程騰　賀小英　馬利兵

摘要：通過轉(zhuǎn)染特定的一個或多個基因?qū)⒁逊只捏w細(xì)胞誘導(dǎo)成為多潛能干細(xì)胞，這種干細(xì)胞稱為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPS cells）。近年來關(guān)于iPS細(xì)胞的研究取得了舉世矚目的成就，多種已分化的體細(xì)胞都可以誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞，而且可以進一步將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)性細(xì)胞。這些研究極大地促進了細(xì)胞生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的研究，并且為人類再生醫(yī)學(xué)和特異的細(xì)胞治療帶來了更美好的希望。對iPS細(xì)胞和誘導(dǎo)性細(xì)胞的最新研究狀況進行了綜述。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）；誘導(dǎo)性細(xì)胞；細(xì)胞治療

中圖分類號：Q813 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-0993-05

將已分化的體細(xì)胞重編程為類胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的技術(shù)完成于2006年。Takahashi等[1]通過外源表達一組選擇性的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入成體小鼠成纖維細(xì)胞，最終確定最少有4種轉(zhuǎn)錄基因組合——Oct4（也稱Pou5f1、Oct3/4）、Sox2、Klf4和c-Myc可將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）。從此iPS細(xì)胞的研究開始成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱門，并且iPS細(xì)胞的來源也越來越廣泛。利用iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)將終末分化細(xì)胞先誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，再進一步誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞等，稱為誘導(dǎo)性細(xì)胞。時至今日研究者已經(jīng)開始嘗將iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療。

1 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的研究進展

從iPS細(xì)胞誕生之日起，iPS細(xì)胞的研究就成為細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱門。起初，研究者誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時，iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率極低，而且他們用的是4個轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，其中c-Myc還具有一定的致癌作用。后來經(jīng)過科學(xué)家們的不斷嘗試，開始用小分子化合物、miRNA、mRNA或蛋白質(zhì)等導(dǎo)入細(xì)胞來誘導(dǎo)iPS細(xì)胞[1-6]，轉(zhuǎn)錄因子的個數(shù)也從4個減少到1個，甚至只用小分子化合物等物質(zhì)來誘導(dǎo)iPS細(xì)胞[7-9]。近年來iPS細(xì)胞研究取得了突破性進展，如建立了人類疾病特異的iPS細(xì)胞，借助鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)座子等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效制備了無病毒的iPS細(xì)胞[10-13]。

從2007年Takahashi 等[2]和Yu等[3]先后將人的體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞開始，多種人類成體干細(xì)胞被重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞，但是直到2013年Trokovic等[14]才將人類骨骼成肌細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，他們通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（圖1）或仙臺病毒載體介導(dǎo)目的基因的異位表達，在無飼養(yǎng)層且含有適宜的培養(yǎng)基條件下，可以使人類骨骼成肌細(xì)胞達到和人類成纖維細(xì)胞一樣的重編程效率，再加入組蛋白脫乙酰酶抑制劑丙戊酸鈉（VPA）、丁酸鈉（NaB）和ALK4/5/7抑制劑SB431542（SB），能明顯提高人類骨骼成肌細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。

到目前為止，除了人之外，小鼠、大鼠、猴子、綿羊、豬的iPS細(xì)胞系均已建立[15-19]。

iPS細(xì)胞研究的意義重大，它不僅為多潛能干細(xì)胞[20]的獲取提供了新的途徑，而且避免了傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞研究中存在的倫理問題，同時還解決了免疫排斥反應(yīng)問題，為細(xì)胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)提供了平臺（圖2），使人們在細(xì)胞和分子水平上研究人類多種疾病及其發(fā)病機理成為可能（圖3），也為相應(yīng)藥物的研發(fā)提供了便利。正是由于iPS細(xì)胞技術(shù)使得整個細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)生了質(zhì)的飛躍，所以Yamanaka榮獲了2012年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。當(dāng)然，目前iPS細(xì)胞的發(fā)生機制還不是十分明確，還有待深入了解，iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率仍然很低，整個誘導(dǎo)過程相對繁瑣，費用比較昂貴，達到商業(yè)化、大眾化應(yīng)用的地步還有些遙遠，這一切都有待進一步研究和開發(fā)。

2 誘導(dǎo)性細(xì)胞的研究進展

利用iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子組合，再加入一些小分子化合物等物質(zhì)，將終末分化細(xì)胞先誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，再進一步誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，稱為誘導(dǎo)性細(xì)胞或誘導(dǎo)性功能細(xì)胞。到目前為止，已經(jīng)在多種具有重要功能的細(xì)胞上誘導(dǎo)成功[21-23]。

2.1 誘導(dǎo)性造血和血管祖細(xì)胞

Park等[21]在改進的無飼養(yǎng)層的內(nèi)皮培養(yǎng)條件下，利用了一組重組生長因子[骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和纖維母細(xì)胞生長因子2（FGF2）]的最適組合，然后在成分明確的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（EGM-2）中附著低密度培養(yǎng)，用人類胚胎干細(xì)胞和人類誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞培育出大量的CD34+CD45+造血祖細(xì)胞（表1）。這些造血祖細(xì)胞出現(xiàn)在附著于內(nèi)皮或基質(zhì)的細(xì)胞層周圍，從某種意義上來說，這種方式與體內(nèi)胚胎生血內(nèi)皮的造血方式類似。雖然之前已經(jīng)證實由成纖維細(xì)胞衍生而來的hiPSC細(xì)胞系并不具備有效分化為造血內(nèi)皮的能力，但是這個培養(yǎng)體系能夠使hiPSC具有和hESC一樣分化為造血內(nèi)皮的能力。這個有效的分化體系可用于直接延時攝像和造血發(fā)生過程的時間進程研究等。

2.2 誘導(dǎo)性神經(jīng)細(xì)胞

Kuo等[22]在由海藻酸和多聚γ-谷氨酸（γ-PGA）以及表面神經(jīng)生長因子構(gòu)成的水凝膠中將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元。這種由海藻酸和多聚γ-谷氨酸（γ-PGA）以及表面神經(jīng)生長因子構(gòu)成的水凝膠在整個誘導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用，而孔隙結(jié)構(gòu)、孔隙度和溶脹比也有一定的影響。在這種水凝膠中，iPS細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)圖像（圖4）展示出神經(jīng)元的特點。在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程中，表面神經(jīng)生長因子可以增強β Ⅲ微管蛋白的表達強度而抑制SSEA-1的表達強度。iPS細(xì)胞在這種水凝膠中的分化可以通過SSEA-1和β Ⅲ微管蛋白的表面抗原免疫化學(xué)染色和掃描電子顯微鏡來觀察鑒定。

2.3 誘導(dǎo)性心肌細(xì)胞

Jiang等[23]使用從Oct4-GFP-C57小鼠身上獲得的心臟成纖維細(xì)胞（Cardiac fibroblasts，CFs）感染逆轉(zhuǎn)錄表達重組因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）來誘導(dǎo)功能性心臟細(xì)胞（Cardiomyocytes，CMs）。以初代的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（MEFs）作為對照，試驗發(fā)現(xiàn)由CFs衍生而來的iPS細(xì)胞（CF-iPS）與胚胎干細(xì)胞（EBs）及MEF衍生而來的iPS細(xì)胞（MEF-iPS）具有同樣的生理學(xué)特性。他們使用經(jīng)典擬胚體的方法和Transwell CM共培養(yǎng)體系來模擬心肌旁分泌微環(huán)境，進而將CF-iPS向功能性心肌細(xì)胞誘導(dǎo)。在模擬的心肌旁分泌微環(huán)境中，CF-iPS自發(fā)地形成可以跳動的EBs。這些分化而來的能夠自發(fā)跳動的細(xì)胞可以表達心臟特有的組織特異性轉(zhuǎn)錄和結(jié)構(gòu)因素，而且顯示出典型的心肌形態(tài)學(xué)和電生理特征。

當(dāng)然，除了上述誘導(dǎo)性造血和血管細(xì)胞、誘導(dǎo)性神經(jīng)細(xì)胞和誘導(dǎo)性心肌細(xì)胞外，還有其他的誘導(dǎo)性功能細(xì)胞也已經(jīng)被人們所發(fā)現(xiàn)并認(rèn)知。如Yamaguchi等[24]將小鼠的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成肥大細(xì)胞。

3 展望

iPS細(xì)胞自誕生之日起即受到人們的關(guān)注，iPS細(xì)胞的研究開創(chuàng)了細(xì)胞生物學(xué)的新篇章，也極大地促進了表觀遺傳學(xué)和胚胎生物學(xué)的發(fā)展，為人類再生醫(yī)學(xué)和特異的細(xì)胞治療帶來了更美好的希望。

如果供體細(xì)胞是來源于病人自身的體細(xì)胞，就可以避免免疫排斥反應(yīng)問題，將這些體細(xì)胞先誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，進而再誘導(dǎo)成具有特定功能的目的細(xì)胞，理論上就可以用于臨床醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)，這樣就有望實現(xiàn)個性化治療。然而，到目前為止，誘導(dǎo)性功能細(xì)胞的種類有限，誘導(dǎo)效率也有待提高，并且細(xì)胞的功能仍需要大量動物模擬試驗驗證。

目前，如何獲取更多的從終末分化細(xì)胞誘導(dǎo)而來的iPS細(xì)胞，并進一步誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞成為熱點，對多種體細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞和多種新的培養(yǎng)誘導(dǎo)方法[25-28]也已經(jīng)進行了嘗試。

盡管這種誘導(dǎo)的功能性體細(xì)胞在將來可能具有較高的應(yīng)用價值，但是其中的詳細(xì)機理仍需要探索明確。相信在胚胎干細(xì)胞研究、iPS細(xì)胞研究、現(xiàn)代基因組學(xué)和RNA組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和帶動下，在不遠的將來，越來越多的誘導(dǎo)性功能細(xì)胞有望在臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)研究上發(fā)揮重要作用，從而加快再生醫(yī)學(xué)和動物組織工程的發(fā)展，同時，也能促進發(fā)育生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等基礎(chǔ)研究的發(fā)展。

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