崔麗娟，徐剛，孟梟，吳堅(jiān)平，楊立榮

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027）

多元電解質(zhì)對脂肪酶有機(jī)相拆分炔戊醇的激活

崔麗娟，徐剛，孟梟，吳堅(jiān)平，楊立榮

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027）

脂肪酶是一種應(yīng)用節(jié)廣泛的重要生物催化劑，提高脂肪酶在非天然環(huán)境中的催化性能逐步成為了一個研究熱點(diǎn)。研究表明，某些電解質(zhì)的加入可顯著提高提脂肪酶在有機(jī)溶劑體系中的酶活和選擇性。然而有關(guān)研究主要考察單一電解質(zhì)的作用，且涉及的電解質(zhì)種類較少，更為系統(tǒng)的研究未見報道。本文以洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacialipase，即PcL）催化手性菊酯農(nóng)藥前體4-甲基庚-4-烯基-1-炔基-3-醇（炔戊醇）在甲苯中選擇性轉(zhuǎn)酯化為模型，系統(tǒng)考察了鹵化物、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等8類35種電解質(zhì)單獨(dú)以及多種電解質(zhì)協(xié)同對PcL催化性能的影響。結(jié)果表明，NaF-Na2HPO4/NaH2PO4的二元電解質(zhì)體系具有遠(yuǎn)高于任意單一電解質(zhì)組分的性能，該體系使PcL活力提高23倍。進(jìn)一步研究表明，這一電解質(zhì)體系對PcL催化不同對映體轉(zhuǎn)酯化的活力提高程度不同，從而將其對映體選擇率（E值）由11提高到21。

有機(jī)相；電解質(zhì)；脂肪酶；對映體選擇性；催化活力

有機(jī)相酶催化研究是一個值得關(guān)注的焦點(diǎn)。為了改善酶在有機(jī)相中的催化特性，研究者從不同角度出發(fā)，設(shè)計(jì)了一系列高效的研究方法[1-3]。這些方法可簡單分為兩類：催化劑工程和溶劑工程。前者主要通過蛋白質(zhì)工程或調(diào)控酶的微環(huán)境[4-8]來改善酶的催化性能；后者主要通過添加少量水[9]或改變?nèi)軇┑氖杷訹10]和極性[11]來改善酶的催化性能。其中，通過加入電解質(zhì)來調(diào)控酶的微環(huán)境是最簡便有效的。研究表明，經(jīng)電解質(zhì)處理后，酶的催化性能得到顯著改善[12-15]，這引起了學(xué)術(shù)界對其研究的廣泛興趣。1994年Clark等[16]首次報道了在酶的冷凍干燥（大多數(shù)應(yīng)用到有機(jī)相體系中的酶粉由噴霧干燥制得，而經(jīng)電解質(zhì)處理的酶粉需要特殊方法制備，如冷凍干燥等）體系中加入非緩沖鹽可以大幅度提高其催化效率。他們通過向Hay bacillus protease的凍干體系中加入KCl，使其在正己烷中酯交換反應(yīng)的kcat/Km值比無鹽加入時提高了3750倍。Yang等[17]發(fā)現(xiàn)通過加入EDTA-2Na，Candidasp. Lipase在正己烷中的轉(zhuǎn)酯化活力較原始酶提高了27倍。Yu等[18]發(fā)現(xiàn)加入LiCl后，Candida rugosaLipase在異辛烷中的酯化活力較原始酶提高了2倍，選擇性提高了1.6倍。Salis等[19]發(fā)現(xiàn)向Pseudomonas cepaciaLipase（PcL）的凍干體系中加入Na2SO4后，其在2-甲基-2-丁醇中的酯化活力較原始酶提高了9倍。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，通過精確調(diào)控凍干過程，磷酸緩沖鹽摻雜能夠?qū)cL在有機(jī)相中的轉(zhuǎn)酯化活性提高近10倍，達(dá)到其水相本征活性的50 %。但目前在非天然體系中，關(guān)于電解質(zhì)對脂肪酶催化性能影響的系統(tǒng)性研究以及不同電解質(zhì)的協(xié)同作用卻鮮有報道。

本文以PcL在甲苯中催化4-甲基庚-4-烯基-1-炔基-3-醇（炔戊醇，MEYO）與乙酸乙烯酯轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)為研究對象，其中，炔戊醇是一種重要的手性農(nóng)藥中間體，其S構(gòu)型是一類擬除蟲菊酯產(chǎn)品的活性組分[21]。通過對35種電解質(zhì)及其不同組合的研究，系統(tǒng)性地考察了電解質(zhì)的種類、組合方式以及電解質(zhì)的濃度對有機(jī)相中脂肪酶酶促轉(zhuǎn)酯催化性能的影響，最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)NaF-Na2HPO4/NaH2PO4的二元電解質(zhì)體系（NaF 0.24mmol/L，Na2HPO4/ NaH2PO4100mmol/L）處理后，PcL的催化活力提高了23倍，對映體選擇率提高到初始的2倍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepaciaLipase，縮寫為PcL，商品名Lipase PS）購自Amano Enzyme Inc.。炔戊醇、甲苯、乙酸乙烯酯、NaF、NaSCN、NaNO3、Na2CO3、Na2SO4、NaH2PO4、CH3COONa、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、NaOH、HCl等，購于Sigma-Aldrich Inc.。

1.2 經(jīng)電解質(zhì)處理的PcL樣品制備

按需配制一定濃度的電解質(zhì)溶液，用pH計(jì)（PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行校準(zhǔn)，調(diào)整溶液的pH值到7.0。然后在4℃下，將0.030gPcL溶于3mL上述電解質(zhì)溶液中，振蕩，分裝，-196℃預(yù)凍20min，冷凍干燥12h，冷凍干燥方法參照文獻(xiàn)[22]，凍干完成后將樣品取出，儲于4℃保存待用。

1.3 模型反應(yīng)

PcL催化轉(zhuǎn)酯化拆分炔戊醇的反應(yīng)式如圖式1所示。反應(yīng)在2mL Axygen密閉反應(yīng)管中進(jìn)行。反應(yīng)條件為：甲苯1mL，炔戊醇100mmol/L，乙酸乙烯酯300mmol/L，粗酶粉（處理或未處理）10mg/mL，35℃，轉(zhuǎn)速220r/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用氣相色譜儀（Fuli 9790型，溫嶺福立分析儀器有限公司）分析樣品中各組分含量，CP-cyclodextrin-B-2,3,6-M-19手性柱。色譜條件為：氣化溫度250℃，檢測溫度260℃，柱溫110℃，載氣氮?dú)饬魉贋?5mL/min。(S)-酯、(R)-酯、(R)-醇和(S)-醇對應(yīng)的保留時間均由標(biāo)品確定，分別為20.8min、21.8min、22.5min 和24.7min。

根據(jù)反應(yīng)初始階段（轉(zhuǎn)化率小于5%）單位時間內(nèi)產(chǎn)物的增加量計(jì)算PcL的酶活。

圖1 PcL催化轉(zhuǎn)酯化拆分rac-炔戊醇

式中，X 為底物轉(zhuǎn)化率，X = (c0- c)/c0，c0及 c分別為反應(yīng)前后底物醇的濃度，mmol/L；t為反應(yīng)進(jìn)行的時間，min；m為反應(yīng)中使用的酶量，mg；p為PcL的蛋白含量，%。

參照文獻(xiàn)[23]計(jì)算反應(yīng)的對映體選擇率：E = ln[1-X(1+eep)]/ln[1-X(1-eep)]，其中eep為產(chǎn)物對映體過剩值，eep=|(S)-酯%-(R)-酯%|/[(S)-酯%+(R)-酯% ]。

2 結(jié)果與討論

2.1 電解質(zhì)種類對PcL催化轉(zhuǎn)酯性能的影響

系統(tǒng)考察了8類35種電解質(zhì)及其組合方式對PcL催化炔戊醇轉(zhuǎn)酯性能的影響，陽離子的影響見表1?？芍?，除Ni2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+和Zn2+等過渡金屬離子外，大部分陽離子對PcL催化活力的影響較微弱，過渡金屬離子易與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，形成沉淀，從而造成酶分子的不可逆失活。作者認(rèn)為，電解質(zhì)一方面可以調(diào)節(jié)酶微環(huán)境中的水活度，另一方面可以通過與酶分子間形成氫鍵和鹽橋來調(diào)節(jié)酶制劑的極性。而在不同溶劑中，同一種脂肪酶對水活度與極性的需求不同。這也是與文獻(xiàn)[17] 相比，該反應(yīng)體系中 Na2SO4（表 1，編號1）未對PcL產(chǎn)生激活作用的原因。

陰離子的影響見表2?？芍?，大部分陰離子對PcL催化轉(zhuǎn)酯活力未見激活作用，而F-與其他鹵離子顯示出不同的規(guī)律，添加NaF（表2，編號20）后，PcL的催化活力較原始酶提高了1.6倍，因F-原子半徑較小，負(fù)電荷集中，易與酶分子周圍的陽離子產(chǎn)生靜電相互作用，利于維持酶分子的原始構(gòu)象；加入Na2HPO4/NaH2PO4（表2，編號30）后，PcL的催化活力較原始酶提高了1.7倍，其激活程度小于文獻(xiàn)[18] 中的數(shù)值，除溶劑因素外，磷酸緩沖鹽pH值的不同也是影響酶催化性能的關(guān)鍵因素。

表 1 電解質(zhì)陽離子對 PcL 催化轉(zhuǎn)酯性能的影響

表2 電解質(zhì)陰離子對PcL催化轉(zhuǎn)酯性能的影響

除陰陽離子外，進(jìn)一步研究了多種陰陽離子協(xié)同作用對PcL催化轉(zhuǎn)酯性能的影響，表3可知，不同電解質(zhì)組合后，PcL被迅速激活，經(jīng)NaF與Na2HPO4/NaH2PO4（表3，編號5）混合作用，PcL的催化活力較原始酶提高了17倍，可見，多種電解質(zhì)混合后具備了不同于單一電解質(zhì)獨(dú)立存在時的性質(zhì)。此結(jié)論獨(dú)立于電解質(zhì)對脂肪酶的激活機(jī)理遵循霍夫邁斯特次序（按電解質(zhì)聚沉能力的大小，排列所得）[24]，以及與電解質(zhì)JDB因子（JDB因子用來衡量電解質(zhì)增加或降低水黏度的程度）[25]相關(guān)的假說。

2.2 電解質(zhì)濃度對PcL催化轉(zhuǎn)酯性能的影響

由圖2可見，當(dāng)NaF或Na2HPO4/NaH2PO4單獨(dú)存在時，電解質(zhì)濃度對PcL催化活力的影響不甚顯著； NaF-Na2HPO4/NaH2PO4協(xié)同作用后，36組不同濃度組合呈現(xiàn)出規(guī)律性分布。在一定范圍內(nèi)，電解質(zhì)總濃度的提高較電解質(zhì)濃度單一性提高，PcL催化活力的提升更加顯著，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定含量后，PcL的催化活力隨著電解質(zhì)含量的增加而不斷下降。推測，電解質(zhì)含量的增加有利于其與酶分子間相互作用力的形成，經(jīng)飽和狀態(tài)之后，繼續(xù)增加電解質(zhì)的含量，此時多余的電解質(zhì)就會覆蓋在酶分子的表面，阻礙脂肪酶與底物的接觸，從而使PcL的催化活力下降?？梢?，適宜的電解質(zhì)含量有利于保持酶的催化活力，當(dāng)NaF與Na2HPO4/NaH2PO4的濃度分別為0.24mmol/L、100mmol/L時，PcL的催化活力[3.342U/(mg蛋白質(zhì))]達(dá)到最佳，約為原始PcL催化活力[0.148U/(mg蛋白質(zhì))]的23倍。

表 3 電解質(zhì)的不同組合對PcL催化轉(zhuǎn)酯性能的影響

2.3 電解質(zhì)對PcL 催化不同對映體轉(zhuǎn)酯活力的影響

圖2 NaF與Na2HPO4/NaH2PO4的濃度對PcL催化轉(zhuǎn)酯活力的影響

圖3 NaF-Na2HPO4/NaH2PO4二元電解質(zhì)體系對PcL催化不同對映體轉(zhuǎn)酯化活力的影響

研究了PcL催化的單一構(gòu)型（R或S）炔戊醇體系，圖3為 NaF-Na2HPO4/NaH2PO4二元電解質(zhì)體系對PcL催化不同對映體轉(zhuǎn)酯化活力的影響。由圖3可見，對同一種構(gòu)型而言，NaF-Na2HPO4/ NaH2PO4二元電解質(zhì)體系比任意單一電解質(zhì)（NaF或 Na2HPO4/NaH2PO4）對PcL催化活力的影響更加顯著，這亦進(jìn)一步證實(shí)2.1節(jié)的研究結(jié)果；兩種構(gòu)型相比較，以原始酶的催化活力為基準(zhǔn)，分別向凍干體系中加入NaF、 Na2HPO4/NaH2PO4、NaFNa2HPO4/NaH2PO4后，υR的提高較υS更加明顯，從而使其對映體選擇率（E值）由 11提高到21。

3 結(jié) 論

通過對8類35種電解質(zhì)及其組合的研究，表明多種電解質(zhì)的協(xié)同作用比單一電解質(zhì)對PcL催化性能的影響更加顯著。另外，經(jīng)電解質(zhì)處理后，酶催化不同對映體轉(zhuǎn)酯化活力提高的程度不同，從而使其對映體選擇率（E值）得到相應(yīng)的提高。

[1] 周勤麗，孟梟，徐剛，等. 基于化學(xué)修飾法探討脂肪酶對手性伯醇的識別機(jī)理[J]. 化工進(jìn)展，2013，32（11）：2695-2706.

[2] 曾嶸，楊忠華，姚善涇. 生物催化羰基不對稱還原合成手性醇的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展，2004，23（11）：1169-1173.

[3] 張玉彬. 生物催化的手性合成[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：6-8.

[4] Ru M T，Hirokane S Y，Lo A S，et al. On the salt-induced activation of lyophilized enzymes in organic solvents：Effect of salt kosmotropicity on enzyme activity[J].J. Am. Chem. Soc.，2000，122（8）：1565-1571.

[5] Wehtje E，Adlercreutz P，Mattiasson B. How do additives affect enzyme activity and stability in nonaqueous media[J].Biotechnol. Bioeng.，1997，54（1）：67-76.

[6] Ghanem A. The utility of cyclodextrins in lipase-catalyzed transesterification in organic solvents：Enhanced reaction rate and enantioselectivity[J].Org. Biomol. Chem.，2003，1（8）：1282-1291.

[7] Dabulis K，Klibanov A M. Dramatic enhancernent of enzymatic activity in organic solvents by lyoprotectants[J].Biotechnol. Bioeng.，1993，41（5）：566-571.

[8] Morgan J A，Clark D S. Salt-activation of nonhydrolase enzymes for use in organic solvents[J].Biotechnol. Bioeng.，2004，85（4）：456-459.

[9] Serdakowski A L，Munir I Z，Dordick J S. Dramatic solvent and hydration effects on the transition state of soybean peroxidase[J].J. Am. Chem. Soc.，2006，128（44）：14272-14273.

[10] Parida S，Dordick J S. Substrate structure and solvent hydrophobicity control lipase catalysis and enantioselectivity in organic media[J].J. Am. Chem. Soc.，1991，113（6）：2253-2259.

[11] Guinn R M，Skerker P S，Kavanaugh，et al. Activity and flexibility of alcohol dehydrogenase in organic solvents[J].Biotechnol. Bioeng.，1991，37（4）：303-308.

[12] Lindsay J P，Clark D S，Dordick J S. Combinatorial formulation of biocatalyst preparations for increased activity in organic solvents：Salt activation of penicillin amidase[J].Biotechnol. Bioeng.，2004，85（5）：553-560.

[13] Collins K D. Sticky ions in biological systems[J].Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，1995，92：5553-5557.

[14] Eppler R K，Komor R S，Huynh J，et al. Water dynamics and salt-activation of enzymes in organic media：Mechanistic implications revealed by NMR spectroscopy[J].PNAS，2006，103（15）：5706-5710.

[15] Hsu W T，Clark D S. Variations in the Enantioselectivity of salt-activated subtilisin induced by lyophilization[J].Biotechnol. Bioeng.，2001，73（3）：231-237.

[16] Khmelnitsky Y L，Welch S H，Clark D S，et al.Salts dramatically enhance activity of enzymes suspended in organic solvents[J].J. Am. Chem. Soc.，1994，116（6）：2647-2648.

[17] Wang P，Yang L R，Wu J P. Immobilization of lipase by salts and the transesterification activity in hexane[J].Biotechnol. Lett.，2001，23：1429-1433.

[18] Yu H W，Chen H，Yang Y Y，et al. Effect of salts on activity，stability and enantioselectivity ofCandida rugosalipase in isooctane[J].J. Mole. Catal. B.，2005，35：28-32.

[19] Bilanicova D，Salis A，Ninham B W，et al. Specific anion effects on enzymatic activity in nonaqueous media[J].J. Phys. Chem B.，2008，112（38）：12066-12072.

[20] Jin Q R，Jia G Q，Wang X L，et al. Comparison of the salt-induced activation ofPseudomonas cepacialipase in organic media by phosphate buffer and sodium sulfate[J].Chin. J. Catal.，2013，34（6）：1224-1231.

[21] Mitsuda S，Matsuo N，Nabeshima S. Preparation of (-)-α-ethynyl alcohol moieties of pyrethroid isecticides by lipase-catalyzed enantioselectivity hydrolysis[J].Biosci. Biotechol. Biochem.，1992，56（2）：357-358.

[22] Ru M T，Dordick J S，Reimer J A，et al. Optimizing the salt-induced activation of enzymes in organic solvents：Effects of lyophilization time and water content[J].Biotechnol. Bioeng.，1999，63（2）：233-241.

[23] Chen C S，F(xiàn)ujimoto Y，Girdaukas G，et al. Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers[J].J. Am. Chem. Soc.，1982，104（25）：7294-7299.

[24] Salis A，Bilanicova D，Ninham B W，et al. Hofmeister effects in enzymatic activity：Weak and strong electrolyte influences on the activity ofCandida rugosaLipase[J].J. Phys. Chem. B，2007，111（5）：1149-1156.

[25] Serdakowski A L，Dordick J S. Enzyme activation for organic solvents made easy[J].Trends Biotechnol.，2008，26（1）：48-54.

Multi-electrolytes activation of Lipase for 4-methylhept-4-en-1-yn-3-ol resolution in organic media

CUI Lijuan，XU Gang，MENG Xiao，WU Jianping，YANG Lirong
（Department of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，Zhejiang，China）

Lipase was an important biological catalyst，which was widely applied in many areas，how to improve its catalytic performance in non-natural environment has become a research hot spot gradually. Studies showed that the specific activity and enantioselectivity of lipase could be improved remarkably by adding some electrolytes into reaction system. However，relevant researches mainly focused on the role of single electrolyte，report on the types of electrolytes involved was much less，and further systematic research has not been reported yet. By utilizingPseudomonas cepacialipase （PcL）as the catalyst，the asymmetric transesterification resolution of 4-methylhept-4-en-1-yn-3-ol was conducted with the precursor of chiral chrysanthemum ester pesticides in hydrophobic organic media，the influences of 8 types，including halide，nitrate，sulfate，phosphate et al，35 kinds of electrolytes and their different combinations on PcL's catalytic performance were investigated systematically. The results indicate that the specific activity of PcL is 23 times higher than that of native lipase with synergistic effect of NaF，Na2HPO4and NaH2PO4. Further study shows that the improvement of enantioselectivity has been achieved from 11 to 21，due to the different degree of activation of enantiomers by PcL.

organic media；electrolytes；lipase；enantioselectivity；catalytic activity

O 643

A

1000-6613（2014）08-2150-05

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.08.035

2013-12-18；修改稿日期：2014-01-07。

國家 973 計(jì)劃（2011CB710800）、國家自然科學(xué)基金（20936002）及國家 863 計(jì)劃（2011AA02A209）項(xiàng)目。

崔麗娟（1989—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：吳堅(jiān)平，副教授，研究方向?yàn)樯锎呋c轉(zhuǎn)化。E-mail wjp@zju.edu.cn。