要作用［13］。在正常生理情況下，GDF－15在胎盤組織中高表達(dá)，在前列腺、結(jié)腸、腎、腦、肝和胰腺等組織呈極低表達(dá)［14］。病理狀態(tài)下如急性損傷、炎癥和腫瘤，GDF－15表達(dá)可顯著提高［15］。大量研究顯示，GDF－15在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著雙重作用，而究竟是促進(jìn)還是抑制則取決于腫瘤的病理類型、分類以及腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境等［16－17］。在多種實(shí)體腫瘤的組織和血清中，包括前列腺癌［18－19］、結(jié)直 腸癌［20－21］、胃癌［22－23］、卵巢癌［24－25］、胰 腺 癌［26－28］、黑 素 瘤［29－30］、乳 腺 癌［3］、食 管癌［31－32］和 口 腔 鱗 癌［33－34］，這 些 眾 多 的 研 究 表 明GDF－15有望成為新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道GDF－15在子宮內(nèi)膜癌患者血清中明顯升高，可以作為子宮內(nèi)膜癌的血清標(biāo)志物，且其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和差的預(yù)后相關(guān)［7］，但GDF－15蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)及與子宮內(nèi)膜樣腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系未見報(bào)道。

本文采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)GDF－15在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)，結(jié)果顯示GDF－15在子宮內(nèi)膜樣腺癌和正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達(dá)率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，說明GDF－15在子宮內(nèi)膜樣腺癌中表達(dá)比正常子宮內(nèi)膜組織明顯增多。本研究還統(tǒng)計(jì)分析了GDF－15與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GDF－15陽性表達(dá)在浸潤(rùn)深度≥1/2肌層組高于＜1/2肌層組，在FIGO分期Ⅲ以上組高于Ⅰ－Ⅱ期組，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，而年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤最大直徑、病理學(xué)分級(jí)均與GDF－15表達(dá)無關(guān)。本研究結(jié)果說明GDF－15與子宮內(nèi)膜樣腺癌的癌細(xì)胞肌層浸潤(rùn)深度、臨床分期和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，癌細(xì)胞的肌層浸潤(rùn)越深以及臨床分期的增高和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均是惡性進(jìn)展的指征，表明腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移能力，由此提示GDF－15與子宮內(nèi)膜樣腺癌的生物學(xué)行為關(guān)系密切，檢測(cè)其表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的發(fā)展及預(yù)后的判斷有重要參考價(jià)值。并有可能為子宮內(nèi)膜樣腺癌的靶向治療提供一個(gè)新的候選靶點(diǎn)。

［1］Brown DA，Hance KW，Rogers CJ，et al.Serum macrophage inhibitory cytokine－1 （MIC－1/GDF15）：apotential screening tool for the prevention of colon cancer？Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21（2）：337－346.

［2］Staff AC，Bock AJ，Becker C，et al.Growth differentiation factor－15as a prognostic biomarker in ovarian cancer.Gynecol Oncol，2010，118（3）：237－243

［3］Welsh JB，Sapinoso LM，Kern SG，et al.Large－scale delineation of secreted protein biomarkers overexpressed in cancer tissue and serum.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（6）：3410－3415

［4］Griner SE，Joshi JP，Nahta R，et al.Growth differentiation factor 15stimulates rapamycin－sensitive ovarian cancer cell growth and invasion.Biochem Pharmacol，2013，85（1）：46－58

［5］Shimizu S，Kadowaki M，Yoshioka H，et al.Proteasome inhibitor MG132induces NAG－1/GDF15expression through the p38MAPK pathway in glioblastoma cells.Biochem Biophys Res Commun，2013，430（4）：1277－1282

［6］Park YJ，Lee H，Lee JH.Macrophage inhibitory cytokine－1transactivates ErbB family receptors via the activation of Src in SK－BR－3human breast cancer cells.BMB Rep，2010，43（2）：91－96

［7］Staff AC，Trovik J，Eriksson AG，et al.Elevated plasma growth differentiation factor－15correlates with lymph node metastases and poor survival inendometrial cancer.Clin Cancer Res，2011，17（14）：4825－4833

［8］漆楚波，朱潤(rùn)慶，夏和順等.組織芯片建議制作方法及免疫組化的有效性分析.腫瘤防治研究，2007，34（8）：629－632

［9］許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)果的判斷標(biāo)準(zhǔn).中國(guó)癌癥雜志，1996，6（4）：229－231

［9］Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Estimating the world cancer burden：Globocan 2000.Int J Cancer，2001，94（2）：153－156

［10］易曉芳，鄭文新.子宮內(nèi)膜癌的分型及其臨床意義.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2008，1（24）：15－19

［11］Lee CM，Szabo A，Shrieve DC，et al.Descriptive nomograms of adjuvant radiotherapy use and patterns of care analysis for stage I and II endometrial adenocarcinoma：a surveillance，epidemiology，and end results population study.Cancer，2007，110（9）：2092－2100

［12］Creasman WT，Odicino F，Maisonneuve P，et al.Carcinoma of the corpus uteri.FIGO 26th Annual Report on the Results of Treatment in Gynecological Cancer.Int J Gynaecol Obstet，2006，95（Suppl 1）：S105－S143

［13］Lee DH，Yang Y，Lee SJ，et al.Macrophage inhibitory cytokine－1induces the invasiveness of gastric cancer cells by up－regulating the urokinase－type plasminogen activator system.Cancer Res，2003，63（15）：4648－4655

［14］Lawton LN，Bonaldo MF，Jelenc PC，et al.Identification of a novel member of the TGF－beta superfamily highly expressed in human placenta.Gene，1997，203（1）：17－26

［15］Bauskin AR，Brown DA，Kuffner T，et al.Role of macrophage inhibitory cytokine－1in tumorigenesis and diagnosis of cancer.Cancer Res，2006，66（10）：4983－4986

［16］Mimeault M，Batra SK.Divergent molecular mechanisms underlying the pleiotropic functions of macrophage inhibitory cytokine－1in cancer.J Cell Physiol，2010，224（3）：626－635

［17］Vaňhara P，Hampl A，Kozubík A，et al.Growth/differentiation factor－15：prostate cancer suppressor or promoter？Prostate Cancer Prostatic Dis，2012，15（4）：320－328

［18］Brown DA，Lindmark F，Stattin P，et al.Macrophage inhibitory cytokine 1：a new prognostic marker in prostate cancer.Clin Cancer Res，2009，15（21）：6658－6664

［19］Selander KS，Brown DA，Sequeiros GB，et al.Serum macrophage inhibitory cytokine－1concentrations correlate with the presence of prostate cancer bone metastases.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007，16（3）：532－537

［20］Brown DA，Ward RL，Buckhaults P，et al.MIC－1serum level and genotype：associations with progress and prognosis of colorectal carcinoma.Clin Cancer Res，2003，9（7）：2642－2650

［21］Xue H，LüB，Zhang J，et al.Identification of serum biomarkers for colorectal cancer metastasis using a differential secretome approach.J Proteome Res，2010，9（1）：545－555

［22］Badreddine R，Wang KK.Biomarkers in gastrointestinal cancers.Am J Gastroenterol，2008，103（8）：2106－2110

［23］Baek KE，Yoon SR，Kim JT，et al.Upregulation and secretion of macrophage inhibitory cytokine－1（MIC－1）in gastric cancers.Clin Chim Acta，2009，401（1－2）：128－133

［24］Staff AC，Bock AJ，Becker C，et al.Growth differentiation factor－15as a prognostic biomarker in ovarian cancer.Gynecol Oncol，2010，118（3）：237－243

［25］Bock AJ，Stavnes HT，Kempf T，et al.Expression and clinical role of growth differentiation factor－15in ovarian carcinoma effusions.Int J Gynecol Cancer，2010，20（9）：1448－1455

［26］Koopmann J，Buckhaults P，Brown DA，et al.Serum macrophage inhibitory cytokine 1as a marker of pancreatic and other periampullary cancers.Clin Cancer Res，2004，10（7）：2386－2392

［27］Koopmann J，Rosenzweig CN，Zhang Z，et al.Serum markers in patients with resecTablepancreatic adenocarcinoma：macrophage inhibitory cytokine 1versus CA19－9.Clin Cancer Res，2006，12（2）：442－446

［28］Liang JJ，Kimchi ET，Staveley－O＇Carroll KF，et al.Diagnostic and prognostic biomarkers in pancreatic carcinoma.Int J Clin Exp Pathol，2009，2（1）：1－10

［29］Huh SJ，Chung CY，Sharma A，et al.Macrophage inhibitory cytokine－1regulates melanoma vascular development.Am J Pathol，2010，176（6）：2948－2957

［30］de Wit NJ，Rijntjes J，Diepstra JH，et al.Analysis of differential gene expression in human melanocytic tumour lesions by custom made oligonucleotide arrays.Br J Cancer，2005，92（12）：2249－2261

［31］付超，王小兵，田海梅等.食管癌患者血清中巨噬細(xì)胞抑制因子－1水平檢測(cè)的意義.癌癥進(jìn)展，2011，9（4）：389－392

［32］賀飛，劉宇瓊，李惠翔.MIC－1和uPA在食管鱗癌中蛋白表達(dá)的相關(guān)性及臨床病理意義.世界華人消化雜志，2010，18（26）：2762－2767

［33］Zhang L，Yang X，Pan HY，et al.Expression of growth differentiation factor 15is positively correlated with histopathological malignant grade and in vitro cell proliferation in oral squamous cell carcinoma.Oral Oncol，2009，45（7）：627－632

［34］Schiegnitz E，K?mmerer PW，Koch FP，et al.GDF 15 as an anti－apoptotic，diagnostic and prognostic marker in oral squamous cell carcinoma.Oral Oncol，2012，48（7）：608－614