余磊　韓雅莉

摘要：為了研究地鱉蟲（Eupolyphage sinensis Walker）纖溶酶的溶栓機理，根據(jù)地鱉蟲纖溶酶成熟肽編碼序列，利用生物信息學(xué)方法，對地鱉蟲纖溶酶進行了結(jié)構(gòu)分析，用Biosun軟件的同源模建技術(shù)，模擬了其三維結(jié)構(gòu)。利用GOLDKEY軟件，對地鱉蟲纖溶酶的氨基酸序列進行了分析，討論了其等電點、親水性、柔性與催化活性之間的關(guān)系。結(jié)果表明，地鱉蟲纖溶酶的活性中心是組氨酸、絲氨酸和天冬氨酸3個氨基酸殘基，位于球蛋白中心凹穴處，底物結(jié)合部位是絲氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，該類酶水解纖維蛋白的機理是催化精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵水解。

關(guān)鍵詞：地鱉蟲（Eupolyphage sinensis Walker）；纖溶酶；三維結(jié)構(gòu)；序列

中圖分類號：Q55；R857.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1185-04

地鱉蟲 （Eupolyphage sinensis Walker）又名土元、土鱉，屬節(jié)肢動物門昆蟲綱蜚蠊目鱉蠊科昆蟲，為《中華人民共和國藥典》記載的正品藥材，是傳統(tǒng)的活血化瘀類動物藥，其藥用功效主要為逐瘀、破積、通絡(luò)等。廣東工業(yè)大學(xué)纖溶先導(dǎo)藥物課題組在進行地鱉蟲纖溶活性成分研究時，從該蟲體內(nèi)分離純化得到了地鱉蟲纖溶酶[1，2]，對此類纖溶酶基因 DNA序列進行了分析研究，克隆得到其中一種地鱉蟲纖溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登錄號：DQ396618），并將其用赤畢酵母表達[3]。為了深入探討地鱉蟲纖溶酶的纖溶作用機制，確定其活性中心的位置，本研究利用生物信息學(xué)方法，對地鱉蟲纖溶酶序列進行多方位分析，并建立了地鱉蟲纖溶酶可靠的三維結(jié)構(gòu)模型，揭示了其纖溶機理，為今后進一步研究提供參考。

1 理論與方法

要想了解蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，只有將蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶，利用X射線衍射分析蛋白質(zhì)的單晶，通過衍射數(shù)據(jù)，得到蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。但是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件苛刻，而且不是所有的蛋白質(zhì)都能變成單晶。但是利用現(xiàn)代計算機技術(shù)，可以對已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)做出預(yù)測，同時還能對蛋白質(zhì)序列中的每個氨基酸逐個分析，即比較蛋白質(zhì)模建，又稱為同源模建。該方法是目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測方法[4-6]。本研究將地鱉蟲纖溶酶的蛋白質(zhì)序列提交到NCBI的自動比較蛋白質(zhì)模建服務(wù)器Blast上，通過程序自動確定了地鱉蟲纖溶酶序列活性中心與底物結(jié)合的部位（圖1），Biosun軟件模擬生成了地鱉蟲纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)。利用GOLDKEY軟件，對地鱉蟲纖溶酶全序列的等電點、親水性、柔性進行分析，利用無模型比對時活性中心氨基酸殘基的性質(zhì)，進一步闡明地鱉蟲纖溶酶的纖溶機理。

2 結(jié)果與分析

2.1 三維結(jié)構(gòu)模擬與評估

將地鱉蟲纖溶酶蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入Biosun軟件，軟件自動選取蛋白質(zhì)Tryp_SPc[cd00190]為模板，模擬目的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2。其中a、b、c 3個球狀模型，分別對應(yīng)S178、H41、D85 3個氨基酸殘基側(cè)鏈（羥基、咪唑基、羧基），與胰蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)一致[7，8]。d、e、f 3個肽鍵鏈狀模型，分別對應(yīng)于地鱉蟲纖溶酶的底物結(jié)合部位D172、S193、G195。由三維結(jié)構(gòu)可以看出，底物結(jié)合部位和酶催化活性中心都沒有α螺旋和β折疊（α螺旋為柱狀區(qū)，β折疊為板狀區(qū)），該區(qū)域容易發(fā)生形變，在催化過程中跟底物結(jié)合時產(chǎn)生誘導(dǎo)契合，符合酶催化理論。酶活中心處于這個蛋白質(zhì)中心的凹穴處，與通常對纖溶酶活性中心的認識一致[9，10]。筆者在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，該酶受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的抑制，推測其為絲氨酸蛋白酶[1，2]，此推測與生物信息學(xué)方法找到的活性中心S178結(jié)論一致。

對模板蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)進行同源性比對（圖3），Blast軟件給出89.9的評分，說明模板蛋白和地鱉蟲纖溶酶的同源性比較高，二者序列覆蓋率達到99%。隨機匹配的可能性為2×10-19，這么小的隨機匹配可能性，說明2個蛋白質(zhì)相同的序列部分，不是偶然出現(xiàn)的，是具有同源性的。二者最大序列的相似度達到43%。以此模板蛋白質(zhì)進行同源模建，結(jié)果可信。

2.2 GOLDKEY軟件的序列分析

在地鱉蟲纖溶酶三維結(jié)構(gòu)分析中，采用的是同源模建的方法。在預(yù)測的時候，其他蛋白質(zhì)與目標(biāo)預(yù)測物的差異會導(dǎo)致一定程度的偏差。采用GOLDKEY軟件對序列的每個殘基逐個計算其特性，雖然無法得到三維結(jié)構(gòu)，但是其數(shù)據(jù)可靠性更好，更能反映目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性。圖4為利用GOLDKEY軟件對地鱉蟲纖溶酶氨基酸序列的等電點進行模擬。由圖4可知，該蛋白質(zhì)的等電點為9.67。在通常生理環(huán)境下，該蛋白質(zhì)帶正電。纖維蛋白通常帶負電荷，所以地鱉蟲纖溶酶很容易靠近纖維蛋白質(zhì)，與之結(jié)合，表明該酶對血栓有一定的靶向作用。

利用GOLDKEY軟件對地鱉蟲纖溶酶氨基酸序列進行親水性模擬（圖5）。由圖5可知，地鱉蟲纖溶酶序列中每個氨基酸的親水值越大，親水性越強。其中H41為0.5，D85、S178、D172、S193、G195均為0。H41、D85、S178為活性部位，D172、S193、G195為底物結(jié)合部位，其親水值均比較低。在序列中，這6個殘基的親水值都處于局部最低點（相鄰殘基的親水值均較高）。對于水溶性球形蛋白質(zhì)，親水值較低的氨基酸趨向于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，親水值較高的氨基酸趨向于蛋白質(zhì)的外部，從一級結(jié)構(gòu)上的親水性推測，H41、D85、S178、D172、S193、G195這6個氨基酸都位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，與三級結(jié)構(gòu)相符。

利用GOLDKEY軟件對地鱉蟲纖溶酶氨基酸序列進行柔性模擬（圖6）。由圖6可知，地鱉蟲纖溶酶序列中每個氨基酸的柔性值，其中H41=0.91，D85=0.93，S178=1.12， D172=1.03，S193=0.93，G195=0.93。H41、D85、S178為活性部位，D172、S193、G195為底物結(jié)合部位，其柔性值均比較大，符合酶促反應(yīng)動力學(xué)誘導(dǎo)契合理論。在結(jié)合底物時，活性中心的結(jié)構(gòu)和底物的結(jié)構(gòu)都發(fā)生了一定的形變（柔性才能形變），使其在空間結(jié)構(gòu)上互補，從而能很好的契合。但是從全序列柔性值來看，催化中心和底物結(jié)合部位的柔性并非最大，而且催化中心和底物結(jié)合部位的柔性還處于局部最低點，都在峰谷處。這正好驗證了酶結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定性。酶具有高效性和專一性的催化特點，決定這些特點的關(guān)鍵不僅僅是因為酶活性中心的關(guān)鍵基團，也與酶的特殊空間結(jié)構(gòu)有著不可分割的關(guān)系。所以酶關(guān)鍵部位的空間結(jié)構(gòu)也不能有太大的柔性，更不能隨意變形。

2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴氨酸側(cè)鏈都有一個較長的烷烴部分，疏水性較強，能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū)，而且長鏈烷烴的一端含有1個氨基，能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴氨酸側(cè)鏈長度和結(jié)構(gòu)幾乎相同（約為5～6個σ C-C單鍵長度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結(jié)構(gòu)上可知，D85與 D172相距約5個肽鍵長度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴氨酸側(cè)鏈長度相同），這時酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12]，能協(xié)助肽鍵斷裂時的電子轉(zhuǎn)移過程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結(jié)

本研究對地鱉蟲纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進行了模擬，并對其全序列進行分析。地鱉蟲纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作于與精氨酸-賴氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

參考文獻：

[1] 韓雅莉，李偉張. 地鱉纖溶蛋白純化及性質(zhì)研究[J].生物工程學(xué)報，2006，22（4）：639-643.

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2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴氨酸側(cè)鏈都有一個較長的烷烴部分，疏水性較強，能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū)，而且長鏈烷烴的一端含有1個氨基，能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴氨酸側(cè)鏈長度和結(jié)構(gòu)幾乎相同（約為5～6個σ C-C單鍵長度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結(jié)構(gòu)上可知，D85與 D172相距約5個肽鍵長度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴氨酸側(cè)鏈長度相同），這時酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12]，能協(xié)助肽鍵斷裂時的電子轉(zhuǎn)移過程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結(jié)

本研究對地鱉蟲纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進行了模擬，并對其全序列進行分析。地鱉蟲纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作于與精氨酸-賴氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴氨酸之間的肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^程[11]。從圖7中可以看到，精氨酸和賴氨酸側(cè)鏈都有一個較長的烷烴部分，疏水性較強，能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū)，而且長鏈烷烴的一端含有1個氨基，能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合，使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴氨酸側(cè)鏈長度和結(jié)構(gòu)幾乎相同（約為5～6個σ C-C單鍵長度，7.7×10-10 m），被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后，其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處（從三維結(jié)構(gòu)上可知，D85與 D172相距約5個肽鍵長度6.6×10-10 m，大致與精氨酸-賴氨酸側(cè)鏈長度相同），這時酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴氨酸的肽鏈斷裂，而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基，在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12]，能協(xié)助肽鍵斷裂時的電子轉(zhuǎn)移過程，從而完成纖維蛋白的水解。

3 小結(jié)

本研究對地鱉蟲纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進行了模擬，并對其全序列進行分析。地鱉蟲纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178；底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證，該纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作于與精氨酸-賴氨酸的肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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