張楊，孫明,2,3*，楊海燕，張啟翔,2,3

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；2.國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083；3.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

菊花腦熱激蛋白70基因的克隆及表達(dá)分析

張楊1，孫明1,2,3*，楊海燕1，張啟翔1,2,3

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；2.國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083；3.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

采用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)從菊花腦葉片中克隆菊花腦(Chrysanthemum nankingense)熱激蛋白70基因 (hsp70) 的cDNA序列，并通過(guò)熒光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花腦在40 ℃高溫下熱激不同時(shí)間(0、0.5、1、2、3、6 h)后葉片中hsp70基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明，克隆的cDNA序列全長(zhǎng)2 224 bp，與水母雪蓮花、紫莖澤蘭的 hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分別為 88%、98%，表明該序列為菊花腦的 hsp70基因序列(GenBank登錄號(hào)，KJ561911)，命名為Cnhsp70。Cnhsp70基因的開放閱讀框?yàn)? 944 bp，其編碼的蛋白(647個(gè)氨基酸) 的相對(duì)分子質(zhì)量約為70 900，含有HSP70家族序列標(biāo)簽。qRT–PCR分析的結(jié)果表明，Cnhsp70基因的表達(dá)在熱激后短時(shí)間內(nèi)迅速上調(diào)，熱激3 h達(dá)到最高，熱激6 h時(shí)表達(dá)量迅速下調(diào)。

菊花腦；熱激蛋白70；基因克??；高溫脅迫；表達(dá)分析

℃

熱激蛋白(heat shock protein, HSP)是生物體在應(yīng)對(duì)高溫或其他脅迫環(huán)境下所產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，能在短時(shí)間內(nèi)大量合成和累積，以提高生物體對(duì)高溫等不利環(huán)境的耐受性[1]。不同物種 HSPs的氨基酸序列與功能都很保守。Carper等[2]根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小，將熱激蛋白分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子sHSP和泛素等6個(gè)家族，其中，HSP70最為保守和普遍[3]，也是研究得最為廣泛的熱激蛋白之一。目前，已從擬南芥[4]、玉米[5]、菠菜[6]、紫莖澤蘭[7]等植物中克隆到 hsp70基因，但有關(guān)菊花的hsp70基因還未見報(bào)道。

菊花(Chrysanthemum morifolium)是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，品種豐富，花型花色多樣，觀賞價(jià)值極高。菊花生長(zhǎng)和發(fā)育的最適溫度是15～25 ℃，超過(guò)25 ℃即不利于菊花的生長(zhǎng)。菊花腦(Chrysanthemum nankingense)為菊科菊屬菊花的野生種，有較強(qiáng)的耐熱能力[8]。本研究運(yùn)用同源克隆技術(shù)，擬從菊花腦中克隆出hsp70基因，并對(duì)其在高溫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在為菊花耐熱育種及種質(zhì)發(fā)掘提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菊花

從北京林業(yè)大學(xué)小湯山基地菊花資源圃選擇無(wú)病蟲害、長(zhǎng)勢(shì)一致的菊花腦腳芽進(jìn)行扦插繁殖，所用基質(zhì)為草炭和珍珠巖(質(zhì)量比為1∶1)，溫室培養(yǎng)2個(gè)月后，轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中。于溫度20 /℃18 ℃(白天/黑夜)，相對(duì)濕度75%，光周期12 h/12 h(光照/黑暗)的條件下緩苗 1 d后，將溫度設(shè)成40 ℃，熱激6 h，收集熱激前(熱激0 h)、熱激后0.5 1、2、3、6 h的上部新鮮葉片置于液氮中冷凍后，–70℃保存、備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取

用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(艾德萊)分別提取收集的葉片的總RNA。用NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific)測(cè)定RNA的A260 nm/A280 nm值，判斷質(zhì)量，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2 hsp70基因的克隆

1) 中間保守序列的擴(kuò)增。 選取熱激3 h的葉片的總RNA，用TIANscript cDNA 第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)合成總cDNA。根據(jù)GenBank蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中紫莖澤蘭(登錄號(hào)為 ACM42161)、煙草(登錄號(hào)為 AAR17080)、水母雪蓮花(登錄號(hào)為AAV97978)、杜鵑(登錄號(hào)為ADD71975)、仙客來(lái)(登錄號(hào)為ABP35942)等hsp70基因的序列，利用在線網(wǎng)站Icodehop設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物HSP1(5′–CTTATTCTT GTGTTGGAGTTTGGCARCAYGAYMG–3′)和HSP2 (5′–ATCTCTCAGACACTTTTCAACAGGYTCCAT RCAYT–3′)，以擴(kuò)增hsp70基因的中間保守序列。PCR反應(yīng)體系 (25 μL)為：cDNA 2 μL，2×Taq PCR MasterMix(BIOMIGA)12.5 μL，10 μmol/L HSP1 0.3 μL，10 μmol/L HSP2 0.3 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸4 min。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后經(jīng)T載體克隆，測(cè)序。

2) 3′RACE的擴(kuò)增。選取熱激3 h的葉片的總RNA，用SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech公司)合成cDNA。根據(jù)測(cè)序獲得的中間保守序列設(shè)計(jì)特異引物3GSP1(5′–GACATCAC TGGTAACCCCAGAGCCC–3′)和3GSP2(5′–CCCTC TCATCAACTGCTCAAACCACC–3′)，按照SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，以獲得hsp70基因3′–端序列。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后經(jīng)T載體克隆，測(cè)序。

3) 5′RACE的擴(kuò)增。根據(jù)測(cè)序獲得的中間保守序列設(shè)計(jì)引物GSP(5′–TCGC CTACCGATGAGA–3′)，以熱激3 h的葉片的總RNA為模板，用5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒(Invitrogen公司)合成擴(kuò)增hsp70基因5′–端序列所需的 cDNA，然后分別以根據(jù)中間保守序列設(shè)計(jì)的引物5GSP1(5′–GTGTTGGTAGGGTTCAT GGC–3′)和5GSP2(5′–CTCAGAATCAGTAAAGGCA AC–3′)進(jìn)行第一輪和第二輪擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后經(jīng)T載體克隆，測(cè)序。

4) 全長(zhǎng) cDNA的拼接與驗(yàn)證。使用 Contig-Express序列拼接軟件將擴(kuò)增得到的 3段目的基因片段進(jìn)行拼接，獲得hsp70基因全長(zhǎng)cDNA。根據(jù)拼接所得序列設(shè)計(jì)特異引物 70U1(5′–AAACATTA CACTCTCTCATCAC–3′)和70D1(5′–TTGTATTGT ATCACAAGCAAC–3′)，以熱激3 h的葉片的總cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后經(jīng) T載體克隆，測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與拼接序列用DNAman軟件進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 序列分析

用 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi. nim.nih.gov/) BLASTn、BLASTp軟件及DNAman軟件進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列的比對(duì)和保守域的預(yù)測(cè)。

1.2.4 基因表達(dá)分析

用TIANscript cDNA 第一鏈合成試劑盒，以熱激后0、0.5、1、2、3、6 h的葉片的總RNA為模板合成cDNA。根據(jù)獲得的全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)上游引物(5′–GAAGTAGGCTGGGA CTGTAAC–3′)和下游引物(5′–TAACTACAAGGGTGAGGAGAA–3′)。在 Piko?Thermal Cycler 96–well system (Thermo Scientific)，用SYBR?Premix EX TaqTM(Til RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增體系為10 μL (cDNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.2 μL，SYBR Premix Ex Taq 5 μL，ddH2O 3.6 μL)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。選預(yù)試驗(yàn)中表達(dá)量較穩(wěn)定的PP2Acs基因?yàn)橄鄬?duì)定量的內(nèi)參基因[9]，采用 2–△△Ct方法[10]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，比較不同熱激時(shí)間下目的基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)

用 NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA的A值進(jìn)行測(cè)定，其A260 nm/A268 nm略大于2.0，表明RNA的純度較高。凝膠電泳結(jié)果也顯示，總RNA的條帶清晰(圖1)。可見，所提取的RNA純度高，完整性好，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

圖1 菊花腦葉片的總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of RNA isolated from leaves of Chrysanthemum nankingense

2.2 菊花腦hsp70的cDNA克隆

以菊花腦葉片 cDNA為模板，使用引物組合HSP1、HSP2擴(kuò)增，獲得大小為831 bp的hsp70基因的中間片段(圖 2–A)。根據(jù)中間片段序列，進(jìn)行3′Race、5′Race擴(kuò)增，獲得1 323 bp的3′序列(圖2–B) 和252 bp的5′序列(圖2–C)的cDNA片段。將3個(gè)片段的序列拼接后得到大小為2 224 bp的基因全長(zhǎng)序列。根據(jù)拼接的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得了2 224 bp(圖2–D)的片段，驗(yàn)證了拼接序列的正確性。Blastn分析發(fā)現(xiàn)，克隆的序列與水母雪蓮花(GenBank登錄號(hào)為AF509336)、紫莖澤蘭(GenBank登錄號(hào)為EU269069) hsp70基因的同源性均為88%，表明獲得的基因?yàn)榫栈Xhsp70基因，命名為Cnhsp70，將序列登錄GenBank，獲得的登錄號(hào)為KJ561911。

圖2 菊花腦hsp70的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of PCR products for hsp70 of Chrysanthemum nankingense

2.3 菊花腦Cnhsp70序列分析

Cnhsp70的cDNA含1 944 bp的完整開放性閱讀框，編碼647個(gè)氨基酸，與水母雪蓮花(GenBank登錄號(hào)：AAV97978)、紫莖澤蘭(GenBank登錄號(hào)為ABX76301) hsp70基因的編碼氨基酸的同源性均高達(dá)98%，并包含HSP70高度保守的3個(gè)家族標(biāo)簽序列 DLGTTYS(13–19)、IFDLGGGTFD VSLL(203–216)和VVLVGGSARIPKVQQ(340–354)；1個(gè)非細(xì)胞器保守基序RARFEEL(305–311)；1個(gè)糖基化位點(diǎn)NVSA(493–496)和胞質(zhì)HSP70的特征基序EEVD (644–647)[11]。

2.4 Cnhsp70表達(dá)特性分析

定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)菊花腦受到高溫脅迫時(shí)，Cnhsp70的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)。高溫脅迫0.5 h時(shí)，Cnhsp70的表達(dá)量為對(duì)照的3倍多；之后其表達(dá)保持平緩的上升趨勢(shì)，于高溫脅迫3 h時(shí)達(dá)到最大，接近對(duì)照的5倍；但當(dāng)熱激6 h時(shí)，Cnhsp70基因表達(dá)量急劇下降，甚至略低于對(duì)照水平。

3 討 論

熱激蛋白能提高植物的耐熱性，減少高溫對(duì)生物體的傷害[12–13]。本試驗(yàn)利用同源克隆技術(shù)獲得了菊花腦熱激蛋白70基因(Cnhsp70)，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了分析，得出Cnhsp70基因在常溫下有少量表達(dá)，且表達(dá)量穩(wěn)定，而在受到短暫高溫刺激后表達(dá)量明顯提高?？梢?，HSP70能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)高溫脅迫進(jìn)行響應(yīng)。然而，Cnhsp70的表達(dá)量在熱激處理6 h后出現(xiàn)顯著性下降，這與同為熱激蛋白家族的Lshsp90[14]及老鼠的hsp70基因[15]表現(xiàn)一致，這可能是由于熱激基因的長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)不利于生物體，生物體在適應(yīng)了高溫環(huán)境后其表達(dá)即下調(diào)[16]。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，菊花腦的熱激蛋白 70主要在熱脅迫初期起作用，以短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)來(lái)幫助植物體應(yīng)對(duì)不利環(huán)境，表明可根據(jù)hsp70短時(shí)表達(dá)量的多少來(lái)初步判斷菊花腦的耐熱情況。

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Cloning and expression analysis of heat shock protein 70 gene in Chrysanthemum nankingense

ZHANG Yang1, SUN Ming1,2,3*, YANG Hai-yan1，ZHANG Qi-xiang1,2,3(1.College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2.National Engineering Research Center for Floriculture, Beijing 100083, China; 3.Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation and Molecular Breeding, Beijing 100083, China)

Homology cloning combined with RACE techniques was applied to clone the cDNA of heat shock protein 70 gene (hsp70) from Chrysanthemum nankingens and real–time quantitative PCR (qRT–PCR) was conducted to analyze the expression patterns of this gene under 40 for 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 3 h and 6 h. The results showed that the full cDNA sequence cloned is 2 224 bp, which is determined to be hsp70 gene of Chrysanthemum nankingens, and subsequently named Cnhsp70 as it shares 88% homology with Saussurea medusa at nucleotide level and 98% homology with Ageratina adenophora at amino acid level. Cnhsp70 contains a 1 944 bp open reading flame (ORF), which encodes 647 amino acids containing the HSP70 family sequence tags with a predicted molecular mass of 70 900. Real–time quantitative PCR presented that the expression of Cnhsp70 was up-regulated quickly in a short time after heat stress and get to the highest level 3 h after stress, which was rapidly down-regulated 6 h after stress.

Chrysanthemum nankingense; heat shock protein 70; gene cloning; heat stress; expression analysis

S682.1+1

A

1007?1032(2014)02?0153?04

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.009

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–12–09

國(guó)家“十二·五”科技支撐計(jì)劃(2013BAD01B07)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(YX2011-32)

張楊(1989—)，女，湖南常德人，碩士研究生，主要從事園林植物遺傳育種研究，zhangyang8144@163.com；*通信作者, sun.sm @163.com