路?！≈苷袢A　胡尚連　曹穎　盧學琴

摘要：以GenBank上登錄的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、歐芹（Petroselinum crispum）、辣椒（Capsicum annuum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和毛白楊（Populus tomentosa）的22個WRKY家族抗病轉錄因子為分析對象，采用生物信息學方法對其系統(tǒng)發(fā)生樹、保守基序和蛋白質三級結構進行分析。結果表明，22個抗病WRKY轉錄因子分為2個大類群，7個亞類群。兩大類群的轉錄因子都具有基序1和2，系統(tǒng)發(fā)育樹中第一大類群中的擬南芥AtWRKY4和AtWRKY25，歐芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a具有相似的蛋白質三級結構，其都具有基序9和基序12，擬南芥AtWRKY33和AtWRKY48具有相似的蛋白質三級結構，都具有基序18；系統(tǒng)發(fā)育樹中第四亞類群中的辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23，具有相似的蛋白質三級結構。

關鍵詞：植物；WRKY轉錄因子；抗病；生物信息學

中圖分類號：S718.46；Q7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1191-05

植物在長期進化過程中形成了一系列機制，以適應和抵御各種生物和非生物逆境，在眾多的適應性機制中，基因表達的轉錄調節(jié)在植物應答環(huán)境信號刺激反應過程中起著重要作用。轉錄因子是植物中最重要的一類調節(jié)基因。WRKY是近年來新發(fā)現的植物特有的新型鋅指型轉錄調控因子， 是一類植物特有的轉錄因子家族，因在其N-端含有由WRKYGQK組成的高度保守的7個氨基酸序列而得名，WRKY基因首先被克隆于甘薯[1]，隨后在約20多種植物中證實存在WRKY蛋白，并闡明了相應的分子生物學功能[2]，WRKY家族轉錄因子主要與植物的抗逆性和衰老等生理過程有關。病原菌、傷害和植物激素類物質等多種外界因素均能誘導WRKY基因的表達[3]。本研究以GenBank上登錄的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、歐芹（Petroselinum crispum）、辣椒（Capsicum annuum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和毛白楊（Populus tomentosa）5個物種的22個WRKY家族抗病轉錄因子為材料，利用生物信息學方法研究該轉錄因子編碼區(qū)的變異，為其他植物WRKY抗病基因克隆及其研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

數據資料來源于美國國立生物技術信息中心NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）核苷酸數據庫和國家水稻數據中心（http：//www.ricedata.cn/），其中擬南芥有13種，AtWRKY40 NM_106732、 AtWRKY60 NM_128058、 AtWRKY48 NM_124329、AtWRKY25 NM_128578，對丁香假單胞菌起負調控作用[4-6]；AtWRKY18NM_119329的中度水平表達會引起PR基因表達及對丁香假單胞菌的抗性增強[7]；AtWRKY41 NM_117177具有雙重調控作用，能夠抵抗細菌和真菌病原物的重要下游基因的產物，抗丁香假單胞菌[8]；AtWRKY70 NM_115498，參與兩條抗性信號轉導途徑的調控交叉點，即通過激活SA介導的抗病信號轉導途徑，同時又抑制JA介導的抗病信號轉導，調控擬南芥的抗病反應，主要對丁香假單胞菌起抗病作用[9]；AtWRKY33 NM_129404作為JA/ET介導途徑中的正調控子，在抗真菌病原菌方面發(fā)揮作用，如防治灰霉病[10]；AtWRKY3 NM_126385對抗腐生病原菌起正調控作用；AtWRKY4 AF425835可以抗青枯病與腐生病原菌，超表達時對假單胞菌有毒小種的抗性增強， 對軟腐病菌抗性減弱[11]；AtWRKY29 NM_118486是MAPK通路中可作為典型的WRKY基因參與擬南芥植株的抗病信號的轉導[12]；AtWRKY6 NM_104910可以抗細菌、病毒、卵菌和真菌[13]；AtWRKY27 AF418310抗青枯病[14]。辣椒有3種，CaWRKY-a AY391747抗煙草花葉病毒[15]；CaWRKY2 DQ402421抗丁香假單胞菌[16]；CaWRKY1 AY229992通過負調控作用抗病菌[17]。歐芹3種，PcWRKY4 AF204925、PcWRKY5 AF204926均為抗大豆疫霉菌的激發(fā)子[18]；PcWRKY1 PCU48831抗大豆疫霉菌[19]。毛白楊有1種，PtWRKY23 EF051079抗葉銹病[20]。水稻2種，OsWRKY71 AB190817參與赤霉素信號傳導，脫落酸介導的信號傳導，依賴于R基因的防衛(wèi)反應信號途徑，抗白葉枯??；OsWRKY13 EF143611參與茉莉酸介導的信號傳導、水楊酸介導的信號途徑，抗白葉枯病和稻瘟病。

1.2 轉錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

利用Maga 5.0軟件對NCBI數據庫中搜索到的對病原菌有調控作用的轉錄因子和基因全長序列進行系統(tǒng)進化樹的構建。采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進行Bootstrap校正，得到最終的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 轉錄因子保守基序的分析

利用在線MEME 4.8.0軟件（http：//meme.sdsc.edu）對轉錄因子的氨基酸序列進行保守基序分析。

1.4 轉錄因子編碼蛋白質的三級結構分析

利用在線CPHmodels工具對9種蛋白質進行同源建模，并利用高級結構預測軟件RasMol對各轉錄因子和基因編碼的蛋白質三維結構進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同植物抗病WRKY轉錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

對22個WRKY家族抗病轉錄因子進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建，結果（圖1）表明，可以將這22個抗病WRKY轉錄因子分為2大類群，7個亞類群。第一大類群中的歐芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，擬南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25、AtWRKY33都含有兩個WRKY結構域。擬南芥WRKY抗病轉錄因子中對腐生病原菌起正調控作用的為AtWRKY3和AtWRKY4，二者抗腐生病原菌，起正調控作用[12]。

歐芹PcWRKY1對大豆疫霉菌有抗性作用[19]，擬南芥AtWRKY33對灰霉病起抗性作用[11]，而辣椒CaWRKY-a對煙草花葉病毒起抗性作用。從系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）上可以看出，這3個轉錄因子組成第一個亞類群，其中擬南芥AtWRKY33與辣椒CaWRKY-a親緣性相近，而與歐芹PcWRKY1的親緣性次之，但目前的研究表明其在抗病原理上并不相同，有待進一步研究。

擬南芥AtWRKY25和辣椒CaWRKY2聚為第二亞類群，二者均對丁香假單胞菌起調控作用；擬南芥AtWRKY3和AtWRKY4聚為第三亞類群，二者均對腐生病原菌起調控作用。

擬南芥AtWRKY48、毛白楊PtWRKY23和辣椒CaWRKY1聚為第四亞類群。研究表明，擬南芥AtWRKY48對丁香假單胞菌起負調控作用[5]，辣椒CaWRKY1對丁香假單胞菌、煙草花葉病毒等起負調控作用[17]，毛白楊PtWRKY23對葉銹病起抗性作用。

擬南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60、AtWRKY40，水稻OsWRKY71和歐芹PcWRKY4聚為第五亞類群，其中對細菌、真菌、卵菌、病毒起抗性作用的擬南芥AtWRKY6[13]單獨成一類，擬南芥AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40均對假單胞菌有抗性作用[4，7]，而擬南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71均會引起R基因表達抗病，且都是通過SA代謝途徑起到抗病作用[4]，而歐芹PcWRKY4為抗大豆疫霉菌因子。

擬南芥AtWRKY27、AtWRKY29和水稻OsWRKY13聚為第六亞類群。在抗病方面，擬南芥AtWRKY27抗青枯病，AtWRKY29是MAPK通路中能夠抵抗細菌和真菌病原物的重要下游基因的產物，水稻OsWRKY13參與茉莉酸介導的信號傳導、 水楊酸介導的信號途徑，抗白葉枯病和稻瘟病。

擬南芥AtWRKY41、AtWRKY70與歐芹PcWRKY5聚為第七亞類群。研究表明，它們均屬于鋅指結構C2-HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）型[21]，其中擬南芥AtWRKY41與AtWRKY70均對細菌具有抗病性，但抗病途徑并不相同[8，10]，而歐芹PcWRKY5對大豆疫霉菌因子有抗性，它們在抗病方面并不完全相同。

2.2 不同植物抗病WRKY轉錄因子保守基序的分析

由圖2可知，22個抗病的WRKY轉錄因子都具有保守基序1和2，部分WRKY轉錄因子之間也有共性。系統(tǒng)發(fā)育樹中第一大類群的1、2、3亞類群中的歐芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，擬南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25和AtWRKY33都具有基序9和基序12，而第一大類群的其他亞類群和第二大類群的其他 WRKY轉錄因子都不具有基序9和基序12。

第五亞類群的擬南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，水稻OsWRKY71，歐芹PcWRKY4都具有基序5和基序6，而第一大類群的其他亞類群和第二大類群的其他WRKY轉錄因子都不具有基序5和基序6。第四亞類群中辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23特有的基序為基序18。第七亞類群的擬南芥AtWRKY41和AtWRKY70，歐芹PcWRKY5都具有基序17。研究表明，擬南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71通過水楊酸代謝途徑抗病[4]，基序分析表明，二者共有基序1、2、4、5、6和14。擬南芥WRKY轉錄因子中對腐生病原菌抗性起正調控作用的AtWRKY4和AtWRKY3都具有基序11和基序10。許多擬南芥WRKY轉錄因子作為防衛(wèi)信號的負調控因子起作用， 如AtWRKY18、AtWRKY25、AtWRKY27、AtWRKY40、AtWRKY41、AtWRKY48和AtWRKY 60，這些WRKY轉錄因子都具有基序1、2、6和5。擬南芥AtWRKY70編碼的蛋白質參與兩條抗性信號轉導途徑，一是通過激活SA介導的抗病信號轉導途徑，二是抑制JA介導的抗病信號轉導途徑，從而調控擬南芥的抗病反應[10]，其僅有基序1、2、19和20。

2.3 不同植物抗病轉錄因子編碼蛋白質的三級結構分析

高級結構決定蛋白質生物學功能，對蛋白質高級結構的預測和分析，有助于理解蛋白質結構與功能之間的相關性[22]。由圖3可知，擬南芥AtWRKY4和AtWRKY25轉錄因子編碼的蛋白質三級結構相似，均屬于抗細菌型轉錄因子[6，12]。歐芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a轉錄因子編碼的蛋白質三級結構相似，辣椒CaWRKY-a對煙草花葉病毒具有抗性作用，而歐芹PcWRKY1對大豆疫霉菌有抗性作用。水稻OsWRKY13、歐芹PcWRKY4和PcWRKY5、擬南芥AtWRKY18和AtWRKY40編碼的蛋白質三級結構相似。辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23，擬南芥AtWRKY48和AtWRKY33編碼的蛋白質三級結構相似，但其功能不盡相同[5，10]，有待進一步研究。研究表明，擬南芥AtWRKY18和AtWRKY6，歐芹PcWRKY1以及水稻OsWRKY13的C末端結構域可與（T）（T）TGAC（C/T）序列（W-box）相結合，產生特異性作用，參與植物防衛(wèi)反應作用[23，24]。

3 小結

通過對22個抗病WRKY家族轉錄因子進行系統(tǒng)發(fā)生樹、基序以及蛋白質三級結構分析，得出22個抗病WRKY轉錄因子分為2個大類群，7個亞類群。第一大類群由歐芹PcWRKY1、PcWRKY4，辣椒CaWRKY1、 CaWRKY-a、 CaWRKY2，擬南芥AtWRKY4、 AtWRKY3、 AtWRKY25、 AtWRKY33、AtWRKY48、AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，毛白楊PtWRKY23，水稻OsWRKY71組成。擬南芥AtWRKY41、AtWRKY70、AtWRKY27和AtWRKY29，歐芹PcWRKY5，水稻OsWRKY13組成第二大類群。22個轉錄因子都具有基序1和2，系統(tǒng)發(fā)育樹中第一大類群中的擬南芥AtWRKY4和AtWRKY25，歐芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a具有相似的蛋白質三級結構，都具有基序9和基序12，擬南芥AtWRKY33和AtWRKY48具有相似的蛋白質三級結構，都具有基序18；系統(tǒng)發(fā)育樹中第四亞類群中的辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23具有相似的蛋白質三級結構。

參考文獻：

[1] ISHIGURO S， NAKAMURA K.Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein，SPF1，that recognizes SP8 sequences in the 5upstream regions of genes coding for sporamin and β-amylase from sweet potato[J]. Mol Gen Genet.1994，244（6）：563-571.

[2] WU K L，GUO Z J，WANG H H， et al. The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins[J].DNA Res，2005，12（1）：9-26.

[3] EULGEM T， RUSHTON P J， ROBATZEK S， et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors[J].Trends in Plant Science，2000，5（5）：200-206.

[4] XU X P， CHEN C H， FAN B F，et al. Physical and functional interactions between pathogen-induced Arabidopsis WRKYl8，WRKY40 and WRKY60 transcription factors[J]. The Plant Cell，2006，18（5）：1310-1326.

[5] XING D H， LAI Z B， ZHENG Z Y， et al. Stress-and pathogen-induced Arabidopsis WRKY48 is a transcriptional activator that represses plant basal defense[J]. Mol Plant，2008，1（3）：459-470.

[6] ZHENG Z， QAMAR S A， CHEN Z， et al. Arabidopsis WRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens[J].Plant J，2006，48（4）：592-605.

[7] CHEN C， CHEN Z. Potentiation of developmentally regulated plant defense response by AtWRKY18，a pathogen-induced Arabidopsis transcription factor[J]. Plant Physiology，2002，129（2）：706-716.

[8] ASAI T， TENA G， PLOTNIKOVA J， et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity[J]. Nature，2002，415：977-983.

[9] LI J， BRADER G， PALVA E T. The WRKY70 transcription factor：A node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense[J].The Plant Cell，2004，16（2）：319-331.

[10] ZHENG Z， MOSHER S L， FAN B， et al. Functional analysis of Arabidopsis WRKY25 transcription factor in plant defense against Pseudomonas syringae[J]. BMC Plant Biology，2007（7）：1-13.

[11] RAMAMOORTHY R， JIANG S Y， KUMAR N，et al. A comprehensive transcriptional profiling of the WRKY gene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments[J]. Plant Cell Physiology，2008，49（6）：865-879.

[12] LAI Z B， VINOD K M， ZHENG Z Y， et al. Roles of Arabidnpsis WRKY3 and WRKY4 transcription factors in plant responses to pathogens[J]. BMC Plant Biology，2008（8）：1-13.

[13] CHEN W Q， PROVART N J， GLAZEBROOK J， et al. Expression profile matrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses[J]. The Plant Cell，2002，14（3）：559-574.

[14] MUKHTAR M S， DESLANDES L， AURIAC M C， et al. The Arabidopsis transcription factor WRKY27 influences wilt disease symptom development caused by Ralstonia solanacearum[J].Plant J，2008，56（6）：935-947.

[15] PARK C J， SHIN Y C， LEE B J， et a1. A hot pepper gene encoding WRKY transcription factor is induced during hypersensitive response to Tobacco mosaic virus and Xanthomonas campestris[J]. Planta，2006，223（2）：168-179.

[16] OH S K， YI SY， YU S H， et a1. CaWRKY2，a chili pepper transcription factor，is rapidly induced by incompatible plant pathogens[J].Mol Cells，2006，22（1）：58-64.

[17] OH S K， BAEK K H， YI S Y， et al. Capsicum annuum WRKY protein CaWRKY1 is a negative regulator of pathogen defense[J].New Phytologist，2008，177（4）：977-989.

[18] CORMACK R S， EULGEM T， RUSHTON P J， et al. Leucine zipper-containing WRKY proteins widen the spectrum of immediate early elicitor-induced WRKY transcription factors in parsley[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2002， 1576（1-2）：92-100.

[19] ULGEMT， RUSHTON P J， SEHMELZER E， et al. Early nuclear events in plant defence signaling：Rapid gene activation by WRKY transcription factors[J]. EMBO J，1999（18）：4689-4699.

[20] WIM G， MANSOUR K， KRZYSZTOF W， et al. A role for AtWRKY23 in feeding site establishment of plant-parasitic nematodes[J]. Plant Physiology，2008，148；358-368.

[21] 田 云，盧向陽，彭麗莎，等.植物WRKY轉錄因子結構特點及其生物學功能[J]. 遺傳，2006（12）：1607-1612.

[22] 陳克克，武 雪.植物查耳酮異構酶生物信息學分析[J].生物信息學，2009，7（3）：163-167.

[23] RUSHTON P J， SOMSSICH I E， RINGLER P， et al. WRKY transcription factors[J]. Trends in Plant Science， 2010， 15（5）：247-258.

[24] YU D Q， CHEN C H， CHEN Z X. Evidence for an important role of WRKY DNA binding proteins in the regulation of NPR1 gene expression[J]. The Plant Cell，2001（13）：1527-1539.