黃 銳 劉 敏 侯良芹 熊克仁

（皖南醫(yī)學院人體解剖學教研室，蕪湖 241000）

Gas7基因是1998年Ju等［1］從去血清的小鼠成纖維細胞中分離出來的，屬于Gas基因家族中的一員，但由于Gas基因家族各成員之間沒有序列同源性，因此各自具有不同的生物學特性。Gas7可特異性高表達于大鼠小腦的浦肯野纖維細胞，并能促進PC12細胞向終末方向發(fā)育和分化［1，2］。目前已知Gas7廣泛表達于軟骨、腎臟、心臟、視網膜等部位，在神經系統(tǒng)中如脊髓、海馬等部位也有表達［3－6］，但Gas7在梨狀皮質發(fā)育過程中的表達國內外尚未見報道。梨狀皮質作為嗅覺傳導系統(tǒng)的初級皮質中樞，也參與癲癇［7］等疾病的病理過程，其作為邊緣系統(tǒng)的組成部分與一些腦區(qū)有著廣泛而復雜的聯(lián)系，研究梨狀皮質的發(fā)育特點及梨狀皮質在發(fā)育中的調控因子有利于豐富其基因調控網絡，同時也有助于解釋梨狀皮質相關疾病的病理過程及發(fā)病機制。

材料和方法

1.實驗動物與分組

將孕鼠處死，取胚胎18.5天（E18.5）、E20.5大鼠，取生后當天（P0）、生后第7天（P7）、P14、P21和成年（Adult）大鼠。實驗組大鼠分為E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21以及Adult共七個不同時期組，每組12只，其中6只用于RT－PCR實驗，6只用于免疫組化實驗。

2.主要實驗試劑

山羊抗Gas7一抗購自Santa Cruz公司，生物素標記兔抗山羊IgG與HRP－DAB增強型顯色劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，TRNzol－A＋總RNA提取試劑與Quant cDNA第一鏈合成試劑盒及PCR試劑盒均購自北京天根生化公司，大鼠Gas7和β－actin引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，D2000Marker購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

3.RT－PCR方法

將E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21和 Adult組大鼠處死，取大鼠梨狀皮質，按照RNA提取試劑盒說明書提取各組大鼠總RNA，通過紫外分光光度計檢測各組RNA濃度，每組按1μg的RNA量按照逆轉錄試劑盒說明書轉錄成cDNA，放于－20℃冰箱備用。Gas7目的條帶為492bp，其上游引物為5＇－AAGAAGAGTCTGGCCGATGA－3＇，其 下 游 引 物 5＇－CTCGACTGTGCTTTGGTTGA－3＇；β－actin作為內參，擴增后的目的條帶為282bp，其上游引物為5＇－CAGGCACCAGGGCGT－3＇，下 游 引 物 為 5＇－ATGGCTGGGGTGTTGAAG－3＇。構建50μl PCR反應體系：10×Taq buffer（mg2＋Plus）5μl，dNTP mixture 4μl，上下游引物各1μl，cDNA 2μl，ddH2O 36.7μl和Taq DNA Polymerase 0.3μl。Gas7的擴增程序為：95℃預變性3min，后接34個循環(huán)，每一循環(huán)條件為94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s；β－actin的擴增程序為：95℃預變性3min，后接29個循環(huán)，每一循環(huán)條件為94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s。每組取5μl擴增產物，以D2000Marker作為參照，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)對所得結果進行拍照，并測定各組不同時期大鼠梨狀皮質Gas7和β－actin產物條帶的光密度值（OD值），換算得出光密度校正值，即樣品OD值/βactin OD值，并對所得數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。

4.免疫組織化學方法

孕鼠和生后鼠按50mg/kg戊巴比妥鈉深度麻醉后，從孕鼠腹中取出胚胎鼠，E18.5至P0鼠直接斷頭取腦，P7至成年鼠經左心室快速滴注0.9%生理鹽水，再快速輸入1%多聚甲醛與1.25%戊二醛的0.1mol/L磷酸緩沖液進行灌注固定，后開顱取腦，入4℃4%多聚甲醛固定液中固定24h，常規(guī)經梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，取梨狀皮質區(qū)進行連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，60℃烤片2h，備染。將組織切片脫蠟至水，3%H2O2封閉12min，以滅活內源性過氧化物酶；雙蒸水洗三次，每次5min，0.01mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）微波抗原修復10min，自然冷卻至常溫；0.02mol/L PBS洗3次，每次5分鐘，5%BSA 37℃封閉30min；甩去多余液體，不洗，滴加山羊來源Gas7一抗（1∶100），4℃冰箱過夜；37℃復溫1h，0.02mol/L PBS洗3次，每次5min，滴加生物素標記的兔抗山羊二抗IgG（1∶200），37℃孵育30min；0.02mol/L PBS洗3次，每次5min，滴加SABC 37℃孵育30min；0.02mol/L PBS洗4次，每次5min，DAB顯色5－10min，依次經梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，Olympus顯微鏡拍片。每只大鼠取2張400倍視野梨狀皮質部位切片，測算單位面積平均灰度值和陽性細胞數(shù)，分別取平均值作為該大鼠的平均灰度值和陽性細胞數(shù)值。

5.統(tǒng)計學處理

用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)值變量資料以±s表示，對結果進行方差分析，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05，P＜0.05作為判定有統(tǒng)計學意義的依據。

結 果

1.RT－PCR檢測各期大鼠梨狀皮質Gas7核酸的表達

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖像（圖1）所示，在各組均可見Gas7 492bp條帶和β－actin 282bp條帶，條帶清晰，各組表達穩(wěn)定。從對各組Gas7與β－actin條帶光密度校正值的半定量結果分析所得曲線圖（圖2）可以看出，從E18.5到P14呈增強趨勢，在P14達到峰值，而P14到Adult則呈下降趨勢（P＜0.05）。說明Gas7核酸在P14時大鼠梨狀皮質表達最強，之后表達減弱。

圖1 大鼠梨狀皮質不同時期 Gas7核酸瓊脂糖電泳圖1：DNA－Marker 2：Adult 3：P21 4：P14 5：P7 6：P0 7：E20.5 8：E18.5Fig.1 Gas7nucleic acid in the piriform cortex of rat during different developmental stages on agarose electropherogram.1：DNA－Marker 2：Adult 3：P21 4：P14 5：P7 6：P0 7：E20.5 8：E18.5

圖2 Gas7核酸在大鼠梨狀皮質不同時期的表達 ；＊：與前一時間點相比，P＜0.05Fig.2 The Expression of Gas7in the piriform cortex of rat during different developmental stages.＊：Compared with former time point，P＜0.05

2.免疫組織化學方法檢測Gas7蛋白在各期大鼠梨狀皮質的分布（圖3－5）

E18.5和E20.5時梨狀皮質出現(xiàn)棕黃色Gas7免疫陽性顆粒沉積，表現(xiàn)為斑片狀或絮狀結構，著色較淡；P0時在梨狀皮質出現(xiàn)Gas7免疫陽性細胞輪廓，細胞境界不太清晰，隱約可見細胞突起，著色加深（P＜0.05）；至P7時，出現(xiàn)形態(tài)較為規(guī)則Gas7免疫陽性細胞，并可見細胞突起，細胞體積較大，主要為細胞胞漿、胞膜以及細胞突起著色，著色深于P0（P＜0.05），細胞核不著色呈空泡狀；與P7比較，P14時Gas7免疫陽性細胞數(shù)量明顯增多（P＜0.05），細胞體積增大，輪廓清楚，細胞突起多見，結構清晰，細胞胞漿、胞膜和突起深染，著色深于之前幾個時期（P＜0.05）；與P14相比，P21時 Gas7免疫陽性細胞數(shù)減少，細胞著色減弱（P＜0.05），突起有所減少，細胞形態(tài)變化不明顯；到Adult時，Gas7免疫陽性細胞數(shù)目少于P21（P＜0.05），突起數(shù)目較少。

圖3 大鼠不同發(fā)育時期梨狀皮質Gas7免疫陽性產物的平均灰度值；﹡：與前一時間點相比，P＜0.05Fig.3 Gas7immunoreactive products average gray value in the piriform cortex of rat during different developmental stages.＊：Compared with former time point，P＜0.05

圖4 大鼠不同發(fā)育時期梨狀皮質Gas7免疫陽性細胞數(shù)；﹡：與前一時間點相比，P＜0.05Fig.4 Gas7positive cells in the piriform cortex of rat during different developmental stages.＊ ：Compared with former time point，P＜0.05

圖5 Gas7在不同發(fā)育時期大鼠梨狀皮質中的分布，SABC法×400。A～G：E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21和Adult時，Gas7在梨狀皮質的表達；標尺A～G＝50μmFig.5 Distribution of the Gas7immunoreactivities in the piriform cortex of rat during different developmental stages.SABC immunohistochemical staining×400.A～G：Expression of Gas7in the piriform cortex of rats on E18.5、E20.5、P0、P7、P14、P21and Adult.A～G bar＝50μm

討 論

梨狀皮質位于大腦腹側面的外側端，在嗅溝和外側嗅束之間，屬于大腦邊緣系統(tǒng)結構。在形態(tài)上，梨狀皮質分為前部和后部，兩者之間的邊界位于前連合水平，梨狀皮質前部發(fā)出的纖維向尾部投射分為淺深兩層，淺層經分子層投射至內嗅皮質，深層的纖維投射到梨狀皮質深部以及杏仁基底核與外側核，兩部分又可向內側投射纖維至嗅結節(jié)、斜角帶核、連合前海馬、下丘腦外側區(qū)和視前外側區(qū)［8］。有研究報道［9］嗅球僧帽細胞層發(fā)出的纖維，直接投射到同側的梨狀皮質區(qū)，并且梨狀皮質還發(fā)出遠心纖維，經外側嗅束注入嗅前核與嗅球的內顆粒層。梨狀皮質與周圍腦區(qū)廣泛的纖維聯(lián)系是其行使正常的生理功能和參與多種疾病病理過程的結構基礎，梨狀皮質在發(fā)育過程中其神經元的遷移、突起的延伸、突觸的構建受到多種基因的調控，因此發(fā)掘梨狀皮質在發(fā)育過程中新的調控因子不但有利于豐富其基因網絡甚至可以為梨狀皮質相關疾病提供潛在的治療靶點。

本實驗通過RT－PCR法對Gas7核酸的表達和免疫組織化學染色法對Gas7蛋白組織學定位進行觀察，結果表明大鼠梨狀皮質在各個時期均有Gas7表達，但在P14時表達最強。梨狀皮質的神經元是由室管膜下層的神經母細胞通過增殖、分化和遷移演變而來。這些神經元到達預定位置后，還將伴隨軸突的延伸、突觸的構建，從而與其他神經元之間建立纖維聯(lián)系，這些過程一直要持續(xù)到生后2～3周［10］。神經元軸突生長、運動、延伸和突觸的構建等生物學過程是由細胞骨架所介導的。神經元軸突頂端的生長錐伸出的片狀偽足和絲狀偽足都含有纖維性肌動蛋白，它們與肌動蛋白分子結合成細胞骨架，具有高度的動態(tài)性，是軸突生長的結構基礎［11］。Gas7作為肌動蛋白結合蛋白，與PSTPIP家族具有同樣的結構［12］，即羧基端的雙螺旋（coiled－coil，CC）結構域，其可與F－actin結合，使F－actin向細胞膜處聚集，并與胞膜下豐富的纖維絲聚集交聯(lián)成網，并進一步誘發(fā)突起的延伸、突觸體積的增大，在實驗中觀察到Gas7免疫陽性產物呈棕黃色顆粒狀主要沉積于神經元胞膜和胞漿中。目前認為Gas7與大多數(shù)PCH（Pombe Cdc15homology）蛋白具有同樣的結構域［13］，即FCH 結構域（Fes/CIP4Homology），具有FCH結構域的蛋白往往能夠調節(jié)細胞骨架的重構，并能參與細胞內囊泡運輸及胞吞作用［14］，提示Gas7可能具有調節(jié)細胞骨架重構及細胞內囊泡運輸?shù)壬磉^程。Chuck等［15］通過研究發(fā)現(xiàn)人類Gas7蛋白有Gas7a和Gas7b兩個亞型，其中Gas7a基因具備FCH結構域，能夠誘發(fā)生長錐中片狀偽足的形成，進一步參與細胞骨架的重組；Gas7b基因含有WW和FCH結構域，能夠誘發(fā)生長錐中絲狀偽足的形成，可以與其他蛋白結構域連接參與細胞信號的轉導，并調節(jié)細胞骨架的重構，由此可見Gas7作為肌動蛋白依賴蛋白或肌動蛋白相關蛋白可能在生長錐的形成和動態(tài)性方面起著重要的作用［16］。

本實驗結果提示P14時梨狀皮質發(fā)育達到高峰，神經元遷移已基本完成，細胞形態(tài)也基本穩(wěn)定，P14以后至成年，梨狀皮質神經元發(fā)育接近成熟，Gas7免疫陽性產物表達也逐漸減弱，可見Gas7在梨狀皮質的表達與梨狀皮質的發(fā)育趨勢呈動態(tài)相吻合的特點，提示了Gas7可能參與了梨狀皮質神經元的遷移、突起的延伸和突觸構建等方面的調控，其具體的調控機制還有待于進一步研究。

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