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摘要：試驗(yàn)通過PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)略陽烏雞酪氨酸酶基因（TYR）部分啟動(dòng)子區(qū)、全部外顯子和部分內(nèi)含子的遺傳多樣性，并對(duì)不同基因型進(jìn)行了測(cè)序和比對(duì)分析。結(jié)果表明，略陽雞群體在TYR位點(diǎn)具有較為豐富的遺傳變異，在所檢測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)有2個(gè)單核苷酸多態(tài)（SNP）位點(diǎn)；外顯子1有2個(gè)SNP位點(diǎn)，外顯子2、3、4沒有檢測(cè)到變異位點(diǎn)，外顯子5存在5個(gè)SNP位點(diǎn)；檢測(cè)的部分內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)。mRNA上的7個(gè)變異位點(diǎn)有3個(gè)發(fā)生在編碼區(qū)，但都是同義突變，沒有造成氨基酸變異。表明略陽烏雞和普通雞的酪氨酸酶沒有氨基酸序列差異，TYR基因在雞的遺傳上是高度保守的。啟動(dòng)子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的遺傳變異是否與酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄剪接和表達(dá)量有關(guān)，進(jìn)而影響烏雞黑色素的沉積還有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：略陽烏雞；酪氨酸酶基因（TYR）；遺傳變異

中圖分類號(hào)：S831；S813.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-1123-05

略陽烏雞又稱黑河烏雞，具有“六端烏”（烏皮、烏喙、烏腿、烏趾、烏舌、烏冠），體形大，生長(zhǎng)快、產(chǎn)肉多、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮香，營(yíng)養(yǎng)豐富，兼有藥用價(jià)值，屬優(yōu)良肉用型地方雞種，其羽色復(fù)雜，有黑羽、麻羽、白羽等，是經(jīng)過長(zhǎng)期選育形成的寶貴資源，主要分布于秦嶺以南略陽縣的黑河壩、觀音寺、仙臺(tái)壩、兩河口等地，是陜西省惟一的家禽保護(hù)品種，農(nóng)業(yè)部專家組來略陽調(diào)研時(shí)，將其與泰和烏雞、鄖陽烏雞、江山烏雞共同列為中國(guó)四大烏雞品種，2008年被確立為“中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品” [1-4]。

烏雞的滋補(bǔ)、藥用價(jià)值主要是與其體內(nèi)豐富的黑色素有關(guān)， 黑色素具有延緩衰老、清除自由基、抗氧化、抗誘變、抗紫外線、抑制流感病毒等多種生理功能[5-10]。動(dòng)物黑色素可分為兩類， 一是真黑色素（Eumelanin）， 不含硫原子， 呈棕色或黑色； 二是脫黑色素（Pheomelanin），含硫原子， 呈黃色或微紅棕色，烏骨雞黑色素屬于真黑色素，主要分布于烏雞的羽毛、皮膚、骨骼和肌肉中[11，12]。黑色素沉著決定于其所含真黑色素與脫黑色素的相對(duì)數(shù)量，而黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶活性和表達(dá)量與兩種黑色素合成量比例呈正相關(guān)[11，13]。

酪氨酸酶是控制黑色素生成的限速酶，酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成3， 4-二羥基丙苯氨酸（多巴）， 多巴進(jìn)一步氧化生成多巴醌， 多巴醌經(jīng)多聚化反應(yīng)與氧化反應(yīng)生成多巴色素， 在多巴色素異構(gòu)酶作用下， 多巴色素羥化為5， 6-二羥基吲哚羧酸（ DHICA） ， 脫羧成5， 6-二羥基吲哚， 再在酪氨酸酶催化下氧化成5， 6-吲哚醌， 最后與其他中間產(chǎn)物結(jié)合形成真黑色素。脫黑色素合成前期（酪氨酸到多巴醌）與真黑色素一致， 但在以后反應(yīng)中有半胱氨酸（Cys） 參加， 產(chǎn)生Cys-多巴和Cys-多巴醌， 然后通過關(guān)環(huán)、脫羧、最終形成脫黑色素[13]。家禽中真黑色素的合成目前多遵循經(jīng)典的Mason-Raper途徑，雞的酪氨酸酶基因（TYR）定位在1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂4區(qū)4帶[12，14]。

本研究以略陽普通雞、略陽麻羽烏雞與略陽黑羽烏雞3個(gè)群體為對(duì)象，通過PCR和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)略陽雞TYR基因的SNP，分析略陽雞TYR基因的遺傳變異對(duì)黑色素形成的影響，探討略陽烏雞黑色素形成過程中TYR的分子作用機(jī)制，為開發(fā)利用這一寶貴資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從陜西漢中黑鳳烏雞產(chǎn)業(yè)園采集21只略陽黑羽烏雞（LYHY）的血液，漢中農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集略陽普通雞（LYPT）和略陽麻羽烏雞（LYMY）各1只的血液，加ACD抗凝，置于-70 ℃低溫冰箱中保存， 根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[15]，采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，4 ℃保存。

1.2 引用序列及引物序列

從GenBank查得雞的TYR基因序列（GenBank登錄號(hào)：L46805 和NC006088）， TYR外顯子1及上游序列引物引自文獻(xiàn)[16]，采用Primer5.0自行設(shè)計(jì)TYR外顯子2-5的引物，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成（表1）。

1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序

PCR反應(yīng)總體系為25 μL：10×PCR緩沖液

2.5 μL， dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游引物

（10 pmol/L）各1.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）

0.2 μL ，DNA模板（50 ng/μL）1.2 μL，超純水18.2 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃（表1）退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；12 ℃保存。

1.4 SSCP檢測(cè)

取2 μLPCR產(chǎn)物與8 μL上樣緩沖液（95%甲酰胺， 0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán)， 20 mmol/L EDTA）混勻，放入沸水煮沸10 min，立即取出冰浴30 min，取混合物于12%的聚丙烯酰胺凝膠180 V電泳18 h后進(jìn)行銀染[17]。

1.5 DNA測(cè)序與分析

對(duì)SSCP技術(shù)檢測(cè)出的不同基因型的個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，然后進(jìn)行比對(duì)和拼接，采用DNAMAN 5.0軟件對(duì)略陽烏雞TYR基因序列和NCBI公布的雞TYR基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同類型略陽雞TYR基因SSCP檢測(cè)結(jié)果

雞的TYR序列總長(zhǎng)49 778 bp（NC006088），有5個(gè)外顯子，mRNA全長(zhǎng)1 935 bp，編碼區(qū)為

1 590 bp，編碼529個(gè)AA。通過SSCP檢測(cè)所研究群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)有2種基因型AA和BB型；外顯子1的5號(hào)引物檢測(cè)到AA、AB和BB 3種基因型；外顯子1的6號(hào)引物也存在AA、AB和BB 3種基因型。外顯子2、3、4沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，只檢測(cè)到一種基因型。外顯子5的1號(hào)引物有2種基因型（AA、AB型）；2號(hào)引物檢測(cè)到3種基因型（AA、AB和 BB型）；3號(hào)引物也檢測(cè)到3種基因型（AA、AB和BB型），各基因型在略陽雞中的頻率見表2。

2.2 略陽雞群體TYR基因序列變異分析

對(duì)不同的基因型進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)不同位點(diǎn)各基因型DNA水平的單核苷酸遺傳變異（圖1-9）。以NCBI公布紅色原雞TYR基因序列為參照，采用DNAMAN5.0 軟件對(duì)略陽普通雞、略陽麻羽烏雞和略陽黑羽烏雞TYR部分啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)和部分內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)略陽烏雞群體中的多數(shù)個(gè)體啟動(dòng)子區(qū)-392和-409位點(diǎn)由G→A（圖1、圖2），外顯子1的第757位點(diǎn)C→T（圖3），第849位點(diǎn)C→T（圖4），外顯子5的第49351位點(diǎn)C→T（圖7），第49567位點(diǎn)A→G（圖8），第49663位點(diǎn)G→C，第49672位點(diǎn)T→A，第49692位點(diǎn)C→G（圖9）。對(duì)略陽麻羽烏雞、略陽普通雞、略陽黑羽烏雞、紅色原雞TYR基因編碼區(qū)進(jìn)行翻譯和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)第757位點(diǎn)、第849位點(diǎn)、第49351位點(diǎn)3個(gè)堿基存在遺傳變異，但是其中均為同義突變，并不導(dǎo)致氨基酸序列的改變。對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的堿基變異是否影響略陽雞TYR基因的表達(dá)量，進(jìn)而影響黑色素的形成還有待進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)與討論

烏雞在表型性狀上與普通雞最明顯的差異是體內(nèi)含有大量黑色素，酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶， 其表達(dá)和活性決定著黑色素生成的速度和產(chǎn)量[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)黑色素的合成是由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼產(chǎn)物共同參與與調(diào)控的級(jí)聯(lián)過程[19]。Levine[20]提出至少有4個(gè)TYR基因家族成員參與黑色素的合成，由于酪氨酸酶的重要性，編碼酪氨酸酶的基因也就成了研究黑色素性狀和白化病的熱點(diǎn)候選基因。雞的TYR位點(diǎn)是復(fù)等位基因位點(diǎn)，雞的第1外顯子6個(gè)核苷酸的缺失導(dǎo)致白化，這些核苷酸編碼天冬氨酸和色氨酸，而這2個(gè)氨基酸從兩棲動(dòng)物到人都是保守的，可見這2個(gè)氨基酸在結(jié)構(gòu)和功能上都起著重要作用[21，22]。目前雞的TYR基因的全序列和控區(qū)序列均已完成測(cè)序，但在不同家禽品種上的研究相對(duì)較少，陳志強(qiáng)等[23]通過研究明星肉雞與絲羽烏雞的TYR基因5′調(diào)控區(qū)單鏈構(gòu)想多態(tài)，發(fā)現(xiàn)調(diào)控區(qū)有3個(gè)SNP，并且這些SNP位點(diǎn)與雞的脛色和膚色顯著相關(guān)。張建勤等[24]、Zhang等[25]采用PCR-SSCP方法，對(duì)中國(guó)寧夏固原雞、海南文昌雞、西藏藏雞和引進(jìn)品種海賽克斯雞TYR基因5′側(cè)翼區(qū)及外顯子1的遺傳變異進(jìn)行了研究。結(jié)果表明中國(guó)地方雞品種的TYR基因蘊(yùn)藏豐富的變異資源。

烏雞因其體內(nèi)豐富的黑色素沉積而具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健功能和重要經(jīng)濟(jì)性狀。略陽烏雞是中國(guó)四大烏雞品種之一，現(xiàn)已成功申報(bào)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，具有“六端烏”的特性，探索其黑色素形成機(jī)理為略陽烏雞進(jìn)一步品系化培育和資源保護(hù)提供了較好的理論基礎(chǔ)，也可為烏骨雞和禽類黑色素的形成機(jī)制研究提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究以略陽普通雞和麻羽烏雞為對(duì)照，結(jié)合GenBank公布雞的TYR基因序列，分析了23只略陽雞TYR基因編碼區(qū)的遺傳變異，分析不同SNP位點(diǎn)與雞的羽色和肉色的關(guān)系。略陽普通雞的羽色為麻色，肉色為普通色，麻羽烏雞的羽色為雜色，肉色為黑色，略陽黑羽烏雞所有性狀均為黑色。研究發(fā)現(xiàn)TYR基因編碼區(qū)3個(gè)突變位點(diǎn)在略陽烏雞群體均有分布，但是突變位點(diǎn)均為同義突變，沒有造成氨基酸序列的變異，不影響酪氨酸酶的蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能。這一結(jié)果與前人研究結(jié)果基本符合，因?yàn)槔野彼崦甘呛谏睾铣傻南匏倜?，一般是高度保守的，如果一些氨基酸序列的變異將影響其功能，可能?dǎo)致白化病等生理現(xiàn)象。由于本研究的略陽雞是正常個(gè)體，毛色都有顏色，所以TYR的氨基酸序列沒有差異是正常的，說明略陽烏雞和普通雞的TYR基因是高度保守的，但是它們?cè)谀w色和毛色黑色素含量上的差異可能是由另外的基因造成的，也可能是由TYR基因表達(dá)量的差異引起的。本研究另外發(fā)現(xiàn)略陽烏雞與普通雞的TYR基因在啟動(dòng)子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)的DNA序列存在遺傳差異，這些差異是否與酪氨酸酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄剪接有關(guān)，進(jìn)而影響烏雞黑色素的沉積還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陜西省家畜家禽品種志編輯委員會(huì).陜西省家畜家禽品種志[M].西安：三秦出版社，1988.

[2] 侯文通.中國(guó)西北重要地方畜禽遺傳資源[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[3] 趙漢成，朱勇斌，王泉鑌，等.略陽烏雞申報(bào)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的探討[J].家禽科學(xué)，2008（11）：38-39.

[4] 李彩霞.略陽烏雞保種利用現(xiàn)狀與綜合開發(fā)對(duì)策探討[J]. 家禽科學(xué)，2010（11）：31-33.

[5] 王哲鵬，鄧學(xué)梅，王安如.烏雞黑色素對(duì)果蠅的紫外輻射保護(hù)作用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，12（1）：17-21.

[6] 蔡華珍，吳 勇.烏雞黑色素抗紫外線功能的應(yīng)用研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（11）：47-49.

[7] SARNA T J， WIELGUS A， SKUMATZ C M，et al. Antioxidant properties of human iridial melanin[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2003，44（5）：1866-1870.

[8] JACOBSON E S， HOVE E， EMERY H S. Antioxidant function of melanin in Black Fungi[J]. Infection and Immunity，1995， 63（12）：4944-4945.

[9] ROZANOWSKA M， SARNA T， LAND E J，et al. Free radical scavenging properties of melanin interaction of eu-and pheo-melanin models with reducing and oxidising radicals[J]. Free Radical Biology and Medicine，1999，26（5-6）：518-525.

[10] WANG Z， DILLON J， GAILLARD E R. Antioxidant properties of melanin in retinal pigment epithelial cells[J]. Photochemistry and Photobiology，2006，82（2）：474-479.

[11] ITO S，WAKAMATSU K，OEKI H.Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis[J]. Pigment Cell Research，2000，13（8）：103-109.

[12] 李瑞成，尚永彪，管俊峰.烏骨雞黑色素及其研究進(jìn)展[J].肉類研究，2010， 140（10）： 54-59.

[13] JUAN C E， RAMON V， LORENA G F， et al. Kinetic characterization of the substrate specificity and mechanism of mushroom tyrosinase[J]. European Journal of Biochemistry， 2000，267（5）：1270-1278.

[14] DENOVAN-WRIRHT E M， RAMSEY N B， MCCORMICK J， et al. Nucleotide sequence of transferrin cDNA and tissue-specific.of the transferrin gene in a tlantic cod[J]. Comparative Biochemistry and Physiolog，1996，113（2）：269-273.

[15] DAVID W. Russell Joseph Sambrook Molecular Cloning， 3nd edn[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2002.463-481.

[16] 鄧學(xué)梅.用于雞基因定位的資源群體的建立和黑色素等質(zhì)量性狀的遺傳分析[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

[17] 高 東，杜 飛，朱有勇.低背景、高分辨率PAGE 簡(jiǎn)易銀染法[J].遺傳，2009，31（6）：668-673.

[18] KOWICHI J，DONG L，HUA C，et al. Coordinated mRNA and protein expression of human LAMP-1 in induction of melanogenesis after UV-B exposure and co-Transfection of human tyrosinase and TRP-1 cDNAs[J]. Pigment cell Res. 1994， 7（5）：311-319.

[19] JOHN C A， ALAN H K ，CHERYL A， et al. Skin-nervous system interactions[J]. Journal of Investigative Dermatology，1996，106（1）：198-204.

[20] LEVINE N. Pigmentation and Pigmentary Disorders 1st ed [M].Florida：CRC Press，1993.334-335.

[21] 楊舒黎，毛華明.酪氨酸酶基因研究進(jìn)展[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2003，20（9）：22-23.

[22] BOISSY R E，MOELLMANN G E，HALABAN R. Tyrosinase and acid phosphatase activities in melanocytes from avian albinos[J]. Journal of Investigative Dermatology，1987，88（3）：292-300.

[23] 陳志強(qiáng)，鄧學(xué)梅，周 軍，等.雞的酪氨酸酶基因5′調(diào)控區(qū)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（2）：191-194.

[24] 張建勤，陳 宏，孫兆軍，等.不同雞品種TYR基因遺傳變異分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（9）：1153-1158.

[25] ZHANG J Q，CHEN H，SUN Z J，et al.Flesh color association with polymorphism of the tyrosinase gene in different Chinese chicken breeds[J].Mol Biol Rep，2010，37（1）：165-169.