莫媛媛 侯華新 黎丹戎陳云龍 梁 燕 莫春燕 王春苗 李 竟

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；△廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部

基礎(chǔ)研究

大黃素乙?；镏卤茄拾〤NE-1細(xì)胞線粒體自噬活性的研究

莫媛媛 侯華新 黎丹戎△陳云龍 梁 燕 莫春燕 王春苗 李 竟

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；△廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部

目的 研究大黃素乙?；镒饔帽茄拾〤NE-1細(xì)胞后，其線粒體損傷及其與線粒體自噬的關(guān)系。方法 以5 mg·L-1及10 mg·L-1大黃素乙?；镒饔帽茄拾〤NE-1細(xì)胞，通過(guò)透射電鏡觀察大黃素乙?；飳?dǎo)致鼻咽癌CNE-1細(xì)胞自噬體形成的超微結(jié)構(gòu)；激光共聚焦顯微鏡測(cè)定線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子、細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度變化及線粒體自噬的活性。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞都出現(xiàn)線粒體損傷以及線粒體自噬體。大黃素乙?；镒饔煤蟮募?xì)胞線粒體膜電位降低（P<0.05）；細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度升高（P<0.05）；細(xì)胞內(nèi)活性氧增加（P<0.05），且呈劑量依賴性。經(jīng)線粒體與溶酶體示蹤分析，可見(jiàn)大黃素乙?；镒饔玫膶?shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)酸性溶酶體增殖，其中包含線粒體探針標(biāo)記的線粒體碎片等典型的自噬特征，且增加的趨勢(shì)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論 大黃素乙?；锟芍卤茄拾〤NE-1細(xì)胞線粒體損傷，并與線粒體自噬密切相關(guān)。

鼻咽腫瘤；大黃素乙酰化物；線粒體自噬；透射電鏡；激光共聚焦顯微鏡

癌細(xì)胞往往存在凋亡逃逸的現(xiàn)象，導(dǎo)致以促凋亡為基礎(chǔ)的治療療效低下，而誘導(dǎo)凋亡缺陷的細(xì)胞自噬死亡是減少抗癌藥物耐受性以及提高化療敏感性的一種高效的方式［1，2］。本課題組前期以大黃素為基本結(jié)構(gòu)，化學(xué)合成了大黃素乙?；?，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該化合物可聚集在鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的線粒體上，無(wú)細(xì)胞毒作用的大黃素乙?；铮?0 mg·L-1）對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞具有放射增敏活性，并伴隨線粒體的損傷［3］。為進(jìn)一步研究大黃素乙?；飳?duì)鼻咽癌細(xì)胞線粒體損傷的機(jī)制及線粒體損傷與自噬的關(guān)系，本文通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡和電鏡技術(shù)，觀察大黃素乙?；飳?dǎo)致鼻咽癌CNE-1細(xì)胞自噬體形成的超微結(jié)構(gòu)，測(cè)定自噬過(guò)程中線粒體跨膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子、細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度等變化，探討大黃素乙酰化物作為自噬誘導(dǎo)劑的可能性。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株由廣西腫瘤防治研究所傳代保存。細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)單層傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑

大黃素乙?；镉杀菊n題組以大黃素為基本結(jié)構(gòu)化學(xué)合成，其結(jié)構(gòu)為1，8-二羥基-3-乙?；?6-甲基-9，10蒽醌，并經(jīng)紅外光譜（IR）、核磁共振氫譜（1HNMR）及碳譜（13C-NMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證［3］?；钚匝鯔z測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。Fluo-3/AM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。溶酶體探針lyso-Tracker Red和線粒體探針Mito Tracker Green為美國(guó)LIFE公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

激光共聚焦顯微鏡為日本Nikon公司，型號(hào)為A1，透射電鏡為日本日立公司，型號(hào)為H7650。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

空白對(duì)照組，不做任何處理；低濃度大黃素乙?；铮? mg·L-1）實(shí)驗(yàn)組；高濃度大黃素乙酰化物（10 mg·L-1）實(shí)驗(yàn)組。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組所用的藥物濃度均無(wú)細(xì)胞毒性，各組細(xì)胞經(jīng)藥物孵育作用1 h后，棄去含藥的培養(yǎng)基，再經(jīng)正常培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)處理后的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、收集，以3%戊二醛、1%鋨酸雙重固定，丙酮逐級(jí)脫水、苯二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片。用透射電鏡觀察和攝圖。

2.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定

各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后，以PBS清洗細(xì)胞，加入10 μmol·L-1的Fluo-3/AM探針，避光、37℃孵育1 h，用無(wú)鈣緩沖液反復(fù)洗滌3次后，將細(xì)胞保存于無(wú)鈣緩沖液中并在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察和攝圖。每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.4 細(xì)胞線粒體膜電位的測(cè)定

各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后，以PBS清洗細(xì)胞，加入1 ml（5 μg·ml-1）的Rhodamine 123，避光、37℃孵育30 min，以PBS洗滌3次，將細(xì)胞在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察和攝圖。每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧的測(cè)定

各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后，以PBS清洗細(xì)胞，加入1∶1 000的DCFH-DA探針，避光、37℃孵育20 min，以無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌3次后，用激光共聚焦顯微鏡掃描和攝圖。每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.6 線粒體與溶酶體探針示蹤分析

各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后，以PBS清洗細(xì)胞，加入37℃預(yù)熱的0.5 μmol·L-1線粒體探針Mito-Tracker Green，20 min后撤去探針，再加入0.5 μmol·L-1溶酶體探針lyso-Tracker Red 20 min后，將細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡下分析檢測(cè)溶酶體對(duì)線粒體的吞噬活性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)活性氧、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度通過(guò)NIS-element AR軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件的方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 自噬線粒體的超微結(jié)構(gòu)

如圖1所示，空白對(duì)照組線粒體未見(jiàn)有明顯損傷，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，基本沒(méi)有自噬線粒體的形成；低濃度（5 mg·L-1）實(shí)驗(yàn)組線粒體有些腫脹，未見(jiàn)脊斷裂，但空泡明顯增多，有少量自噬線粒體出現(xiàn)；高濃度（10 mg·L-1）實(shí)驗(yàn)組的大部分線粒體出現(xiàn)脊融合或者消失，線粒體腫脹、空泡明顯，有些雙層膜已消失，出現(xiàn)大量的自噬線粒體（如箭頭所示）。

圖1 透射電鏡下觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)注：A、D.空白對(duì)照組細(xì)胞；B、E.低濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞；C、F.高濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。

3.2 細(xì)胞線粒體跨膜電位

經(jīng)大黃素乙酰化物作用CNE-1細(xì)胞后，空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度為40.58±3.56，其線粒體膜電位（ΔΨm）最高，而實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度減弱，分別為32.09±1.61和22.42±1.23，表明其線粒體跨膜電位下降，且呈劑量依賴性（F=44.143，P=0.000）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化注：*與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

3.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度最低為（1 166.04±77.43），而經(jīng)大黃素乙?；镒饔肅NE-1細(xì)胞后，細(xì)胞中游離的鈣離子濃度隨著藥物濃度的增加而顯著升高（5 mg·L-1組為1 388.16±48.63；10 mg·L-1組為1 427.15±54.55），與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.75，P=0.004）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化注：*與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

3.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度

如圖4所示，細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度隨著大黃素乙酰化物的濃度增加而升高?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度值為816.84±53.92，5 mg·L-1和10 mg·L-1藥物實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度值分別為1 027.47±34.05和1 472.66±110.68（F=61.835，P=0.000）。

3.5 線粒體探針與溶酶體探針示蹤分析

對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的線粒體和酸性溶酶體同時(shí)采用線粒體探針Mito-Tracker Green（MTG）和溶酶體探針Lyso-Tracker Red（LTR）染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察去極化的線粒體是否與溶酶體融合，即是否發(fā)生了線粒體自噬，檢測(cè)細(xì)胞線粒體的自噬活性。激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示細(xì)胞線粒體及溶酶體的形態(tài)，紅色為溶酶體探針標(biāo)記的信號(hào)；綠色為線粒體探針標(biāo)記的信號(hào)。合并的圖片中黃色區(qū)域顯示線粒體與溶酶體的共定位。如圖5所示，空白對(duì)照組線粒體豐富，顯影清晰，呈棒狀或短棒狀交織連接而成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，溶酶體數(shù)量較少。經(jīng)大黃素乙?；镒饔煤?，細(xì)胞的線粒體隨著藥物濃度的增加其形狀改變?yōu)辄c(diǎn)狀或粒狀，與線粒體探針的結(jié)合信號(hào)減弱，而溶酶體與探針的結(jié)合信號(hào)隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)，且包含的線粒體碎片的溶酶體數(shù)量增多（黃色區(qū)域）。

圖5 大黃素乙?；镒饔肅NE-1細(xì)胞后線粒體的自噬活性注：A.空白對(duì)照組；B.5 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組；C.10 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組。

4 討論

線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)最主要的能量供應(yīng)場(chǎng)所，在其發(fā)揮生物效應(yīng)過(guò)程中為應(yīng)對(duì)細(xì)胞環(huán)境的變化而引起線粒體的損傷，從而產(chǎn)生線粒體自噬。線粒體自噬一般分為4個(gè)時(shí)期：①線粒體受損后其通透性轉(zhuǎn)變，線粒體去極化［4］；②形成線粒體自噬體［5］；③形成成熟的線粒體自噬溶酶體［6］；④線粒體被溶酶體降解。研究表明，自噬是一把雙刃劍，在腫瘤微環(huán)境中，自噬既能在不利的環(huán)境中提高腫瘤細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的耐受能力，維持其生存；另一方面，過(guò)度線粒體自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡［7］。因此，研究和開(kāi)發(fā)自噬誘導(dǎo)劑，促使抗凋亡的腫瘤細(xì)胞或缺乏凋亡機(jī)制的腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，是提高腫瘤化療敏感性的一個(gè)新方向［8］。

電子顯微鏡可以觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，是目前檢測(cè)自噬過(guò)程自噬體形成的金標(biāo)準(zhǔn)［9］，但該法由于耗時(shí)長(zhǎng)且存在較強(qiáng)的主觀性，有時(shí)候還要借助一些示蹤劑來(lái)對(duì)自噬體進(jìn)行顯影。本研究選擇線粒體及溶酶體兩種探針進(jìn)行染色，LTR探針主要用于標(biāo)記和追蹤活細(xì)胞中的酸性細(xì)胞器，對(duì)酸性細(xì)胞器如溶酶體具有高選擇性，染色后產(chǎn)生紅色熒光［10］。MTG探針的細(xì)胞通透性好，與細(xì)胞簡(jiǎn)單孵育后能被動(dòng)地滲透質(zhì)膜，與活性的線粒體結(jié)合發(fā)射綠色熒光。在激光共聚焦顯微鏡下實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種細(xì)胞器已融合或者受損嚴(yán)重看不清輪廓的細(xì)胞器進(jìn)行共定位。同時(shí)還可動(dòng)態(tài)示蹤自噬體的形成和對(duì)細(xì)胞器自噬程度進(jìn)行半定量分析。本研究以電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察到大黃素乙?；锟梢赃x擇性地?fù)p傷線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬體的產(chǎn)生。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加［11］、活性氧的升高［12］以及膜電位的下降［13］與線粒體損傷有關(guān)，是促發(fā)自噬的關(guān)鍵因素。本課題組前期發(fā)現(xiàn)具有蒽醌母核結(jié)構(gòu)的大黃素乙?；?，是一種生物還原性物質(zhì)，易聚集在乏氧的腫瘤細(xì)胞線粒體上，導(dǎo)致線粒體脊腫脹、空泡化。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素乙?；镒饔肅NE-1細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高，細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度亦增加，而細(xì)胞線粒體跨膜電位下降。提示大黃素乙?；锟赡芘c細(xì)胞內(nèi)的氧化還原酶反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，過(guò)量活性氧可以靶向損傷線粒體，作用于膜滲透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP），改變其構(gòu)象使其呈現(xiàn)開(kāi)放狀態(tài)［14］，線粒體膜去極化，引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換（MPT），導(dǎo)致膜電位下降［15］，同時(shí)大黃素乙?；锎碳?nèi)質(zhì)網(wǎng)使其紊亂，造成游離鈣離子濃度的增加，破壞線粒體膜電位和ATP合成水平，最終引發(fā)自噬。

研究表明，一些天然食物及其類似物或化合物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和抑制增殖的作用［16］。本研究選取大黃素乙酰化物作用于鼻咽癌CNE-1細(xì)胞線粒體損傷可以誘發(fā)線粒體自噬，研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)促腫瘤細(xì)胞自噬性死亡的藥物提供了新的線索。探討自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制，或許可以揭開(kāi)抗腫瘤藥物的新篇章，但如何提高該藥物對(duì)腫瘤組織或細(xì)胞的靶向性，降低其毒副反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

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［2013-12-05收稿］［2014-01-28修回］［編輯 阮萃才］

Mitophagy of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells induced by acetylated emodin derivative

MO Yuan-yuan，HOU Hua-xin，LI Dan-rong△，CHEN Yun-long，LIANG Yan，MO Chun-yan，WANG Chun-miao，LI Jing（College of Pharmaceutical Science of Guangxi Medical University；△Department of Research，Guangxi Cancer Institute，Nanning 530021，P.R. China）

HOU Hua-xin.E-mail：houhuaxin@163.com

Objective To explore the relationship between mitochondrial damage and mitophagy in nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells treated with acetylated emodin derivative.Methods CNE-1 cells were divided into a control group and groups treated with 5 or 10 mg·L-1of acetylated emodin derivative.After treatment，autophagosome ultrastructure was analyzed by transmission electron microscopy，while mitochondrial membrane potential and levels of intracellular free calcium ion and reactive oxygen species were measured by confocal microscopy.Results Cells treated with acetylated emodin derivative showed mitochondrial damage and the presence of mitophagosomes，which were not observed in control cells.The emodin derivative also led to a significant decrease in mitochondrial membrane potential and increases in levels of intracellular free calcium ion and reactive oxygen species（P<0.05）；these effects were dose-dependent.Analyzing mitochondrial and lysosome markers of treated cells revealed typical mitophagic features，including acidic lysosomal proliferation and lysosomes containing mitochondrial remnants labeled with Mito Tracker Green.The abundance of these features was also dose-dependent.Conclusion The acetylated emodin derivative can cause mitochondrial damage in nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells，perhaps through a mechanism closely related to mitophagy.

Nasopharyngeal neoplasm；Acetylated emodin derivative；Mitophagy；Transmission electron microscopy；Confocal laser scanning microscopy

R739.63

A

1674-5671（2014）01-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81060270）；廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心開(kāi)放基金資助項(xiàng)目（KFJJ2011-25）

候華新。E-mail：houhuaxin@163.com