楊 柳，許敬亮，陳小燕，袁振宏

（1. 中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣州 510640；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

啟動(dòng)子對木糖異構(gòu)酶基因在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)的影響*

楊 柳1,2，許敬亮1?，陳小燕1，袁振宏1

（1. 中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣州 510640；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

以大腸桿菌的強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc和谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子Pgro作為大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶基因xylA在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始元件，通過實(shí)驗(yàn)表明谷氨酸棒桿菌自身的強(qiáng)啟動(dòng)子Pgro能有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的表達(dá)，同時(shí)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS序列的優(yōu)化對目的基因的表達(dá)水平有一定的影響。

谷氨酸棒桿菌；木糖異構(gòu)酶基因；穿梭表達(dá)載體；啟動(dòng)子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)

0 引 言

利用廉價(jià)、儲(chǔ)量豐富的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)液體燃料，對于解決當(dāng)前能源危機(jī)和環(huán)境問題具有重大意義。木質(zhì)纖維原料經(jīng)預(yù)處理和水解后可產(chǎn)生大量的葡萄糖和木糖[1,2]，其中木糖比例最高可達(dá)20%，然而自然界中的微生物大多不能以木糖作為發(fā)酵底物，這一問題已成為發(fā)展木質(zhì)纖維原料生物煉制的主要瓶頸[3,4]。谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum,C. g）是當(dāng)前氨基酸和核酸工業(yè)生產(chǎn)的主要菌株，由于其細(xì)胞壁較厚，對木質(zhì)纖維原料預(yù)處理過程中產(chǎn)生的抑制物具有良好的耐受性，但目前分離出的谷氨酸棒桿菌都由于缺失木糖異構(gòu)酶的編碼基因xylA而不能代謝木糖[1,5]。此外，由于谷氨酸棒桿菌與大腸桿菌等革蘭氏陰性菌在基因表達(dá)、調(diào)控機(jī)制上存在差異，往往會(huì)導(dǎo)致來自革蘭氏陰性菌的外源基因在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)量低甚至不表達(dá)[6,7]。

近年來，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，國內(nèi)外科研工作者已成功構(gòu)建了一系列谷氨酸棒桿菌工程菌，建立了高效的異源DNA轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌方法，并通過DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌代謝途徑的定向改造。研究表明，克隆來自宿主菌本身的強(qiáng)啟動(dòng)子，是構(gòu)建高效表達(dá)載體的關(guān)鍵。谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032groES基因（Gene ID：1018601）的啟動(dòng)子Pgro是一個(gè)內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子，能有效啟動(dòng)異源基因在谷氨酸棒桿菌中的轉(zhuǎn)錄[8-10]，擬通過 SOE PCR技術(shù)（Gene Splicing by Overlap Extension）[11]，研究啟動(dòng)子Pgro和groES基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（Ribosome binding sites, RBS）對木糖異構(gòu)酶基因xylA在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)中用到的菌株、質(zhì)粒及其相關(guān)特性見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基組分濃度（W/V）：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl；谷氨酸棒桿菌LBG培養(yǎng)基為添加了0.5% glucose的LB培養(yǎng)基。谷氨酸棒桿菌感受態(tài)的制備所用培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[7,12]（固體培養(yǎng)基添加2.2%瓊脂）。

1.1.3 酶及試劑

D-木酮糖、溶菌酶、三氯乙酸、X-gal、IPTG、卡那霉素、氨芐青霉素購自SIGMA；KOD-plus Taq DNA聚合酶購自Toyobo公司；Taq DNA Polymerase高溫聚合酶以及其他PCR相關(guān)試劑購自上海生工生物工程有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；其余試劑均為國產(chǎn)或者進(jìn)口分析純或生化級。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列及其酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)見表 2。引物 F-3/R-6下劃線處序列分別為NdeI和BamHI酶切位點(diǎn)；引物R-4斜體序列為與xylA基因5′ 端起始密碼子附近的序列反向互補(bǔ)；引物 F-5斜體序列為與啟動(dòng)子Pgro3′ 端附近的序列相對應(yīng)；引物F-7下劃線處為替換的RBS序列；引物R-8下劃線處序列與替換的RBS序列反向互補(bǔ)。

表2 本實(shí)驗(yàn)中的引物及其序列Table 2 Primers oligonucleotides used in this study

1.2.2 載體的構(gòu)建

SOE PCR技術(shù)示意圖如圖1所示。

圖1 SOE PCR技術(shù)示意圖Fig. 1 SOE PCR technology

根據(jù)GeneBank中已報(bào)道的基因groES序列以谷氨酸棒桿菌的基因組為模板、F-1/R-2為引物擴(kuò)增啟動(dòng)子Pgro，連接至復(fù)制質(zhì)粒pEASY。然后分別以質(zhì)粒 pEASY-Pgro為模板、F-3/R-4為引物擴(kuò)增Pgro啟動(dòng)子片段，以質(zhì)粒 pEASY-xylA為模板、F-5/R-6為引物擴(kuò)增xylA基因，第二輪 PCR通過引物F-3/R-6完成基因Pgro-xylA的重組。

根據(jù)在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)異源基因時(shí)使用的其他RBS序列的堿基長度以及堿基組成，結(jié)合原核表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)原則[13-15]，將groES基因上游的 RBS序列 GGAGGGATTCATC 置換為AAGGAGATATAGAT。同理，分別使用引物對F-7/R-8和F-7/R-6擴(kuò)增Pgro′片段和xylA′ 基因，所得PCR產(chǎn)物Pgro-xylA′。

最后利用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI消化穿梭載體pEC-XK99E和上述融合片段，通過T4 DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒 pEC-Pgro-xylA和pEC-Pgro-xylA′。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及檢測

將構(gòu)建好的表達(dá)載體 pEC-Pgro-xylA、pECPgro-xylA′分別轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC 13032，并以空載體pEC-XK99E(lacI-) 作為對照。谷氨酸棒桿菌ATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)[8,13]。以含卡那霉素終濃度為 50 μg/mL的平板為篩選條件，挑選轉(zhuǎn)化子通過酶切和PCR驗(yàn)證是否為陽性。

1.2.4 木糖異構(gòu)酶的表達(dá)與酶活測定

取過夜培養(yǎng)的菌液2 mL，在4℃下，5 000 × g離心5 min，收集菌體。重懸液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，置于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎。超聲處理時(shí)，將變幅桿（型號φ2）沒于液面和管底中間，超聲功率80 W，處理5 s間歇5 s直至重懸液變澄清，重復(fù)該過程5～10 min。將超聲處理后的菌懸液在4℃下，20 000 × g離心30 min，收集上清液，轉(zhuǎn)入干凈離心管中，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。由于谷氨酸棒桿菌是革蘭氏陽性菌，較難破壁，因此菌體用雙蒸水洗滌2次后，加入1 mL溶菌酶液，37℃處理1 h后再進(jìn)行超聲波破碎。將上述獲得的粗酶液通過半胱氨酸-咔唑法測定木糖異構(gòu)酶（XI）活性[16,17]。木糖異構(gòu)酶酶活單位定義為：在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每10 min催化產(chǎn)生 1 μmol D-木酮糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（即1 U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的融合片段Pgro-xylA擴(kuò)增

以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，F(xiàn)-1/R-2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用 1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有特異的單一條帶（圖2），大小與理論值（213 bp）接近，經(jīng)測序比對基因序列正確。

圖2 啟動(dòng)子PgroPCR產(chǎn)物Fig. 2 PCR amplification ofPgro

分別以F-3/R-4和F-5/R-6引物對擴(kuò)增Pgro啟動(dòng)子片段和xylA基因片段，以F-7/R-8和F-7/R-6引物對擴(kuò)增Pgro′啟動(dòng)子片段和xylA′

基因片段，電泳檢測有特異的單一條帶（圖3），并且各核酸片段大小與理論值接近，通過測序比對確認(rèn)基因序列正確。

圖3 SOE PCR第一輪產(chǎn)物Fig. 3 SOE PCR product in the first round

第二輪 PCR 以 F-3/R-6引物對完成基因Pgro-xylA和pEC-Pgro-xylA′的融合，由電泳結(jié)果可見約1 600 bp的目的條帶（圖4），與該基因的理論大小接近，測序結(jié)果顯示基因融合成功。

圖4 SOE PCR第二輪產(chǎn)物Fig. 4 SOE PCR product in the second round

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

重組質(zhì)粒pEC-Pgro-xylA和pEC-Pgro-xylA′，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞。將陽性轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒進(jìn)行NdeI/BamHI小量雙酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物理論大小為5 251 bp和1 600 bp。電泳結(jié)果如圖5所示，確認(rèn)表達(dá)載體pEC-Pgro-xylA和pEC-Pgro-xylA′構(gòu)建成功。

圖5 酶切驗(yàn)證Fig. 5 Restriction digestion analysis

2.3 表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌

圖6 谷氨酸棒桿菌ATCC 13032 PCR驗(yàn)證Fig. 6 Colony PCR verification forC.glutamicumATCC 13032

將表達(dá)載體pEC-Pgro-xylA、pEC-Pgro-xylA′分別轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC 13032，轉(zhuǎn)化結(jié)果通過菌落PCR驗(yàn)證，如圖6所示，可初步判斷pEC-Pgro-xylA(#3)、pEC-Pgro-xylA′ (#1′、#3′～5′)、pEC-XK99E(lacI-) (#9、#10)號為陽性轉(zhuǎn)化子。

2.4 蛋白質(zhì)電泳及酶活測定

選取谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032陽性轉(zhuǎn)化子pEC-Pgro-xylA-#3、 pEC-Pgro-xylA′-#4′和 pECXK99E(lacI-)-#9，進(jìn)行XI酶活測定和蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果如表3和圖7所示。在樣品總蛋白含量基本一致的條件下，相較于轉(zhuǎn)化空載體pEC-XK99E(lacI-) 粗酶液電泳結(jié)果，含有質(zhì)粒pEC-Pgro-xylA和 pEC-Pgro-xylA′的粗蛋白液在44.3 KDa附近出現(xiàn)顏色加深的條帶，與目標(biāo)蛋白XylA大小一致。相應(yīng)地，本實(shí)驗(yàn)只在轉(zhuǎn)化了xylA基因表達(dá)載體的重組菌株中檢測到木糖異構(gòu)酶酶活，分別為0.182 U/mg和0.237 U/mg蛋白，這表明啟動(dòng)子Pgro能有效啟動(dòng)xylA基因在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的表達(dá)，RBS序列的優(yōu)化能有效地提高xylA基因的表達(dá)水平。

表3 谷氨酸棒桿菌ATCC 13032轉(zhuǎn)化子XI酶活測定結(jié)果Table 3 XI activity ofCorynebacterium glutamicumATCC 13032 transformants

圖7 谷氨酸棒桿菌ATCC 13032轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)總蛋白SDS-PAGE圖Fig. 7 SDS-PAGE of total intracellular proteins from

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過 SOE PCR技術(shù)，以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032內(nèi)源基因groES的啟動(dòng)子Pgro作為xylA基因的轉(zhuǎn)錄起始元件，構(gòu)建了兩個(gè)含不同核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的表達(dá)載體 pEC-Pgro-xylA和pEC-Pgro-xylA′，其中一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列是基因groES自身的 RBS，另一個(gè)是谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中另一高表達(dá)基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的改變對該異源基因在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)水平有一定影響。

當(dāng)然，pEC-XK99E作為大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體，它在這兩種宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)不同，在谷氨酸棒桿菌中的拷貝數(shù)較低，對xylA基因的表達(dá)量也有一定影響[18]。除此之外，影響木聚糖異構(gòu)酶基因表達(dá)的原因還包括重組基因的穩(wěn)定性以及表達(dá)條件等。為此，接下來的研究可以從構(gòu)建高拷貝質(zhì)粒，將基因同源重組整合到谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組以及優(yōu)化表達(dá)條件幾個(gè)方面進(jìn)行。以此提高木糖異構(gòu)酶基因在谷氨酸棒桿菌的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)工程菌株對木質(zhì)纖維原料水解液的高效轉(zhuǎn)化利用。

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Effects of Promoter Modification on Xylose Isomerase Gene xylA Expression in Corynebacterium glutamicum

YANG Liu1,2, XU Jing-liang1, CHEN Xiao-yan1, YUAN Zhen-hong1
(1.Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The exogenous genexylAfromE. coliMG1655 was expressed inCorynebacterium glutamicumATCC 13032 with the strong promoterPtrcofE. coliand the endogenous promoterPgroofCorynebacterium glutamicumas transcription start components separately. The experiment result shows thatPgrocan be effective in the starting expressionxylAinCorynebacterium glutamicumATCC 13032. In addition, the sequence of RBS also has an impact on the gene expression level.

Corynebacterium glutamicum; xylose isomerase gene; shuttle vector; promoter; ribosome binding site

TK6；Q503

A

10.3969/j.issn.2095-560X.2014.05.005

2095-560X（2014）05-0353-05

楊 柳（1989-），女，碩士研究生，主要從事生物質(zhì)能方向研究。

許敬亮（1977-），男，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事纖維素生物醇和酶工程研究。

陳小燕（1981-），女，研究助理，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

袁振宏（1953-），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，長期從事生物質(zhì)能技術(shù)的研究、開發(fā)與管理工作。

2014-06-06

2014-06-23

國家自然科學(xué)基金（2117623和21211140237）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃，2013AA065803）；中科院院地合作項(xiàng)目和廣州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013J4300026）

? 通信作者：許敬亮，E-mail：xjl@ms.giec.ac.cn