楊利民，呂金萍，馮妍

（常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164）

蒲公英總黃酮在聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系中的分配與提取

楊利民，呂金萍，馮妍

（常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164）

蒲公英中內(nèi)含的黃酮類物質(zhì)具有較高藥用價值，用雙水相萃取法提取植物中有效成分是新型提取高附加值生物質(zhì)的有效方法。本文考察了PEG/(NH4)2SO4雙水相體系萃取分離蒲公英總黃酮時聚乙二醇相對分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分數(shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)、溫度、pH值5個因素對分配行為的影響，并通過正交實驗優(yōu)化了工藝條件。結(jié)果表明最佳雙水相提取工藝條件為:(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)18%，PEG1000質(zhì)量分數(shù)23%，pH值5.34，提取溫度25℃，NaCl鹽的存在與否對萃取影響很小，蒲公英中總黃酮的提取率可達5.47%。因此，使用雙水相法提取蒲公英總黃酮是該類提取技術(shù)中一種更加綠色環(huán)保和高效的方法。

蒲公英；總黃酮；雙水相；分配；提取

蒲公英又名黃花地丁，屬菊科多年生植物，是一種重要的中草藥，主要成分為黃酮類物質(zhì)，藥用價值高。據(jù)報道黃酮類物質(zhì)有很多的生物活性[1-3]，具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿、緩瀉、退黃疸、利膽等功效[4]。

兩種高聚物或高聚物與某種高價無機鹽溶于水并靜止一段時間后會形成不相容的上下兩相，其中兩相都含有大量的水分，這一兩相體系稱作雙水相體系。這種現(xiàn)象由Beijerinck于1896年第一次發(fā)現(xiàn)，因兩相對某些化學(xué)物質(zhì)的溶解性的差異，雙水相體系被廣泛用作一種較為新型的萃取方法-雙水相萃取，如雙水相萃取被廣泛用于生物化學(xué)和生物化工產(chǎn)品的分離純化[5-6]。與傳統(tǒng)的方法相比，雙水相萃取技術(shù)具有操作條件溫和、易于工業(yè)放大、成本低、過程連續(xù)化等優(yōu)點。目前在中藥提取領(lǐng)域，雙水相萃取已經(jīng)有效應(yīng)用于黃芩苷[7]、葛根素[8]、黃酮類化合物[9-12]、綠原酸[13]等天然中藥化合物的提取，但聚乙二醇（PEG）/(NH4)2SO4雙水相體系在蒲公英總黃酮萃取中的應(yīng)用還尚未見公開報道。本文主要研究了蒲公英總黃酮在PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中的分配行為，檢測了PEG/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖，考察了雙水相組成、溫度、pH值等因素對蒲公英總黃酮提取率的影響，從而可以優(yōu)化雙水相萃取蒲公英總黃酮的工藝條件。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蒲公英全草（采于常州大學(xué)）用清水洗干凈，于65℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥烘干12h，粉粹后過80目篩子；蘆丁標準品，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PEG，平均相對分子質(zhì)量分別為400、1000、4000；95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉，均為市售分析純。

721G可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；WT2102型分析天平，常州萬得天平儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；KQ-3200B超聲波清洗器，鞏義市于華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C pH計，上海盛磁儀器有限公司。

1.2 實驗方法

準確稱取一定量的蒲公英樣品粉末，用石油醚浸泡1h，脫脂。然后倒出，揮發(fā)至干。加入一定量的60%乙醇微波加熱，離心分離得粗提液。

以乙醇粗取液為原料，固定雙水相體系總質(zhì)量10g，在10mL的離心管中加入一定量的PEG和(NH4)2SO4，2mL粗提液，加水至10g，搖勻后2000r/min離心5min，靜置分層。分別測定兩相中總黃酮的含量。按照式（2）、式（3）計算黃酮在雙水相體系中的分配系數(shù)K和萃取率Y。

式中，R為雙水相體系上下相的體積比； Vt為雙水相體系上相體積，mL；Vb為雙水相體系下相體積，mL；K為雙水相體系分配系數(shù)；Ct為雙水相體系中上相黃酮的濃度，mg/mL；Cb為雙水相體系中下相黃酮的濃度，mg/mL；Y為蒲公英黃酮在雙水相中的萃取率，%。

1.3 蒲公英中總黃酮含量的測定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測定總黃酮含量[14]，以蘆丁為標準品，溶液在400～700nm波長范圍內(nèi)全波長掃描，在波長507～510nm出現(xiàn)最大值，結(jié)合文獻數(shù)據(jù)，選擇用510nm波長測定標準曲線和蒲公英總黃酮的含量。黃酮類化合物濃度C與吸光度A的線性回歸方程式為：y=11.59714x-0.0031，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。由標準曲線計算出總黃酮含量。蒲公英中總黃酮的提取率如式（4）。

式中，m為提取液中總黃酮的質(zhì)量，g；M為加入的蒲公英樣品粉末的總質(zhì)量，g。

1.4 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的制作

25℃下，根據(jù)Albertsson濁點法[15]，分別測定并制作由PEG400、PEGl000、PEG4000與(NH4)2SO4溶液形成的各體系相圖。

準確稱取2.0g 40%PEG400溶液于燒杯中，加入已知濃度的(NH4)2SO4溶液，振蕩，滴至混合物體系剛好出現(xiàn)渾濁狀態(tài)，記錄加入的質(zhì)量（g），然后加水至溶液澄清，記錄加入水的質(zhì)量（g）。算出此時PEG和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量分數(shù)，即得相圖中的一個點。重復(fù)上述操，以硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為橫坐標，PEG質(zhì)量分數(shù)為縱坐標作圖，即可得PEG/硫酸銨體系相圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系相圖

測得的雙水相相圖如圖1所示，曲線上的點為臨界點，曲線下方為單相區(qū)，不分相；上方為兩相區(qū)。

在兩相區(qū)內(nèi)，上相富含PEG，下相富含(NH4)2SO4，在(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)一定時，PEG相對分子質(zhì)量越大，成相時所需的PEG的質(zhì)量分數(shù)越小，越易形成雙水相體系。但是PEG分子量越大，黏度越大，分相時間越長。當PEG質(zhì)量分數(shù)一定時，(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)過低不能形成兩相；過高會析出。因此，實驗點應(yīng)從曲線上方的區(qū)域選取，但PEG相對分子質(zhì)量、質(zhì)量分數(shù)以及(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)三者需相互協(xié)調(diào)。

圖1 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖

2.2 雙水相萃取的影響因素

2.2.1 PEG相對分子質(zhì)量對萃取的影響

根據(jù)相圖，選擇質(zhì)量分數(shù)均為20%的不同相對分子質(zhì)量的PEG（400、1000、4000）和質(zhì)量分數(shù)為20%的(NH4)2SO4分別組成雙水相體系，研究蒲公英中總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y的變化，結(jié)果見表1。表1中，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，上下相體積比R逐漸減小，下相體積逐漸增大。分配系數(shù)K在PEG相對分子質(zhì)量為400時較小，1000和4000時，相差不大。PEG相對分子質(zhì)量對萃取率Y影響不明顯。這與文獻[10，16]結(jié)論一致。因為PEG相對分子質(zhì)量越低，親水性越好，成相時水分分配得越多，上下相體積比越大。隨著PEG相對分子質(zhì)量增加，雖然上相體積減少，但總黃酮濃度增加，分配系數(shù)增大，有利于后續(xù)總黃酮與上相的分離。綜合來看，PEG1000萃取效果最好，所以后續(xù)試驗都采用PEG1000進行相關(guān)研究。

2.2.2 PEG1000質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響

考察了PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)對上下相體積、分配系數(shù)和萃取率影響。用3組不同的(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)在改變PEG質(zhì)量分數(shù)的條件下，進行了一系列的實驗。結(jié)果表明，(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為18%時的萃取效果最好。依此為例加以說明（表2）。當PEG質(zhì)量分數(shù)小于18%時，體系不能形成兩相；PEG質(zhì)量分數(shù)大于26%時，會有鹽析出。隨著PEG質(zhì)量分數(shù)的增加，兩相的體積比R逐漸增大，下相體積逐漸減小。這與文獻[12]結(jié)論一致。因為PEG質(zhì)量分數(shù)增加，奪取鹽相中水分子的能力增強，上相體積增加，上相中PEG的濃度依然是增加的，這有利于蒲公英總黃酮更多分配到上相中，因此分配系數(shù)和萃取率都增大?？紤]成本，選擇PEG質(zhì)量分數(shù)為24%。

2.2.3 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響

固定PEG質(zhì)量分數(shù)在24%，考察(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對蒲公英總黃酮的分配系數(shù)和萃取率的影響（表3）?？梢钥闯觯S著(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加，兩相體積比逐漸減小，下相體積逐漸增大。這與文獻[17-18]結(jié)論一致。因為硫酸銨是強電解質(zhì)，在水中離解為正、負離子，形成水合離子的能力增強，能奪取更多的水分子，所以下相體積增加，上下相體積比下降。表3中，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加，分配系數(shù)和萃取率先增加，到(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為18%時達到最大，而后下降。原因是隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加，上相中PEG含量和(NH4)2SO4都增加，上相中PEG含量增加有利于被萃取物的提取[19]，但(NH4)2SO4含量增加不利于這種提取。所以在(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為18%時，分配系數(shù)和萃取率都達到各自的最大值。

2.2.4 pH值的影響

pH值不同，雙水相體系中兩相的電位差不同[19]，不僅影響上下兩相的體積比，也影響各種待分離成分在上下相的分配。在選擇PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)分別為24%和18%的雙水相體系，采用HCl和NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值，考察pH值對總黃酮在雙水相體系中分配系數(shù)和萃取率的影響，結(jié)果如圖2。由于(NH4)2SO4為強酸弱堿鹽，顯微酸性，堿性條件下易水解，釋放出氨氣，從而影響雙水相體系的穩(wěn)定，所以選擇pH值在1～7范圍內(nèi)來考察體系pH值對蒲公英中總黃酮分配系數(shù)和萃取率的影響。從圖2可以看出，隨著體系pH值的增大，分配系數(shù)K和萃取率Y都是先增大后減小，pH值為3.74時，這一雙水相體系的分配系數(shù)和萃取率較高。

表1 PEG相對分子質(zhì)量對蒲公英總黃酮分配的影響

表2 PEG1000質(zhì)量分數(shù)對蒲公英總黃酮分配的影響

2.2.5 溫度的影響

溫度對雙水相體系的熱力學(xué)平衡有顯著的影響[20]，從而間接影響了蒲公英總黃酮在兩相中的分配。PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)分別為24%和18%且pH值在3.74的條件下，考察溫度對雙水相體系的影響，見圖3。實驗結(jié)果表明，隨著溫度的升高，雖然分相速度加快，但由于溶解度增加，上下相體積比R和萃取率都逐漸降低。大規(guī)模的雙水相萃取操作一般在室溫下進行，不僅能節(jié)省能源也能提高收率。

2.2.6 NaCl質(zhì)量分數(shù)的影響

在25℃、PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)分別為24%和18%、pH值為3.74的條件下，考察加入不同質(zhì)量分數(shù)的NaCl鹽對雙水相體系萃取蒲公英中總黃酮的影響，見表4。

在雙水相體系中加入NaCl，由于正、負離子在兩相間的分配系數(shù)不同，在兩相間形成電位差，從而影響帶電大分子的分配。由表4可見，加入NaCl，兩相體積比R、分配系數(shù)K和萃取率Y有小幅下降；當NaCl質(zhì)量分數(shù)大于0.3%時鹽不能完全溶解，或造成(NH4)2SO4析出。從成本和后續(xù)分離考慮，在實際生產(chǎn)過程中可以不加入NaCl。

表3 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對蒲公英總黃酮分配的影響

圖2 pH值對分配系數(shù)和萃取率的影響

圖3 溫度對分配系數(shù)和萃取率的影響

表4 NaCl質(zhì)量分數(shù)對蒲公英總黃酮分配的影響

2.3 正交試驗設(shè)計和結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取PEG1000質(zhì)量分數(shù)（A）、(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)（B）、pH值（C）3個因素3個水平[L9(34)]進行正交試驗（表5）。

正交試驗結(jié)果見表6，從試驗結(jié)果看出，各因素對蒲公英黃酮分配的影響順序為(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)＞pH值＞PEG質(zhì)量分數(shù)，最優(yōu)的條件是PEG1000質(zhì)量分數(shù)23%、(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)18%、pH值5.34，分配系數(shù)達到最大88.32。與單因素實驗結(jié)果基本一致。

表5 L9(34)正交試驗水平和因素設(shè)計

2.4 不同方法的比較結(jié)果

取上述正交試驗最優(yōu)條件下的雙水相體系30g，加入0.50g蒲公英粉末，在微波條件下考察蒲公英總黃酮的提取率。采用微波輔助主要是為縮短雙水相直接采取的時間。實驗結(jié)果與乙醇水浴加熱回流法、微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法等3種方法進行了比較，見表7。3種方法中的實驗條件分別如下：乙醇水浴加熱回流法，60%乙醇、料液比1∶60、加熱1h；微波輔助萃取法，乙醇濃度60%、料液比1∶60、微波功率350W、微波時間55s；超聲波輔助萃取法，乙醇濃度60%、料液比1∶60、超聲時間30min。

與乙醇水浴加熱回流法相比，微波輔助時最優(yōu)條件下的雙水相體系的蒲公英總黃酮提取率提高了15.36%；與微波法和超聲法相比，分別提高了4.02%和7.68%。乙醇水浴加熱回流法因長時間且高溫的加熱使得黃酮類物質(zhì)分解，不利于總黃酮的提取。微波輔助和超聲萃取法，縮短了萃取時間，也一定程度上提高了總黃酮的提取率。而雙水相體系的提取率是最高的，而且溶劑無毒、用量減少，節(jié)省了成本。另外，極性強的親水性物質(zhì)更多的進入富含硫酸銨的下相，使得上相蒲公英總黃酮的純度進一步提高。

表6 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表7 雙水相萃取法與其它方法的比較

3 結(jié) 論

考察了蒲公英黃酮在PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系中的分配規(guī)律，通過正交試驗優(yōu)化，最佳萃取雙水相體系的PEG相對分子質(zhì)量是1000，PEG1000的質(zhì)量分數(shù)為23%，(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為18%，萃取溫度在25℃、體系pH值為5.34。用這種雙水相體系，在微波輔助下直接萃取蒲公英中的總黃酮，提取率可達5.47%。與其他傳統(tǒng)方法相比，雙水相萃取法的提取率有了明顯的提高。所以，雙水相法萃取蒲公英總黃酮是一種更加綠色環(huán)保、又易于工業(yè)化的高效方法。

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Partition and extraction of total flavonoids from Taraxacum mongolicum in PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase system

YANG Limin，Lü Jinping，F(xiàn)ENG Yan
（School of Petrochemical Technology，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China）

Total flavonoids inTaraxacum mongolicumare a highly effective medicine，and aqueous two-phase extraction process is an effective technique for extracting biomaterials from plant. Effect of molecular weight and mass fraction of PEG，mass fraction of (NH4)2SO4，temperature and pH of aqueous two-phase system were investigated during extraction of total flavonoids fromTaraxacum mongolicum.The optimal extraction conditions were obtained through orthogonal experiments. The optimal condition thus obtained is as follows:the average molecular weight of PEG at 1000，the mass fraction of PEG1000 at 23%，the mass fraction of (NH4)2SO4at 18%，temperature at 25℃，pH at 5.34. The NaCl addition has little effect on flavonoids partition. The extraction yield of total flavonoids fromTaraxacum mongolicumcan reach up to 5.47% under this optimal condition. Compared with other extraction methods，the aqueous two-phase extraction process is a more environment-friendly and highly efficient technique.

Taraxacum mongolicum；total flavonoids；aqueous two-phase system；partition；extraction

TQ 028.8

A

1000-6613（2014）08-1992-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.08.009

2013-12-18；修改稿日期：2014-01-16。

及聯(lián)系人：楊利民（1962—），男，副教授，博士，研究方向為多相反應(yīng)與分離。E-mail lyang@jpu.edu.cn。