孫 雯,潘秀珍

(1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225000;2.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所,江蘇南京210002)

S.suis 2溶血素SLY的分子克隆及溶血活性和免疫學(xué)特性研究

孫 雯1,潘秀珍2*

(1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225000;2.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所,江蘇南京210002)

目的 克隆并表達(dá)豬鏈球菌2型(S.suis 2)溶血素重組蛋白SLY,對(duì)其溶血活性及免疫學(xué)特性進(jìn)行研究,為探討SLY在S.suis 2感染中的致病機(jī)理及篩選有效的疫苗預(yù)防和控制豬鏈球菌病奠定基礎(chǔ)。方法 對(duì)S.suis 2 05ZYH33全基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建p ET32a-sly原核表達(dá)質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達(dá)出S.suis 2重組溶血素SLY蛋白;采用高濃度尿素裂解包涵體和His-Tag親和層析對(duì)重組SLY蛋白進(jìn)行純化并復(fù)性;免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)SLY的免疫保護(hù)作用。結(jié)果 SDS-PAGE顯示70 kD的SLY蛋白條帶;重組SLY蛋白具有溶血活性并受多種因素的影響;SLY對(duì)感染S.suis 2的Balb/c小鼠有一定的免疫保護(hù)作用。結(jié)論 優(yōu)化原核表達(dá)體系可以有效提高SLY蛋白的表達(dá)量,經(jīng)提純并復(fù)性的重組SLY具有較高的溶血價(jià),為進(jìn)一步純化及分析SLY蛋白的特性提供了必要的前提。

豬鏈球菌2型(S.suis 2);溶血素SLY;包涵體;溶血活性

豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是人獸共患病的病原菌,有35個(gè)血清型。迄今,豬鏈球菌2型(S.suis 2)先后在20多個(gè)國(guó)家及地區(qū)引起多起人感染豬鏈球菌的惡性事件,被認(rèn)為毒力最強(qiáng),主要引起的疾病包括敗血癥、腦膜炎以及突發(fā)性死亡等[1]。在中國(guó),1998年江蘇省和2005年的四川省曾暴發(fā)了大規(guī)模的人感染S.suis 2公共衛(wèi)生事件,患者出現(xiàn)了極其罕見(jiàn)的中毒性休克綜合征(STSS)。此后,人感染S.suis 2的散發(fā)疫情時(shí)有發(fā)生,近年呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì),引起了公共衛(wèi)生領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[2-3]。

目前,關(guān)于S.suis 2致病的具體機(jī)制知之甚少,主要集中在毒力因子的研究,例如溶血素(SLY)、莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)及胞外因子(EF)等。當(dāng)前,研究者[1]普遍認(rèn)為溶血素SLY是S. suis 2的一個(gè)重要毒力相關(guān)因子。研究的初步結(jié)果顯示,引起我國(guó)STSS疫情的S.suis 2的強(qiáng)毒株05ZYH33在體外條件下表現(xiàn)出高的溶血活性。溶血素(SLY)作為S.suis 2的一種分泌性蛋白質(zhì),能夠分泌于細(xì)菌的培養(yǎng)上清中,引起人喉癌上皮細(xì)胞(HEp-2)的裂解,SLY抗體可抑制這種作用。研究[4]還發(fā)現(xiàn)SLY陽(yáng)性的S.suis 2菌株能黏附腦微細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞,并導(dǎo)致所黏附細(xì)胞的裂解。相反,不產(chǎn)生SLY的S.suis 2突變株則喪失了溶血性以及對(duì)小鼠的毒力[5],這表明SLY在S.suis 2侵襲和裂解細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。因此,對(duì)于SLY與S.suis 2致病性之間關(guān)系的深入探討,既有助于進(jìn)一步了解S.suis 2的致病機(jī)制,同時(shí)對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的S.suis 2免疫學(xué)檢測(cè)方法、篩選更有效的疫苗也奠定了基礎(chǔ)。

鑒于S.suis 2細(xì)菌培養(yǎng)上清中的SLY蛋白含量低且提純困難,我們構(gòu)建了中國(guó)強(qiáng)毒株S.suis 2 05ZYH33 SLY蛋白的基因工程菌,通過(guò)分子克隆和蛋白表達(dá)獲得純度高且具有生物學(xué)活性的SLY融合蛋白,進(jìn)一步對(duì)SLY進(jìn)行了溶血活性的檢測(cè)和免疫學(xué)特性的分析與研究,為深入探討SLY在S.suis 2感染過(guò)程中的致病機(jī)理及篩選有效的疫苗來(lái)預(yù)防和控制豬鏈球菌病提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株S.suis 2 05ZYH33(分離自四川省資陽(yáng)市的中毒性休克綜合征患者);質(zhì)粒p ET32a及其宿主菌E.coli DH5α、E.coli BL21(實(shí)驗(yàn)室保存);質(zhì)粒p MD-18T、DNA膠回收試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶Sal I和Bam H I、T4連接酶(日本Ta KaRa公司產(chǎn)品);DNA Marker和蛋白Marker (深圳晶美生物工程有限公司產(chǎn)品);SPF級(jí)Balb/c小鼠(購(gòu)自北京)。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆溶血素基因 利用BLAST和Clustal W程序篩選實(shí)驗(yàn)室保存的S.suis 2 05ZYH33菌株全基因組序列中可能存在的溶血素編碼序列(sly),設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5′端引物的序列:5’-CAC GGATCCATGAGAAAAAGT TCGCAC-3’,畫(huà)線部分為限制性?xún)?nèi)切酶Bam H I酶切位點(diǎn);3′端引物的序列:5’-CG GTCGAC TTACTCTATCACCTCATCCGCA-3’,畫(huà)線部分為限制性?xún)?nèi)切酶Sal I酶切位點(diǎn)。引物由上?；瞪锕竞铣?。PCR程序反應(yīng)體系:95℃,5 min; 95℃,40 s;56℃,1 min;72℃,1 min;共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒p MD-18T-sly PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段,將片段克隆于p MD-18T載體中,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α細(xì)菌。通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶Bam H I和Sal I雙酶切篩選并鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定,并驗(yàn)證其閱讀框。雙酶切體系為:10×T Buffer 1.5μL,p MD-18T-sly質(zhì)粒2μL,Bam H I 0.5μL,Sal I 0.5μL,dd H2O 5.5μL,37℃水浴6 h。

1.2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32-sly 質(zhì)粒p MD-18T-sly和p ET32a載體經(jīng)Bam H I、Sal I雙酶切的產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后,經(jīng)T4 DNA ligase連接后克隆至感受態(tài)E.coli BL21細(xì)菌,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體p ET32-sly。菌液經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性者進(jìn)行質(zhì)粒提取,酶切,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 優(yōu)化重組蛋白表達(dá)的時(shí)間 重組菌在37℃下分別誘導(dǎo)2、3、4、5 h,超聲波裂解,12 000 r/min離心10 min,用120 g/L SDS-PAGE電泳鑒定誘導(dǎo)的效果,選取最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.5 分析重組蛋白的可溶性 重組菌在37℃下培養(yǎng)3 h后,OD達(dá)0.6,此時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)至最佳誘導(dǎo)時(shí)間,進(jìn)行超聲波裂解,12 000 r/min離心10 min,分別取裂解上清液和沉淀,用120 g/L SDS-PAGE電泳對(duì)重組蛋白進(jìn)行定位分析。

1.2.6 優(yōu)化重組蛋白表達(dá)的培養(yǎng)溫度 選取28℃和37℃對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)至最佳誘導(dǎo)時(shí)間,分別取沉淀、上清進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE電泳鑒定誘導(dǎo)的效果,比較在28℃和37℃溫度下蛋白的表達(dá)量,從而選取最佳的誘導(dǎo)溫度。

1.2.7 純化和復(fù)性重組蛋白 洗滌包涵體:收集重組菌液,緩沖液Buffer A(20 mmol/L p H 7.5的Tris HCl,10 mmol/L Triton X-100,10 mmol/L EDTA)重懸,超聲波裂解30 min后10 000 g離心20 min,收集包涵體,用上述緩沖液洗2次。溶解包涵體:以每克包涵體加入5 m L緩沖液Buffer B (8 mol/L尿素,0.01 mol/L Tris HCl,0.1 mol/L Na H2PO4,p H 8.0),再加入終濃度體積分?jǐn)?shù)為0.1%的β-巰基乙醇,4℃下裂解過(guò)夜。純化重組蛋白:包涵體裂解液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后與1 m L Ni2NTA His Bind Resins置搖床培養(yǎng)1 h,裝入空層析柱中,用緩沖液B平衡層析柱,然后用緩沖液C (8 mol/L尿素,10 mmol/L Tris-Hcl,100 mmol/L Na H2PO4·2H2O,p H 6.3)洗脫非特異性結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì),最后用緩沖液D(8 mol/L尿素, 10 mmol/L Tris Hcl,100 mmol/L Na H2PO4· 2H2O,p H 4.5)洗脫吸附在柱子上的融合蛋白,采用120 g/L SDS-PAGE電泳對(duì)不同收集管中洗脫的目的蛋白含量進(jìn)行分析。復(fù)性重組蛋白:用300 m L復(fù)性液A(2 mol/L尿素,1 mmol/L還原型谷胱甘肽,20 mmol/L Tris HCl,0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽,p H 8.0)4℃下透析12 h,期間換液2次,之后用300 m L復(fù)性液B(0.5 mol/L尿素,1 mmol/L還原型谷胱甘肽,20 mmol/L Tris HCl,0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽)繼續(xù)透析12 h,期間換液2次,再用10 mmol/L Tris HCl(p H 8.0)300 m L透析3 h以上,最后用去離子水繼續(xù)透析3 h以上。

1.2.8 鑒定重組蛋白的溶血活性 測(cè)定溶血價(jià):在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入2%人紅細(xì)胞(150μL/孔),再加入等體積的復(fù)性重組蛋白(經(jīng)生理鹽水倍比稀釋),置37℃下作用2 h,100 g離心2 min后取上清液,分光光度計(jì)540 nm下測(cè)定其吸光值,以紅細(xì)胞與等體積生理鹽水共同孵育的孔作為陰性對(duì)照;能夠?qū)е?0%紅細(xì)胞溶解的待測(cè)樣品的最高稀釋倍數(shù)即為重組蛋白SLY所含的溶血單位數(shù)(即SLY的溶血價(jià))。熱敏感性實(shí)驗(yàn):將-20℃保存的重組蛋白SLY分別置4℃、37℃、65℃溫度下處理20 min后,對(duì)溶血價(jià)進(jìn)行測(cè)定?；罨鸵种茖?shí)驗(yàn):在適當(dāng)稀釋的重組蛋白SLY中分別加入二硫蘇糖醇(DTT)、氧化劑過(guò)氧化氫、β-巰基乙醇、抑制劑蛋白酶K,使之終濃度分別為5 mmol/L、體積分?jǐn)?shù)0.1%、體積分?jǐn)?shù)0.1%、100 mg/L,置室溫20 min,測(cè)定溶血價(jià)。活性保存實(shí)驗(yàn):分別經(jīng)抑制劑蛋白酶K、65℃及氧化劑過(guò)氧化氫處理后的重組蛋白SLY蛋白樣品另加入體積分?jǐn)?shù)為2%β-巰基乙醇作用20 min,測(cè)溶血價(jià)。

1.2.9 動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn) 將4周齡的20只Balb/c小鼠,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組各10只。在接種S. suis 2 05ZHH33菌株之前,實(shí)驗(yàn)組小鼠先進(jìn)行SLY蛋白免疫。具體步驟為每只小鼠皮下注射用福氏完全佐劑乳化的25 mg/L SLY蛋白100μL;兩周后,每只小鼠皮下注射用福氏不完全佐劑乳化的25 mg/L SLY蛋白100μL;一周后,每只小鼠皮下注射用福氏不完全佐劑乳化的25 mg/L SLY蛋白100μL。實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行SLY蛋白免疫期間,對(duì)照組小鼠則同步注射PBS。一周后,空白組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均腹腔注射1×108CFU/m L S.suis 2 05ZYH33各1 m L。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒p MD-18T-sly和p ET32a-sly

構(gòu)建重組質(zhì)粒p MD-18T-sly,將目的片段sly連接到表達(dá)載體pET32a中。重組表達(dá)載體pET32a-sly經(jīng)Bam H I、Sal I雙酶切后,經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳顯示S.suis 2中sly片段全長(zhǎng)約為1 500 bp,與預(yù)期長(zhǎng)度一致。DNA序列測(cè)定顯示該sly片段長(zhǎng)度為1 491 bp,共編碼497個(gè)氨基酸。見(jiàn)圖1。

圖1 重組質(zhì)粒p ET32a-sly雙酶切鑒定1:1 000 bp DNA marker;2、3:質(zhì)粒p ET32a-sly; 4:Bam H I單酶切;5:Bam H I、Sal I雙酶切;6:PCR。

2.2 IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)SLY表達(dá)的影響

為比較不同誘導(dǎo)時(shí)間下SLY表達(dá)量的區(qū)別,在37℃下分別用IPTG對(duì)重組菌誘導(dǎo)2、3、4、5 h,取誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE鑒定分析。結(jié)果顯示,IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)達(dá)4 h時(shí)重組菌中SLY表達(dá)量最高。見(jiàn)圖2。

2.3 分析重組蛋白的可溶性

重組菌在37℃下培養(yǎng)至最佳誘導(dǎo)時(shí)間4 h,超聲波裂解誘導(dǎo)物,經(jīng)離心后獲取裂解上清液及沉淀,120 g/L SDS-PAGE電泳鑒定分析,發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物主 要存在于包涵體中。見(jiàn)圖3。

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果1:蛋白Marker;2:p ET32a-sly/BL21; 3:未誘導(dǎo)重組菌裂解蛋白; 4～7:分別誘導(dǎo)2、3、4、5 h的表達(dá)產(chǎn)物。

圖3 超聲波裂解蛋白的SDS-PAGE1:蛋白質(zhì)marker;2:BL21全菌裂解蛋白;3:p ET32a-sly/BL21; 4:未誘導(dǎo)重組菌裂解蛋白;5:誘導(dǎo)4 h的表達(dá)產(chǎn)物; 6:重組菌超聲破碎裂解上清蛋白;7:裂解沉淀(包涵體蛋白)。

2.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)SLY表達(dá)的影響

為進(jìn)一步比較不同培養(yǎng)溫度對(duì)SLY表達(dá)的影響,重組菌分別采用28℃和37℃的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)至最佳誘導(dǎo)時(shí)間4 h,比較重組菌SLY表達(dá)量的不同。120 g/L SDS-PAGE結(jié)果顯示,在28℃和37℃不同培養(yǎng)溫度條件下,可溶性SLY表達(dá)量均較低,主要以包涵體的形式存在,以37℃包涵體蛋白量較高。見(jiàn)圖4。

2.5 提純重組蛋白

對(duì)以包涵體形式存在的重組蛋白SLY提純并復(fù)性,經(jīng)120 g/L SDS-PAGE電泳后顯示獲得了唯一條帶的純化蛋白。見(jiàn)圖5。

圖4 溫度對(duì)SLY蛋白表達(dá)的影響1:蛋白質(zhì)marker;2:BL21全菌裂解蛋白; 3:p ET32a;4:未誘導(dǎo)重組菌裂解蛋白; 5:28℃誘導(dǎo)4 h的上清;6:28℃誘導(dǎo)4 h的包涵體; 7:37℃誘導(dǎo)4 h的上清;8:37℃誘導(dǎo)4 h的包涵體。

圖5 純化的包涵體的SDS-PAGE1:蛋白標(biāo)記;2:重組蛋白SLY包涵體在SDS-PAGE上的條帶。

2.6 重組蛋白的溶血活性

2.6.1 測(cè)定溶血價(jià) 測(cè)定SLY溶血價(jià)為210,隨著蛋白稀釋度的增大,溶血活力呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。說(shuō)明重組蛋白SLY具有明顯的裂解紅細(xì)胞的能力。2.6.2 熱敏感和活性不可逆恢復(fù) 培養(yǎng)的溫度對(duì)重組SLY的溶血價(jià)有顯著的影響,表現(xiàn)為37℃時(shí)溶血價(jià)最高;65℃處理20 min,溶血價(jià)則顯著的降低; 65℃處理后即使加入β-巰基乙醇或DTT室溫作用30 min,仍沒(méi)有顯示活性。見(jiàn)圖6。

2.6.3 活性的丟失與可逆恢復(fù) SLY在氧化物過(guò)氧化氫和抑制劑蛋白酶K的 作用下,溶血價(jià)明顯的下降;加入β-巰基乙醇或DTT室溫作用30min后,丟失的活性可基本恢復(fù)。見(jiàn)圖6。

2.7 動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)

注射SLY的Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)組,注射PBS的Balb/c小鼠作為對(duì)照組。給2組小鼠注射相同劑量的S.suis 2 05ZYH33細(xì)菌,監(jiān)控48 h,對(duì)死亡的小鼠數(shù)量進(jìn)行記數(shù)。在接種1×108CFU/m L S.suis 2 05ZYH33菌株第2天,對(duì)照組10只小鼠全部死亡,實(shí)驗(yàn)組小鼠狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SLY對(duì)感染S.suis 2的Balb/c小鼠有一定的免疫保護(hù)作用。見(jiàn)圖7。

圖6 溶血活性實(shí)驗(yàn)1:4℃處理;2:37℃處理;3:65℃處理; 4:65℃處理后加β-巰基乙醇;5:雙氧水處理; 6:雙氧水處理后加β-巰基乙醇;7:蛋白酶K處理; 8:蛋白酶K處理后加β-巰基乙醇;9:空白對(duì)照。

圖7 SLY免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

3 討論

溶血素是細(xì)菌中十分常見(jiàn)的毒力因子,如A群鏈球菌的O溶血素、嗜水氣單胞菌的HEC毒素以及單核細(xì)胞李氏桿菌的溶血素[6]。近幾年,美國(guó)、新西蘭和加拿大等多個(gè)研究小組對(duì)S.suis 2 SLY進(jìn)行了深入的研究。溶血素SLY分泌于上清中,屬于硫醇激活的穿毒素家族,同時(shí)是一種膽固醇結(jié)合類(lèi)細(xì)胞毒素[7],有利于其攻擊膜上具有膽固醇的真核細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)[8-9]證明,S.suis 2的SLY對(duì)人紅細(xì)胞最為敏感,SLY陽(yáng)性菌株上清及純化的SLY均具有細(xì)胞毒性作用,經(jīng)游離的膽固醇預(yù)處理抑制其毒性作用,進(jìn)一步在細(xì)胞水平證明了SLY在致病過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。豬鏈球菌的SLY能增強(qiáng)細(xì)菌接觸上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力,同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),如刺激人內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8和MCP-1等細(xì)胞因子,它們可調(diào)整血腦屏障的完整性和通透性以利于豬鏈球菌在血液中傳播和穿過(guò)血腦屏障[10]。應(yīng)用S.suis 2江蘇分離株HA9801所產(chǎn)生的SLY進(jìn)行實(shí)驗(yàn),不僅能引致Vero細(xì)胞發(fā)生病變,還能致死豚鼠[11]。這些研究結(jié)果均表明SLY在致病的過(guò)程中扮演著重要的角色。

我們的研究從S.suis 2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33中克隆sly基因進(jìn)行原核表達(dá),并通過(guò)親和層析純化獲得重組蛋白。研究表明,溫度對(duì)SLY表達(dá)量的高低有重要影響,較高誘導(dǎo)溫度常常會(huì)使一些蛋白累積形成包涵體,并且由于表達(dá)的SLY有毒性,高溫誘導(dǎo)時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致表達(dá)菌停止生長(zhǎng)甚至死亡。但考慮到37℃誘導(dǎo)溫度下包涵體蛋白量較低溫誘導(dǎo)下可溶性蛋白量甚多且純度較高,所以實(shí)驗(yàn)選用37℃作為誘導(dǎo)溫度。同時(shí)發(fā)現(xiàn),IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的最適宜時(shí)間為4 h,誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和過(guò)短都會(huì)影響蛋白的積累量。通過(guò)優(yōu)化原核表達(dá)體系可以有效提高SLY蛋白的表達(dá)量,這為進(jìn)一步研究SLY蛋白的特性提供了必要的前提條件。通過(guò)檢測(cè)SLY的活性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)提純并復(fù)性的重組SLY具有較高的溶血價(jià),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SLY蛋白在高溫作用下極易失活,并且是不可逆的,氧化劑和蛋白酶K可完全抑制其活性,但只是一種可逆失活,加入還原劑,活性可恢復(fù),這為純化該毒素提供了技術(shù)手段。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示,SLY對(duì)感染S.suis 2的Balb/c小鼠有一定的免疫保護(hù)作用,SLY有可能作為豬鏈球菌疫苗的候選分子。

SLY在S.suis 2侵襲宿主的過(guò)程中如何發(fā)揮重要的角色及如何引起宿主細(xì)胞病變的問(wèn)題將有待進(jìn)一步探討。我們的研究結(jié)果,為進(jìn)一步探索S.suis 2在感染宿主過(guò)程中的致病機(jī)理、建立快速可靠的免疫學(xué)檢測(cè)方法及開(kāi)發(fā)有效預(yù)防豬鏈球菌病的疫苗提供了思路,對(duì)于本病的早期診斷、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、預(yù)警和疾病防控具有重要的意義。

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

Molecular Cloning，Hemolytic activity，and Immunological characterization of Suilysin from S.suis 2

SUN Wen1，PAN Xiuzhen2*
（1.Medical College of Yangzhou Vocational University，Yangzhou，Jiangsu 225127 China；2.Institute of Military Medical Sciences，Nanjing Command，Nanjing Jiangsu 210002，China）

Objective To understand Streptococcus suis serotype 2（S.suis 2）suilysin（SLY）display which function in the severe infection of S.suis 2 and identify vaccine candidates，molecular cloned and analyzed hemolytic activity and immunological characterization of SLY.Methods Bioinformatics was adopted to analyze the whole genome sequence of the Chinese strain 05ZYH33 of S.suis 2.A recombinant plasmid p ET32a-sly carrying sly gene was developed and transformed into prokaryotic expression host BL21（DE3）strain.Using chelating chromatography to purify SLY.Immunity test was used to test the immune protective effect of SLY.Results Protein expression analysis showed that a 70 k D protein can be observed in SDS-PAGE.After being purified by chelating chromatography，SLY showed clear hemolytic activity and affected by many factors.In an animal model system，we demonstrated that the mice immunized with SLY become to be protected against lethal doses of bacteria.Conclusion Successfully constructed prokaryotic expression system，SLY showed clear hemolytic activity which would be useful for future research on function of SLY.Animal model system means the successful application of proteomics may as a technique for identifying vaccine candidates.

Streptococcus suis 2（S.suis 2，SS2）；Suilysin（SLY）；inclusion body；hemolytic activity

R392.1

A

1672-7606(2014)03-0179-06

2014-04-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30670105、30600533);國(guó)家863項(xiàng)目(2006AA0Z455)。

孫雯(1983—),女,江蘇揚(yáng)州人,講師,從事微生物學(xué)及免疫學(xué)的教學(xué)與科研工作。

*通訊作者:潘秀珍(1963—),女,江蘇南京人,研究員,碩士生導(dǎo)師,從事流行病學(xué)的科研工作。