郭玉層，潘俊鵬，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦爾·艾克拜爾

新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)廳哈密植物檢疫工作站，新疆哈密 839000

兩種瓜類細菌性果斑病菌快速檢測技術(shù)的比較及應(yīng)用

郭玉層，潘俊鵬，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦爾·艾克拜爾

新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)廳哈密植物檢疫工作站，新疆哈密 839000

以瓜類細菌性果斑病菌菌懸液田間和調(diào)運檢疫抽樣檢查時采集的病組織為試材，比較免疫凝聚試紙條和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒檢測的靈敏度和適應(yīng)性。兩者各有優(yōu)缺點，前者具有簡便、快速、易操作特點，適用于田間快速檢測和診斷；后者靈敏度較高，特異性更好，需要較長時間和儀器輔助，適用于室內(nèi)檢測。

瓜類；細菌性果斑病菌；免疫凝聚試紙條；瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒

瓜類細菌性果斑病是西瓜和甜瓜上最重要的毀滅性種傳病害，其病原為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovoraxavenaesubsp.citrulli,簡稱A.a.c），屬世界性檢疫病害，主要危害西瓜、甜瓜果實，產(chǎn)生大量病斑并造成果實腐爛，嚴重時有的地塊甚至100%發(fā)病，毀田絕收[1]。目前，使用抗病品種是防治果斑病最根本、最有效的措施，但是迄今并沒有發(fā)現(xiàn)對果斑病免疫或高抗的品種[2]。雖然化學(xué)藥劑處理可以減少種子的帶菌量,但不能從根本上起到防治細菌性果斑病的作用。因此快速而準確地檢測病原物是有效進行病害防治的基礎(chǔ)和前提。免疫凝聚試紙條檢測是利用抗原—抗體之間特異性結(jié)合原理的血清學(xué)技術(shù)[3]。瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-試紙法）將病原體DNA擴增、核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術(shù)有機地融為一體，在反應(yīng)中加入西瓜細菌性果斑病菌特異性引物和特異性探針，一次性完成病原體的擴增及雜交過程，然后用一次性核酸檢測裝置對西瓜細菌性果斑病菌感染進行定性檢測。

本文探討西甜瓜細菌性果斑病菌快速檢測技術(shù)免疫凝聚試紙條法和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-試紙法）在田間和調(diào)運檢疫過程中的應(yīng)用及推廣。

1 材料與方法

1.1 供試材料

待檢病甜瓜采自哈密市淖毛湖鎮(zhèn)8批、大南湖鎮(zhèn)2批，在煙墩聯(lián)合檢疫檢查站隨機抽樣檢驗的樣品28批，調(diào)自廣西、云南的西瓜各2批，調(diào)自鄯善縣的甜瓜2批，調(diào)自吐魯番的甜瓜1批，調(diào)自哈密市淖毛湖鎮(zhèn)的甜瓜4批，調(diào)自五家渠市的甜瓜4批，調(diào)自昌吉的西瓜3批。A.a.c菌株由新疆出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心提供。

免疫檢測試紙條，瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-試紙條法）（以下簡稱核酸檢測試劑盒）。

1.2 病組織預(yù)處理及菌株的菌懸液配制

挑取供試菌株的單菌落，于KB培養(yǎng)基28℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3d，用無菌水配制成濃度約1× 108cfu/mL的菌懸液備用[4]。將田間采集和煙墩所抽樣品的西甜瓜病組織用酒精棉球進行表面消毒，再用滅菌小刀切下，并分別一分為二，其中一份浸于免疫凝聚試紙條配套的樣品浸泡緩沖液袋中進行充分的研磨待測，另一份用滅過菌的研缽分別磨碎，并加入適量核酸檢測試劑盒中提供的0.1×TE緩沖液（以能完全浸泡病組織為宜）浸泡備用。

2 檢測結(jié)果與分析

2.1 免疫凝聚試紙條檢測

用商品化A.a.c專化型免疫凝聚試紙條檢測將1.2中配制的A.a.c菌懸液和組織浸泡液。打開試紙條包裝袋，取出試紙條，插入菌懸液和組織浸泡液中，浸泡深度不超過試紙條規(guī)定的示意線；5 min后取出試紙條，用吸水紙吸干并觀察。觀察陽性對照時，對照線和檢測線會在3～5min內(nèi)出現(xiàn)，表明檢測結(jié)果為陽性；在觀察檢測無菌DDH2O和PBS緩沖液做的空白對照(陰性對照)時，免疫凝聚試紙條只出現(xiàn)一條對照線，表明檢測結(jié)果為陰性；在檢測瓜病組織浸泡液時，只出現(xiàn)對照線，沒有檢測線出現(xiàn)，表明檢測結(jié)果為陰性；這說明檢疫人員采集的瓜樣品和抽樣檢驗的瓜樣品中無瓜類細菌性果斑病發(fā)生。如果沒有對照線出現(xiàn)，表明該試紙條檢測結(jié)果無效。

2.2 瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒檢測

將1.2中制備的A.a.c菌懸液和瓜病組織浸泡液按核酸檢測試劑盒中操作步驟進行樣品處理及DNA的提取，恒溫擴增和檢測，并在規(guī)定時間內(nèi)判讀結(jié)果。利用核酸檢測試劑盒檢測A.a.c菌懸液陽性對照時，質(zhì)控線和檢測線會在10min內(nèi)出現(xiàn)，表明檢測結(jié)果為陽性；在檢測DDH2O水和緩沖液做的空白對照(陰性對照)中的試劑盒中試紙條只出現(xiàn)一條質(zhì)控線，表明檢測結(jié)果為陰性；在檢測瓜病組織浸泡液時，只出現(xiàn)質(zhì)控線，沒有檢測線出現(xiàn)，表明檢測結(jié)果為陰性；這說明檢疫人員采集的瓜樣品和抽樣檢驗的瓜樣品中無瓜類細菌性果斑病發(fā)生或者瓜類果斑病菌的細菌拷貝數(shù)低于試劑盒最低檢測限。若檢測線強度較弱時，將檢測線強度與色卡進行對照：≧L4，為陽性，＜L4為陰性。無紅色線條出現(xiàn)為無效，表明核酸試紙條失效或一次性核酸檢測裝置損壞。

2.3 兩種方法檢測效果的比較

免疫凝聚試紙條和核酸檢測試劑盒檢測A.a. c菌懸液和西甜瓜病組織浸泡液各有特色和適應(yīng)性(表1)。

免疫凝聚試紙條檢測是利用抗原-抗體之間特異性結(jié)合原理的血清學(xué)技術(shù)，A.a.c菌株的蛋白質(zhì)作為抗原與試紙條中的特異性抗體結(jié)合，通過顯色反應(yīng)來表示菌懸液或病組織浸泡液的檢測結(jié)果，因此這種方法的特異性一般，靈敏度較低(106cfu/mL)，但投入成本低，操作簡易，在田間地頭都可檢測，而且所用時間極短，只需5min左右，適合田間快速診斷病害[4]。

核酸檢測試劑盒是將病原體DNA擴增、核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術(shù)有機地融為一體，在反應(yīng)中加入瓜類細菌性果斑病菌特異性引物和特異性探針，一次性完成病原體的擴增及雜交過程，然后用一次性核酸檢測裝置對瓜類細菌性果斑病菌感染進行定性檢測。因此這種方法的特異性較高，靈敏度較高(103～104cfu/mL)，投入成本也較高，且需少量的試劑和儀器設(shè)備才能完成檢測，其操作簡單易行，單個樣品的檢測所需時間約2h，適合室內(nèi)快速檢測和相關(guān)研究使用。而且其中運用了玻璃化DNA聚合酶保存技術(shù)實現(xiàn)了試劑盒的常溫運輸，密閉的一次性核酸檢測裝置有效避免了擴增產(chǎn)物氣溶膠擴散造成的污染和假陽性。

表1 兩種方法檢測A.a.c的效果比較

3 小結(jié)與討論

本文將免疫凝聚試紙條和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒應(yīng)用于田間快速檢測和調(diào)運檢疫快速檢測中，并將兩種檢測方法作了對比分析。結(jié)果表明，免疫凝聚試紙條檢測的靈敏度為106cfu/mL，并有簡便、快速、易操作等特點，適合于田間病害快速檢測和診斷;瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒應(yīng)的檢測靈敏度為103～104cfu/mL，比免疫凝聚試紙條提高了100～1000倍，效率高，特異性更好，但需要時間較長2h，而且需要一定的儀器設(shè)備，適用于常規(guī)實驗室的室內(nèi)快速檢測。

免疫凝聚試紙條和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒的商業(yè)化及其推廣應(yīng)用，為瓜類細菌性果斑病的田間快速檢測和病害早期的診斷和預(yù)防控制提供了技術(shù)條件，具有重要的實際應(yīng)用價值，尤其是將兩項技術(shù)結(jié)合運用于植物調(diào)運檢疫的快速檢測，首先用免疫凝聚試紙條進行瓜類細菌性果斑病菌的快速檢測和初步篩選，檢出為陽性后再用瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒進行確定，這樣大大提高了西、甜瓜的調(diào)運檢疫效率和瓜類細菌性果斑病菌的檢出率。

[1]周黎，張炳坤，冶海林，等.新疆瓜類細菌性果腐病的發(fā)生與病原鑒定[J].蔬菜,2013（3）:64-67.

[2]閻莎莎，王鐵霖，趙廷昌.瓜類細菌性果斑病研究進展[J].植物檢疫，2011，25（3）:71-76.

[3]聞慧，劉興洋，李國英,等.甜瓜細菌性果斑病菌檢測技術(shù)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(20):6182-6185.

[4]馮建軍，許勇，李健強,等.免疫凝聚試紙條和TaqMan探針實時熒光PCR檢測西瓜細菌性果斑病菌比較研究[J].植物病理學(xué)報,2006,36（2）:102-108.

郭玉層（1976年—），新疆阿勒泰人，農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫的工作。

2013－12－08