蘭 蘭，陳 笑，于立榮，魏 健

(長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032)

人參快繁條件的優(yōu)化

蘭 蘭，陳 笑，于立榮，魏 健

(長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032)

以人參種子在無(wú)菌條件下培養(yǎng)出來(lái)的無(wú)菌苗的幼嫩葉片以及不同器官、人參成體的塊莖及葉作為外植體，接種到附加著不同濃度的NAA、KT、IAA、6-BA以及它們分別組合的MS固體培養(yǎng)基上；總結(jié)出外植體在同樣的誘導(dǎo)條件下有很大的差異，且不同的培養(yǎng)基對(duì)外植體的影響不同。結(jié)果表明，MS+NAA0.1mg·L-1+KT0.5mg·L-1是誘導(dǎo)愈傷組織的最好的培養(yǎng)基；最理想的誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5mg·L-1；最佳誘導(dǎo)不定芽生根的培養(yǎng)基為MS+KT0．5mg·L-1+IAA0．3mg·L-1+6-BA0．2mg·L-1+活性炭3g；移栽、扦插的試管苗在爐灰渣中生長(zhǎng)得最旺盛，所以最理想的基質(zhì)是爐灰渣。

人參；培養(yǎng)基；快速繁殖；無(wú)菌苗；誘導(dǎo)

人參(PanaxginsenyC,A mey)是草本植物，多年生，隸屬于五加科。它可治勞傷虛損、反胃吐食、虛咳喘促、自汗暴脫、眩暈頭痛、消渴、小兒慢驚、久虛不復(fù)等一切氣血津液不足之癥，在滋補(bǔ)藥物、保健藥物、保健食品、化妝品中占有重要地位[1]。人參的主要作用是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，除此之外，還可以改善心臟功能、降血糖、抗腫瘤、抗衰老， 效果是多方面的[2-5]。由于人參的神秘性和奇特性，目前它的身價(jià)越來(lái)越高，市場(chǎng)越來(lái)越大，應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣。從傳統(tǒng)的強(qiáng)心強(qiáng)身藥物，到流行的保健品，再到時(shí)髦的化妝品，幾乎都加上人參的成分或名號(hào)，令人對(duì)人參產(chǎn)生了濃厚的興趣，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始更深入而廣泛地研究人參[6-9]。野生人參對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求非常嚴(yán)格，其生長(zhǎng)的地段多在海拔300～800m以下的低山；喜歡陰涼氣候，春季氣溫達(dá)到15℃，土壤溫度在10℃左右，人參才能出芽；喜歡漫射光和散射光，散射光具有光譜中最為豐富的紫外光；對(duì)水分要求也比較嚴(yán)格，適宜空氣濕度為40%～80%，土壤濕度為40%～50%之間。對(duì)人參進(jìn)行開(kāi)發(fā)可以很好地解決人們的需求，提高其市場(chǎng)價(jià)值[10-15]。本實(shí)驗(yàn)選用的材料是無(wú)菌苗及人參成體，并對(duì)人參成體進(jìn)行了嚴(yán)格的消毒，利用組織培養(yǎng)的方法，對(duì)人參的無(wú)性快速繁殖技術(shù)進(jìn)行了討論，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其組合對(duì)人參愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖效應(yīng)，從而更有效地對(duì)人參進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選取由吉林白山地區(qū)提供的人參種子培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗和成體人參作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獲得外植體

1.2.1.1獲得無(wú)菌苗

選取一定數(shù)量的人參種子，放入250mL廣口瓶中用自來(lái)水浸泡數(shù)小時(shí)，再加入0.02%的餐洗凈水浸泡10～15min，用自來(lái)水沖洗干凈。加入75%的酒精浸泡4min，倒去酒精，以無(wú)菌水漂洗2～3次(重復(fù)一次)。

將種子轉(zhuǎn)到另一個(gè)滅過(guò)菌的100～150ml的三角瓶中，將約為20mL 0.1%的升汞液注入瓶中，經(jīng)過(guò)1min的滅菌浸泡，并連續(xù)使用無(wú)菌水沖洗，至少5～6次，才能夠?qū)⑸瘡氐壮?。從三角瓶中取出消毒后的種子，使用無(wú)菌濾紙去除種子上的水分，在MS+NAA1.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1固體培養(yǎng)基上接種。培養(yǎng)溫度非常重要，應(yīng)為(25±2)℃，每一個(gè)粒種子相距1.5cm左右，經(jīng)過(guò)大概20d的培養(yǎng)即可獲得無(wú)菌苗，以用作組織培養(yǎng)的外植體材料。

1.2.1.2 人參成體莖塊葉的消毒

先用水沖洗干凈泥土，再用加餐洗凈的自來(lái)水浸泡，用自來(lái)水沖洗，移至超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸泡10～30s。以無(wú)菌水沖洗4次后，迅速倒入0.1%的HgCl2溶液中浸泡8～12min，傾去HgCl2溶液，再用無(wú)菌水沖洗4～5次。

1.2.2 接種

將已獲得的無(wú)菌苗移入超凈工作臺(tái)上，將無(wú)菌苗小心地從培養(yǎng)容器中取出，盡量不要損傷葉片。在無(wú)菌濾紙上切下葉片，再用解剖刀將葉片切成0.3～0.5cm2的小塊，接種于培養(yǎng)基上，并且要讓其背面接觸培養(yǎng)基，這樣有利于愈傷組織的產(chǎn)生。葉片切塊在培養(yǎng)容器中的放置密度以相互之間間隔1.5cm為宜。

將已消毒的人參置于超凈工作臺(tái)上，將根、葉柄切成可鑒定的0.3～0.5cm的小段，平放在培養(yǎng)基上；如果是葉片，同上切成可鑒定的0.3～0.5cm2的小塊，葉片平鋪于培養(yǎng)基上。

1.2.3 叢生芽的誘導(dǎo)

要選出最適合的培養(yǎng)基，具體方法：所選擇的無(wú)菌葉片一定要具備愈傷組織，切成小塊，基本培養(yǎng)基選擇MS，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以附加不同濃度的NAA，6-BA，觀察后得到結(jié)果。

1.2.4 誘導(dǎo)生根

在壯苗培養(yǎng)基或芽再生培養(yǎng)基上選取較為強(qiáng)壯的無(wú)根苗，取出后移至MS的基本培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，同時(shí)應(yīng)附加不相同濃度的IAA的生根培養(yǎng)基。

1.2.5 移栽

打開(kāi)已經(jīng)生根的試管瓶進(jìn)行煉苗，煉苗的必備條件是溫度25℃，5000～10000LX的光照強(qiáng)度，時(shí)間為3～5d。當(dāng)有小群的菌落剛剛出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面時(shí)，就及時(shí)地將試管苗從試管瓶中移出。

1.2.6 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為MS，附加不同濃度的激素及其組合。培養(yǎng)基中必須全部都加入3.5%的蔗糖，1.2%的瓊脂，pH=5.7，光照條件為1500～3500LX，溫度設(shè)置為26±1℃，每天13～17h的光照時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)人參愈傷組織，不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)有著不同的誘導(dǎo)效應(yīng)

對(duì)MS培養(yǎng)基附加不同的激素，然后在其上接種經(jīng)過(guò)以上方法處理過(guò)的外植體。30d時(shí)，誘導(dǎo)現(xiàn)象在幾種不同的外植體上都有所表現(xiàn)。培養(yǎng)基含有的激素濃度不同，對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)勢(shì)的影響也各異(表1)。

表1 不同濃度的激素的培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)勢(shì)影響

結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織最適合的外植體為無(wú)菌苗的葉及人參成體的根。最佳的培養(yǎng)基為MS+NAA0.1mg·L-1+KT0．5mg·L-1，成活率達(dá)75%以上，長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好。

2.2 叢生芽的誘導(dǎo)

在MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)切塊后的帶有愈傷組織的葉片，附加不同濃度的NAA，6-BA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，大概4～5w以后，不定芽便開(kāi)始在愈傷組織上產(chǎn)生。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)說(shuō)明，在MS+NAA0．5mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1中生長(zhǎng)得比較好。在壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)從叢生芽中選取的比較強(qiáng)壯的芽。

2.3 誘導(dǎo)生根

無(wú)根苗經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，大約在7d左右開(kāi)始生根。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明： MS+KT0.5mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1+IAA0.3mg·L-1+活性炭3g是最適合的生根培養(yǎng)基。

2.4 移栽

打開(kāi)已經(jīng)生根的試管瓶進(jìn)行煉苗，煉苗的必備條件是溫度為25℃、5000～10000LX的光照強(qiáng)度，時(shí)間為4～6d。當(dāng)有小的菌落剛剛出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面時(shí)，就及時(shí)地將試管苗從試管瓶中移出。為了保證一定的成活率，萬(wàn)一沒(méi)有出現(xiàn)菌落則要適當(dāng)延長(zhǎng)煉苗時(shí)間。

移栽的時(shí)候一定要細(xì)致地從瓶中取出苗，盡可能不要損害苗。苗取出后放入事先備好的干凈清水中，用試管刷或毛刷輕輕地掃除根部，盡可能徹底完全地清除掉苗根部周圍的瓊脂，移至河沙、珍珠巖、肥沃土壤、爐灰渣4種基質(zhì)中。置于26℃的溫度條件下，濕度90%左右的散射光條件下，10d后觀察后得出：移栽的最佳基質(zhì)是爐灰渣，這是由于爐灰渣是經(jīng)過(guò)高溫灼燒形成的。其中通氣性好、菌少，而且吸熱性好的黑色基質(zhì)使?fàn)t灰渣的溫度高，試管苗成活率高。

3 討論

在移栽時(shí)，特別要洗掉瓊脂，因?yàn)榄傊l(fā)霉容易引起爛根，這樣會(huì)浪費(fèi)資源，還會(huì)耽誤實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，因此在去除瓊脂時(shí)一定要精細(xì)、認(rèn)真。

人參的培養(yǎng)條件非常嚴(yán)格，所以必須每一步都遵循它的生長(zhǎng)條件，并且確保組培環(huán)境無(wú)菌。如果無(wú)菌工作做得不好，培養(yǎng)的幼苗就會(huì)生長(zhǎng)緩慢甚至培育失敗。所以這次實(shí)驗(yàn)在組培過(guò)程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室的要求，達(dá)到真正的無(wú)菌條件，讓實(shí)驗(yàn)更加真實(shí)，數(shù)據(jù)更加可信。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)所選的培養(yǎng)基附加了各種不同的激素濃度，實(shí)驗(yàn)材料所選用的外植體為人參無(wú)菌苗的幼葉。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：MS+KT0.5mg·L-1+IAA0.3mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1+活性炭3 g是誘導(dǎo)不定芽生根的最好的培養(yǎng)基；MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1是叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基；MS+NAA0.1mg·L-1+KT0.5mg·L-1則是誘導(dǎo)愈傷組織的最理想的培養(yǎng)基。

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2014-09-27

蘭 蘭(1981- )，女，吉林長(zhǎng)春人，長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生，長(zhǎng)春師范大學(xué)基建處助理工程師，從事細(xì)胞遺傳學(xué)研究。

魏 健(1980- )，男，吉林長(zhǎng)春人，講師，博士，從事植物學(xué)研究。

S567.5+1

A

2095-7602(2014)06-0078-04