路宏朝　張濤　江海　李麗霞　樊鵬輝

摘要：試驗通過PCR-SSCP技術檢測略陽烏雞酪氨酸酶基因（TYR）部分啟動子區(qū)、全部外顯子和部分內含子的遺傳多樣性，并對不同基因型進行了測序和比對分析。結果表明，略陽雞群體在TYR位點具有較為豐富的遺傳變異，在所檢測的啟動子區(qū)有2個單核苷酸多態(tài)（SNP）位點；外顯子1有2個SNP位點，外顯子2、3、4沒有檢測到變異位點，外顯子5存在5個SNP位點；檢測的部分內含子2中發(fā)現2個SNP位點。mRNA上的7個變異位點有3個發(fā)生在編碼區(qū)，但都是同義突變，沒有造成氨基酸變異。表明略陽烏雞和普通雞的酪氨酸酶沒有氨基酸序列差異，TYR基因在雞的遺傳上是高度保守的。啟動子區(qū)和內含子區(qū)的遺傳變異是否與酪氨酸酶的轉錄剪接和表達量有關，進而影響烏雞黑色素的沉積還有待進一步研究。

關鍵詞：略陽烏雞；酪氨酸酶基因（TYR）；遺傳變異

中圖分類號：S831；S813.8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1123-05

略陽烏雞又稱黑河烏雞，具有“六端烏”（烏皮、烏喙、烏腿、烏趾、烏舌、烏冠），體形大，生長快、產肉多、肉質細嫩鮮香，營養(yǎng)豐富，兼有藥用價值，屬優(yōu)良肉用型地方雞種，其羽色復雜，有黑羽、麻羽、白羽等，是經過長期選育形成的寶貴資源，主要分布于秦嶺以南略陽縣的黑河壩、觀音寺、仙臺壩、兩河口等地，是陜西省惟一的家禽保護品種，農業(yè)部專家組來略陽調研時，將其與泰和烏雞、鄖陽烏雞、江山烏雞共同列為中國四大烏雞品種，2008年被確立為“中國地理標志產品” [1-4]。

烏雞的滋補、藥用價值主要是與其體內豐富的黑色素有關， 黑色素具有延緩衰老、清除自由基、抗氧化、抗誘變、抗紫外線、抑制流感病毒等多種生理功能[5-10]。動物黑色素可分為兩類， 一是真黑色素（Eumelanin）， 不含硫原子， 呈棕色或黑色； 二是脫黑色素（Pheomelanin），含硫原子， 呈黃色或微紅棕色，烏骨雞黑色素屬于真黑色素，主要分布于烏雞的羽毛、皮膚、骨骼和肌肉中[11，12]。黑色素沉著決定于其所含真黑色素與脫黑色素的相對數量，而黑色素細胞中酪氨酸酶活性和表達量與兩種黑色素合成量比例呈正相關[11，13]。

酪氨酸酶是控制黑色素生成的限速酶，酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成3， 4-二羥基丙苯氨酸（多巴）， 多巴進一步氧化生成多巴醌， 多巴醌經多聚化反應與氧化反應生成多巴色素， 在多巴色素異構酶作用下， 多巴色素羥化為5， 6-二羥基吲哚羧酸（ DHICA） ， 脫羧成5， 6-二羥基吲哚， 再在酪氨酸酶催化下氧化成5， 6-吲哚醌， 最后與其他中間產物結合形成真黑色素。脫黑色素合成前期（酪氨酸到多巴醌）與真黑色素一致， 但在以后反應中有半胱氨酸（Cys） 參加， 產生Cys-多巴和Cys-多巴醌， 然后通過關環(huán)、脫羧、最終形成脫黑色素[13]。家禽中真黑色素的合成目前多遵循經典的Mason-Raper途徑，雞的酪氨酸酶基因（TYR）定位在1號染色體的長臂4區(qū)4帶[12，14]。

本研究以略陽普通雞、略陽麻羽烏雞與略陽黑羽烏雞3個群體為對象，通過PCR和測序技術檢測略陽雞TYR基因的SNP，分析略陽雞TYR基因的遺傳變異對黑色素形成的影響，探討略陽烏雞黑色素形成過程中TYR的分子作用機制，為開發(fā)利用這一寶貴資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從陜西漢中黑鳳烏雞產業(yè)園采集21只略陽黑羽烏雞（LYHY）的血液，漢中農貿市場采集略陽普通雞（LYPT）和略陽麻羽烏雞（LYMY）各1只的血液，加ACD抗凝，置于-70 ℃低溫冰箱中保存， 根據《分子克隆實驗指南》[15]，采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，4 ℃保存。

1.2 引用序列及引物序列

從GenBank查得雞的TYR基因序列（GenBank登錄號：L46805 和NC006088）， TYR外顯子1及上游序列引物引自文獻[16]，采用Primer5.0自行設計TYR外顯子2-5的引物，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成（表1）。

1.3 PCR擴增反應體系及程序

PCR反應總體系為25 μL：10×PCR緩沖液

2.5 μL， dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游引物

（10 pmol/L）各1.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）

0.2 μL ，DNA模板（50 ng/μL）1.2 μL，超純水18.2 μL。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃（表1）退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行34個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；12 ℃保存。

1.4 SSCP檢測

取2 μLPCR產物與8 μL上樣緩沖液（95%甲酰胺， 0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍， 20 mmol/L EDTA）混勻，放入沸水煮沸10 min，立即取出冰浴30 min，取混合物于12%的聚丙烯酰胺凝膠180 V電泳18 h后進行銀染[17]。

1.5 DNA測序與分析

對SSCP技術檢測出的不同基因型的個體進行擴增，對PCR產物進行測序，然后進行比對和拼接，采用DNAMAN 5.0軟件對略陽烏雞TYR基因序列和NCBI公布的雞TYR基因序列進行比對分析。

2 結果及分析

2.1 不同類型略陽雞TYR基因SSCP檢測結果

雞的TYR序列總長49 778 bp（NC006088），有5個外顯子，mRNA全長1 935 bp，編碼區(qū)為

1 590 bp，編碼529個AA。通過SSCP檢測所研究群體的遺傳多樣性，發(fā)現在啟動子區(qū)有2種基因型AA和BB型；外顯子1的5號引物檢測到AA、AB和BB 3種基因型；外顯子1的6號引物也存在AA、AB和BB 3種基因型。外顯子2、3、4沒有發(fā)現多態(tài)性，只檢測到一種基因型。外顯子5的1號引物有2種基因型（AA、AB型）；2號引物檢測到3種基因型（AA、AB和 BB型）；3號引物也檢測到3種基因型（AA、AB和BB型），各基因型在略陽雞中的頻率見表2。

2.2 略陽雞群體TYR基因序列變異分析

對不同的基因型進行測序發(fā)現不同位點各基因型DNA水平的單核苷酸遺傳變異（圖1-9）。以NCBI公布紅色原雞TYR基因序列為參照，采用DNAMAN5.0 軟件對略陽普通雞、略陽麻羽烏雞和略陽黑羽烏雞TYR部分啟動子區(qū)、外顯子區(qū)和部分內含子區(qū)進行序列比對，發(fā)現略陽烏雞群體中的多數個體啟動子區(qū)-392和-409位點由G→A（圖1、圖2），外顯子1的第757位點C→T（圖3），第849位點C→T（圖4），外顯子5的第49351位點C→T（圖7），第49567位點A→G（圖8），第49663位點G→C，第49672位點T→A，第49692位點C→G（圖9）。對略陽麻羽烏雞、略陽普通雞、略陽黑羽烏雞、紅色原雞TYR基因編碼區(qū)進行翻譯和比對，發(fā)現在編碼區(qū)第757位點、第849位點、第49351位點3個堿基存在遺傳變異，但是其中均為同義突變，并不導致氨基酸序列的改變。對于啟動子區(qū)和內含子區(qū)的堿基變異是否影響略陽雞TYR基因的表達量，進而影響黑色素的形成還有待進一步研究。

3 小結與討論

烏雞在表型性狀上與普通雞最明顯的差異是體內含有大量黑色素，酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵酶， 其表達和活性決定著黑色素生成的速度和產量[18]。另有研究發(fā)現黑色素的合成是由多個基因位點編碼產物共同參與與調控的級聯過程[19]。Levine[20]提出至少有4個TYR基因家族成員參與黑色素的合成，由于酪氨酸酶的重要性，編碼酪氨酸酶的基因也就成了研究黑色素性狀和白化病的熱點候選基因。雞的TYR位點是復等位基因位點，雞的第1外顯子6個核苷酸的缺失導致白化，這些核苷酸編碼天冬氨酸和色氨酸，而這2個氨基酸從兩棲動物到人都是保守的，可見這2個氨基酸在結構和功能上都起著重要作用[21，22]。目前雞的TYR基因的全序列和控區(qū)序列均已完成測序，但在不同家禽品種上的研究相對較少，陳志強等[23]通過研究明星肉雞與絲羽烏雞的TYR基因5′調控區(qū)單鏈構想多態(tài)，發(fā)現調控區(qū)有3個SNP，并且這些SNP位點與雞的脛色和膚色顯著相關。張建勤等[24]、Zhang等[25]采用PCR-SSCP方法，對中國寧夏固原雞、海南文昌雞、西藏藏雞和引進品種海賽克斯雞TYR基因5′側翼區(qū)及外顯子1的遺傳變異進行了研究。結果表明中國地方雞品種的TYR基因蘊藏豐富的變異資源。

烏雞因其體內豐富的黑色素沉積而具有很高的營養(yǎng)保健功能和重要經濟性狀。略陽烏雞是中國四大烏雞品種之一，現已成功申報國家地理標志產品，具有“六端烏”的特性，探索其黑色素形成機理為略陽烏雞進一步品系化培育和資源保護提供了較好的理論基礎，也可為烏骨雞和禽類黑色素的形成機制研究提供一定的試驗數據。本研究以略陽普通雞和麻羽烏雞為對照，結合GenBank公布雞的TYR基因序列，分析了23只略陽雞TYR基因編碼區(qū)的遺傳變異，分析不同SNP位點與雞的羽色和肉色的關系。略陽普通雞的羽色為麻色，肉色為普通色，麻羽烏雞的羽色為雜色，肉色為黑色，略陽黑羽烏雞所有性狀均為黑色。研究發(fā)現TYR基因編碼區(qū)3個突變位點在略陽烏雞群體均有分布，但是突變位點均為同義突變，沒有造成氨基酸序列的變異，不影響酪氨酸酶的蛋白質構象和功能。這一結果與前人研究結果基本符合，因為酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，一般是高度保守的，如果一些氨基酸序列的變異將影響其功能，可能導致白化病等生理現象。由于本研究的略陽雞是正常個體，毛色都有顏色，所以TYR的氨基酸序列沒有差異是正常的，說明略陽烏雞和普通雞的TYR基因是高度保守的，但是它們在膚色和毛色黑色素含量上的差異可能是由另外的基因造成的，也可能是由TYR基因表達量的差異引起的。本研究另外發(fā)現略陽烏雞與普通雞的TYR基因在啟動子區(qū)和內含子區(qū)的DNA序列存在遺傳差異，這些差異是否與酪氨酸酶的表達和轉錄剪接有關，進而影響烏雞黑色素的沉積還有待進一步研究。

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