于國營等

摘要：為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進(jìn)行了比較，同時選用不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液進(jìn)行了滅活比較試驗。結(jié)果表明，對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，采用37 ℃攪拌滅活，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，用滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應(yīng)就越大。不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液滅活效果無明顯差異。

關(guān)鍵詞：甲醛溶液；雞大腸桿菌；滅活工藝

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）02-0010-03

甲醛溶液是目前滅活疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的滅活劑，成熟的滅活工藝能夠保證研制工作的順利開展和細(xì)菌滅活疫苗的生物安全。為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進(jìn)行了比較，同時也對不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液進(jìn)行了滅活比較試驗。

1 材料

1.1 大腸桿菌菌種

O1株、O2株、O78株均由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基。

1.3 菌液

分別制備O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

1.4 試驗雞

21～28日齡SPF雞均購自北京某SPF雞場。

1.5 滅活劑

上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的甲醛，批號為2011304。濟(jì)南魯康化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)的甲醛，批號為110713。

2 試驗設(shè)計

2.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

分別量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分別按終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分別加入上海國藥生產(chǎn)的化學(xué)純甲醛溶液，分別置于37 ℃滅活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液滅活后，均用LB肉湯培養(yǎng)基2支，各接種0.2ml，37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察有無細(xì)菌生長，以確定菌液滅活是否徹底。

2.2 疫苗的安全檢驗

取“2.1”經(jīng)0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液滅活徹底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐溫并混勻后作為水相，再與油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分別用21～28日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d有無因注射疫苗引起的不良反應(yīng)。

2.3 滅活劑的比較

在201101批菌液經(jīng)滅活和安全試驗的基礎(chǔ)上，使用不同廠家（上海國藥、濟(jì)南魯康）生產(chǎn)的甲醛溶液，按照“2.1”項選定的滅活條件，分別對201102批O1株、O2株、O78株菌液進(jìn)行滅活試驗，觀察不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液的滅活效果有無差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

試驗結(jié)果（表1）表明，各株菌液在37 ℃條件下，甲醛溶液最終濃度為0.1%攪拌滅活36 h滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.2%攪拌滅活24 h滅活徹底，甲醛最終濃度為0.3%攪拌滅活16 h均能滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.4%攪拌滅活12 h滅活徹底。

3.2 滅活的安全檢驗

試驗結(jié)果（表2）表明，用終濃度為0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，試驗雞均未出現(xiàn)注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應(yīng)；用終濃度為0.4%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗，安檢雞3/10均出現(xiàn)精神一過性不振，2/10飲食略有下降，3/10注射部位發(fā)紅。

3.3 滅活劑的比較

試驗結(jié)果（表3）表明，上海國藥、濟(jì)南魯康生產(chǎn)的甲醛溶液按0.3%終濃度分別加入到201102批各株菌液，37 ℃攪拌滅活16 h，均滅活徹底。兩廠家生產(chǎn)的同級另甲醛溶液對雞大腸桿菌的滅活效果無明顯差異。

4 小結(jié)與討論

本研究用甲醛終濃度為0.1%、0.2%、0.3%滅活的菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，安檢雞均未出現(xiàn)注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應(yīng)；用甲醛終濃度為0.4%滅活徹底的菌液制備疫苗，安檢雞3/10精神一過性不振，安檢雞2/10飲食略有下降，3/10注射部位均發(fā)紅。對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應(yīng)就越大。

將雞大腸桿菌菌液，按終濃度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃攪拌滅活16 h，滅活徹底，且疫苗安檢后未見不良反應(yīng)?？紤]實際生產(chǎn)中影響因素較多，為了保證滅活徹底，同時為減少高濃度甲醛副反應(yīng)，建議采用甲醛溶液，按0.3%的終濃度在37 ℃條件下攪拌滅活24 h作為實際生產(chǎn)中雞大腸桿菌（O1株、O2株、O78株）菌液的滅活條件。

不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液質(zhì)量基本一致，無明顯差異。由于實際生產(chǎn)中，菌液量較大，為防止由于濃度過高引起局部的蛋白凝聚和變性，因此建議將甲醛溶液進(jìn)行稀釋后使用。

本試驗結(jié)果是在實驗室小量操作等條件下得出的試驗結(jié)果，在具體研究或生產(chǎn)其他菌株大腸桿菌或其他種類細(xì)菌時，其滅活工藝還需要另外進(jìn)行具體地摸索和驗證。盡管如此，依然希望本試驗所得出的數(shù)據(jù)和結(jié)論能對相關(guān)研究提供一定意義的參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學(xué)[CM3].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.857-862.

[2] 才學(xué)鵬，景志忠，邱昌慶.動物疫苗學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009.317.

[3] 吳清民.動物傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.514-518.

[4] 馮靜蘭.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000，75-76.

摘要：為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進(jìn)行了比較，同時選用不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液進(jìn)行了滅活比較試驗。結(jié)果表明，對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，采用37 ℃攪拌滅活，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，用滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應(yīng)就越大。不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液滅活效果無明顯差異。

關(guān)鍵詞：甲醛溶液；雞大腸桿菌；滅活工藝

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）02-0010-03

甲醛溶液是目前滅活疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的滅活劑，成熟的滅活工藝能夠保證研制工作的順利開展和細(xì)菌滅活疫苗的生物安全。為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進(jìn)行了比較，同時也對不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液進(jìn)行了滅活比較試驗。

1 材料

1.1 大腸桿菌菌種

O1株、O2株、O78株均由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基。

1.3 菌液

分別制備O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

1.4 試驗雞

21～28日齡SPF雞均購自北京某SPF雞場。

1.5 滅活劑

上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的甲醛，批號為2011304。濟(jì)南魯康化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)的甲醛，批號為110713。

2 試驗設(shè)計

2.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

分別量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分別按終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分別加入上海國藥生產(chǎn)的化學(xué)純甲醛溶液，分別置于37 ℃滅活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液滅活后，均用LB肉湯培養(yǎng)基2支，各接種0.2ml，37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察有無細(xì)菌生長，以確定菌液滅活是否徹底。

2.2 疫苗的安全檢驗

取“2.1”經(jīng)0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液滅活徹底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐溫并混勻后作為水相，再與油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分別用21～28日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d有無因注射疫苗引起的不良反應(yīng)。

2.3 滅活劑的比較

在201101批菌液經(jīng)滅活和安全試驗的基礎(chǔ)上，使用不同廠家（上海國藥、濟(jì)南魯康）生產(chǎn)的甲醛溶液，按照“2.1”項選定的滅活條件，分別對201102批O1株、O2株、O78株菌液進(jìn)行滅活試驗，觀察不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液的滅活效果有無差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

試驗結(jié)果（表1）表明，各株菌液在37 ℃條件下，甲醛溶液最終濃度為0.1%攪拌滅活36 h滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.2%攪拌滅活24 h滅活徹底，甲醛最終濃度為0.3%攪拌滅活16 h均能滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.4%攪拌滅活12 h滅活徹底。

3.2 滅活的安全檢驗

試驗結(jié)果（表2）表明，用終濃度為0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，試驗雞均未出現(xiàn)注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應(yīng)；用終濃度為0.4%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗，安檢雞3/10均出現(xiàn)精神一過性不振，2/10飲食略有下降，3/10注射部位發(fā)紅。

3.3 滅活劑的比較

試驗結(jié)果（表3）表明，上海國藥、濟(jì)南魯康生產(chǎn)的甲醛溶液按0.3%終濃度分別加入到201102批各株菌液，37 ℃攪拌滅活16 h，均滅活徹底。兩廠家生產(chǎn)的同級另甲醛溶液對雞大腸桿菌的滅活效果無明顯差異。

4 小結(jié)與討論

本研究用甲醛終濃度為0.1%、0.2%、0.3%滅活的菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，安檢雞均未出現(xiàn)注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應(yīng)；用甲醛終濃度為0.4%滅活徹底的菌液制備疫苗，安檢雞3/10精神一過性不振，安檢雞2/10飲食略有下降，3/10注射部位均發(fā)紅。對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應(yīng)就越大。

將雞大腸桿菌菌液，按終濃度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃攪拌滅活16 h，滅活徹底，且疫苗安檢后未見不良反應(yīng)。考慮實際生產(chǎn)中影響因素較多，為了保證滅活徹底，同時為減少高濃度甲醛副反應(yīng)，建議采用甲醛溶液，按0.3%的終濃度在37 ℃條件下攪拌滅活24 h作為實際生產(chǎn)中雞大腸桿菌（O1株、O2株、O78株）菌液的滅活條件。

不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液質(zhì)量基本一致，無明顯差異。由于實際生產(chǎn)中，菌液量較大，為防止由于濃度過高引起局部的蛋白凝聚和變性，因此建議將甲醛溶液進(jìn)行稀釋后使用。

本試驗結(jié)果是在實驗室小量操作等條件下得出的試驗結(jié)果，在具體研究或生產(chǎn)其他菌株大腸桿菌或其他種類細(xì)菌時，其滅活工藝還需要另外進(jìn)行具體地摸索和驗證。盡管如此，依然希望本試驗所得出的數(shù)據(jù)和結(jié)論能對相關(guān)研究提供一定意義的參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學(xué)[CM3].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.857-862.

[2] 才學(xué)鵬，景志忠，邱昌慶.動物疫苗學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009.317.

[3] 吳清民.動物傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.514-518.

[4] 馮靜蘭.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000，75-76.

摘要：為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進(jìn)行了比較，同時選用不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液進(jìn)行了滅活比較試驗。結(jié)果表明，對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，采用37 ℃攪拌滅活，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，用滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應(yīng)就越大。不同生產(chǎn)廠家的甲醛溶液滅活效果無明顯差異。

關(guān)鍵詞：甲醛溶液；雞大腸桿菌；滅活工藝

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）02-0010-03

甲醛溶液是目前滅活疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的滅活劑，成熟的滅活工藝能夠保證研制工作的順利開展和細(xì)菌滅活疫苗的生物安全。為了優(yōu)化雞大腸桿菌疫苗制造過程中的滅活工藝，對甲醛溶液的使用濃度、滅活時間進(jìn)行了比較，同時也對不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液進(jìn)行了滅活比較試驗。

1 材料

1.1 大腸桿菌菌種

O1株、O2株、O78株均由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基。

1.3 菌液

分別制備O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

1.4 試驗雞

21～28日齡SPF雞均購自北京某SPF雞場。

1.5 滅活劑

上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的甲醛，批號為2011304。濟(jì)南魯康化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)的甲醛，批號為110713。

2 試驗設(shè)計

2.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

分別量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分別按終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分別加入上海國藥生產(chǎn)的化學(xué)純甲醛溶液，分別置于37 ℃滅活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液滅活后，均用LB肉湯培養(yǎng)基2支，各接種0.2ml，37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察有無細(xì)菌生長，以確定菌液滅活是否徹底。

2.2 疫苗的安全檢驗

取“2.1”經(jīng)0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液滅活徹底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐溫并混勻后作為水相，再與油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分別用21～28日齡SPF雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d有無因注射疫苗引起的不良反應(yīng)。

2.3 滅活劑的比較

在201101批菌液經(jīng)滅活和安全試驗的基礎(chǔ)上，使用不同廠家（上海國藥、濟(jì)南魯康）生產(chǎn)的甲醛溶液，按照“2.1”項選定的滅活條件，分別對201102批O1株、O2株、O78株菌液進(jìn)行滅活試驗，觀察不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液的滅活效果有無差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 甲醛溶液滅活濃度和滅活時間的選擇

試驗結(jié)果（表1）表明，各株菌液在37 ℃條件下，甲醛溶液最終濃度為0.1%攪拌滅活36 h滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.2%攪拌滅活24 h滅活徹底，甲醛最終濃度為0.3%攪拌滅活16 h均能滅活徹底，甲醛溶液最終濃度為0.4%攪拌滅活12 h滅活徹底。

3.2 滅活的安全檢驗

試驗結(jié)果（表2）表明，用終濃度為0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，試驗雞均未出現(xiàn)注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應(yīng)；用終濃度為0.4%甲醛溶液滅活的菌液制備疫苗，安檢雞3/10均出現(xiàn)精神一過性不振，2/10飲食略有下降，3/10注射部位發(fā)紅。

3.3 滅活劑的比較

試驗結(jié)果（表3）表明，上海國藥、濟(jì)南魯康生產(chǎn)的甲醛溶液按0.3%終濃度分別加入到201102批各株菌液，37 ℃攪拌滅活16 h，均滅活徹底。兩廠家生產(chǎn)的同級另甲醛溶液對雞大腸桿菌的滅活效果無明顯差異。

4 小結(jié)與討論

本研究用甲醛終濃度為0.1%、0.2%、0.3%滅活的菌液制備疫苗進(jìn)行安全檢驗，安檢雞均未出現(xiàn)注射部位紅腫，采食飲水量下降等不良反應(yīng)；用甲醛終濃度為0.4%滅活徹底的菌液制備疫苗，安檢雞3/10精神一過性不振，安檢雞2/10飲食略有下降，3/10注射部位均發(fā)紅。對于濃度較高的雞大腸桿菌菌液，甲醛溶液的終濃度越高，滅活時間越短，滅活效果就越明顯；但同時也存在著甲醛溶液的終濃度越高，滅活徹底的菌液所制備疫苗的副反應(yīng)就越大。

將雞大腸桿菌菌液，按終濃度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃攪拌滅活16 h，滅活徹底，且疫苗安檢后未見不良反應(yīng)?？紤]實際生產(chǎn)中影響因素較多，為了保證滅活徹底，同時為減少高濃度甲醛副反應(yīng)，建議采用甲醛溶液，按0.3%的終濃度在37 ℃條件下攪拌滅活24 h作為實際生產(chǎn)中雞大腸桿菌（O1株、O2株、O78株）菌液的滅活條件。

不同廠家生產(chǎn)的甲醛溶液質(zhì)量基本一致，無明顯差異。由于實際生產(chǎn)中，菌液量較大，為防止由于濃度過高引起局部的蛋白凝聚和變性，因此建議將甲醛溶液進(jìn)行稀釋后使用。

本試驗結(jié)果是在實驗室小量操作等條件下得出的試驗結(jié)果，在具體研究或生產(chǎn)其他菌株大腸桿菌或其他種類細(xì)菌時，其滅活工藝還需要另外進(jìn)行具體地摸索和驗證。盡管如此，依然希望本試驗所得出的數(shù)據(jù)和結(jié)論能對相關(guān)研究提供一定意義的參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學(xué)[CM3].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.857-862.

[2] 才學(xué)鵬，景志忠，邱昌慶.動物疫苗學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009.317.

[3] 吳清民.動物傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.514-518.

[4] 馮靜蘭.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000，75-76.