石麗君李夢迪李 力 王 琪

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤教育部重點實驗室；△廣西醫(yī)科大學研究生學院

基礎研究

DNA-PKcs在鉑類耐藥形成過程中的動態(tài)表達及臨床因素的相關性分析

石麗君△李夢迪△李 力 王 琪

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤教育部重點實驗室；△廣西醫(yī)科大學研究生學院

目的 動態(tài)檢測裸鼠鉑類耐藥模型DNA依賴蛋白激酶催化亞單位（DNA-PKcs）在鉑類耐藥形成過程的變化，分析卵巢癌患者DNA-PKcs的表達水平與臨床因素的相關性，為腫瘤患者的個體化治療提供實驗依據(jù)。方法 以實時熒光定量PCR技術檢測DNA-PKcs mRNA的表達；Pearson相關分析卵巢癌患者DNA-PKcs的表達量與卵巢癌患者臨床因素的相關性，Kaplan-Meier法分析臨床因素及DNA-PKcs的表達對患者無疾病進展生存時間和總生存時間的影響；Cox回歸模型分析卵巢癌預后相關因素對患者生存的影響。結果 裸鼠體內鉑類耐藥移植瘤DNA-PKcs的表達顯著低于鉑類敏感對照（P=0.003），鉑類敏感細胞在獲得性耐藥形成過程中DNA-PKcs的表達逐漸下降，耐藥細胞產(chǎn)生以后，DNAPKcs基因的表達始終在較低的水平。Pearson分析表明DNA-PKcs的表達與患者對鉑類藥物初始治療的反應和鉑類耐藥的產(chǎn)生呈顯著負相關（P=0.000）。Kaplan-Meier法分析顯示，F(xiàn)IGO分期越早、無術后殘余病灶、對鉑類初次治療有效、鉑類治療敏感、DNA-PKcs高表達的患者的生存時間顯著延長（P＜0.05）。Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)納入影響卵巢癌患者總生存時間的危險因素為鉑類初始治療反應（P=0.047）和鉑類耐藥產(chǎn)生（P=0.047），鉑類藥物治療完全有效和部分有效患者的DNA-PKcs表達量顯著高于腫瘤無消退和腫瘤增長的兩組患者（P=0.000），鉑類敏感患者DNA-PKcs平均表達量顯著高于鉑類耐藥患者（P=0.000）。結論 DNA-PKcs的表達下降與鉑類耐藥形成相關，可能作為判斷卵巢癌鉑類耐藥產(chǎn)生的潛在標志分子。

卵巢腫瘤；耐藥性，鉑類；DNA依賴蛋白激酶催化亞單位

卵巢癌是死亡率居首位的女性生殖道惡性腫瘤。雖經(jīng)過規(guī)范的腫瘤細胞減滅術和以鉑類/紫杉醇為基礎的化療，但仍有70%的患者面臨復發(fā)或疾病進展，晚期患者的5年生存率不足40%。腫瘤細胞對于化療藥物產(chǎn)生耐藥性是影響患者預后的重要因素，臨床上對鉑類耐藥進行預測，對于指導患者的個體化治療和改善卵巢癌的預后具有重要意義。

DNA依賴蛋白激酶催化亞單位（DNA-PKcs）是DNA修復基因家族成員，研究表明，各種惡性腫瘤中普遍存在DNA-PKcs表達的變化，提示該酶可作為一種腫瘤標志物，其表達水平不但與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，還與某些腫瘤的病理類型、分期及侵襲性有關，并與腫瘤放化療敏感性和預后有重要關系。本研究利用前期建立的裸鼠體內耐藥模型，動態(tài)觀察鉑類耐藥形成過程中DNA-PKcs動態(tài)表達的變化，并分析臨床大樣本量卵巢癌患者DNA-PKcs的表達水平與患者的臨床分期、初次化療敏感性和生存時間的關系，為患者的個體化治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例標本來源 收集2009年9月至2013年4月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院行手術后輔助鉑類為基礎化療的初治上皮性卵巢癌患者冰凍組織256例，詳細記錄患者相關的臨床資料，其中鉑類耐藥89例，鉑類敏感167例?；颊叩呐R床資料見表1。以8例年齡50～55歲的子宮肌瘤患者的正常卵巢組織為對照。

1.1.2 實驗動物及細胞株 SKOV3-GFP為帶有綠色熒光標記（green fluorescent protein，GFP）標記的SKOV3親本細胞，SKOV3/DDPⅱ是本課題組前期在裸鼠體內由順鉑誘導的SKOV3-GFP耐藥細胞株［1］，耐藥指數(shù)達2.42倍。裸鼠（SPF級，BalB/C系）由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，均為4周齡左右的雌性裸鼠，體重為18～20 g。

1.1.3 主要試劑 順鉑為山東齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，Trizol Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，M-MLV Reverse Transcriptase由美國 Promega公司提供，SYBR Premix Ex TaqⅡ購自日本TAKARA公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

表1 256例以鉑類為基礎化療的上皮性卵巢癌患者的臨床資料

1.2 方法

1.2.1 鉑類耐藥裸鼠模型的建立 動物模型的建立按本實驗前期探索條件完成［1］，SKOV3-GFP和SKOV3/DDPⅱ細胞接種于18～20 g裸鼠腹股溝皮下，成瘤后用游標卡尺測量皮下腫瘤的長（a）和寬（b），腫瘤體積（mm3）=0.52×a×b2，待腫瘤生長至400 mm3后，隔天腹腔內注射順鉑，劑量為4 mg/kg，分別在0次、2次、5次和8次注射順鉑后于次日取出瘤組織，-80℃保存。

1.2.2 QRT-PCR檢測DNA-PKcs的表達 取裸鼠移植瘤和患者卵巢癌的冰凍組織，以Trizol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，以QRT-PCR技術檢測DNA-PKcs的表達。DNA-PKcs上游引物為5′-TTTCCAGAGATTTCGGTTTGC-3′，下游引物為5′-AATTTCAACAGAGTAAGGTGCGAT-3′；退火溫度54℃。以GAPDH基因為內參，采用2-△△Ct法計算實驗組目的基因的表達相對于對照組表達量變化的倍數(shù)。

1.2.3 DNA-PKcs的表達與臨床預后的相關性分析以Pearson相關分析卵巢癌組織DNA-PKcs的表達量與臨床因素的關系，包括FIGO分期、病理分級、術后殘余灶、鉑類初始治療反應、無疾病進展生存時間（progression free survival，PFS）、總生存時間（overall survival，OS）、無進展狀態(tài)、鉑類耐藥產(chǎn)生、1年內復發(fā)和1年內死亡等。

根據(jù)鉑類化療結束后是否在6個月內復發(fā)，將卵巢癌患者分為鉑類化療敏感組和鉑類耐藥組，根據(jù)鉑類化療敏感組和鉑類耐藥組DNA-PKcs的平均表達量，將患者分為DNA-PKcs值≥耐藥組均值和DNAPKcs值≤敏感組均值兩組，以Kaplan-Meier法分析各臨床因素及DNA-PKcs的表達對PFS和OS影響。Cox回歸模型分析與PFS相關的臨床因素。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。DNA-PKcs表達量差異的比較采用t檢驗。用Pearson相關分析DNA-PKcs的表達量與臨床因素之間的關系。Kaplan-Meier法采用long-rank進行檢驗。Cox回歸模型分析采用相對風險比（RHR）及其95%置信區(qū)間（95%CI）對多種指標的共同效應進行評價，若RHR＞1時，則不利因素占主導地位，若RHR＜1時，則保護因素占主導地位；若RHR=1或以95%CI包含1時，則兩者處于平衡狀態(tài)。P＜0.05作為顯著性檢驗水準。

2 結果

2.1 順鉑給藥后DNA-PKcs在裸鼠腫瘤組織中的動態(tài)表達

順鉑作用于裸鼠體內移植瘤后，隨時間推移雖然腫瘤重量增加，但是SKOV3/DDPⅱ形成的瘤塊重量始終明顯大于SKOV3-GFP移植瘤，而且第8次注射順鉑以后，SKOV3-GFP移植瘤變?。▓D1A）。QRT-PCR法檢測結果顯示，給藥初期SKOV3/DDPⅱ瘤塊的DNA-PKcs表達量顯著低于SKOV3-GFP（P=0.003），DNA-PKcs的表達量隨順鉑給藥次數(shù)的增加而下降（圖1B）。但以DNA-PKcs的表達為縱坐標，瘤塊重量為橫坐標繪制散點圖，結果表明SKOV3-GFP瘤塊中DNA-PKcs相對表達量的降低速度明顯大于SKOV3/ DDPⅱ，SKOV3-GFP的斜率是SKOV3/DDPⅱ的7.9倍（圖1C）。

圖1 連續(xù)予順鉑注射處理后，裸鼠移植瘤重量和DNA-PKcs基因表達量的變化

2.2 卵巢癌組織DNA-PKcs的表達量與臨床預后因素的相關性分析

以Pearson相關分析卵巢癌組織DNA-PKcs的表達量與臨床預后因素的相關性。結果表明DNA-PKcs的表達與患者對鉑類藥物初始治療的反應和鉑類耐藥的產(chǎn)生呈顯著負相關（P=0.000）。見表2。根據(jù)卵巢癌患者對鉑類藥物初始治療的反應情況，分為完全有效、部分有效、腫瘤無消退和腫瘤增長4個組，結果顯示鉑類藥物治療完全有效和部分有效組DNA-PKcs的表達量顯著高于腫瘤無消退和腫瘤進展兩組患者（圖2A，P=0.000）；根據(jù)鉑類化療結束后6個月內是否復發(fā)，將卵巢癌患者分為鉑類敏感組和鉑類耐藥組，結果可見鉑類敏感組的DNA-PKcs平均表達量為3.678±0.225，顯著高鉑類于耐藥組的2.327±1.048（P=0.000，圖2B）。

圖2 鉑類藥物治療不同效果的卵巢癌患者DNA-PKcs的表達比較

表2 卵巢癌組織DNA-PKcs的表達量與臨床預后因素的Pearson相關分析

用Kaplan-Meier法分析卵巢癌患者FIGO分期、病理分級、術后殘余灶、鉑類初始治療反應和鉑類耐藥產(chǎn)生對OS和PFS的影響，結果顯示，F(xiàn)IGO分期越早、術后無殘余病灶、對鉑類初次治療有效，并且鉑類治療敏感的患者其OS和PFS顯著增長（P＜0.05），反之生存時間則較短（圖3、圖4）。根據(jù)鉑類化療敏感組和鉑類耐藥組的DNA-PKcs平均表達量，將患者分為DNA-PKcs值≥3.678和DNA-PKcs值≤2.327兩組，以Kaplan-Meier法分析DNA-PKcs的表達對OS和PFS的影響，結果DNA-PKcs值≥3.678組的OS和PFS均顯著長于DNA-PKcs值≤2.327組（圖5）。Cox回歸模型分析上述Kaplan-Meier法分析具有差異顯著性的因素，發(fā)現(xiàn)納入影響卵巢癌患者的OS和PFS的危險因素為鉑類初始治療反應（P=0.047）和鉑類耐藥產(chǎn)生（P=0.047），DNA-PKcs雖然沒有被納入，但差異接近顯著性水平（P=0.067）。

圖3 Kaplan-Meier法分析卵巢癌患者FIGO分期、術后殘余病灶、鉑類初始治療反應和鉑類耐藥產(chǎn)生對總生存時間的影響

圖4 Kaplan-Meier法分析卵巢癌患者FIGO分期、術后殘余病灶、鉑類初始治療反應和鉑類耐藥產(chǎn)生對無疾病進展生存時間的影響

圖5 DNA-PKcs的表達對卵巢癌患者總生存時間和無疾病進展生存時間的影響

3 討論

目前，以順鉑及其類似物卡鉑和奧沙利鉑為基礎結合紫杉醇類的聯(lián)合化療是上皮性卵巢癌重要的治療手段［2］。盡管順鉑初期治療卵巢癌表現(xiàn)出極度敏感［3］。但仍有15%～20%患者出現(xiàn)原發(fā)耐藥，80%的患者雖然對鉑類敏感，但可能在反復的化療過程中產(chǎn)生獲得性耐藥［4］。臨床上普遍存在的腫瘤化療多藥耐藥（multi drug resistance，MDR）現(xiàn)象是導致化療失敗、制約提高生存率的中心環(huán)節(jié)。因此，尋找可用于判斷卵巢癌MDR產(chǎn)生及其預后的分子，以采取更有效的化療方案，是提高患者預后及生存質量的關鍵。

本研究利用前期建立的卵巢癌鉑類誘導耐藥動物模型，篩選與耐藥產(chǎn)生相關的差異基因［5］，發(fā)現(xiàn)鉑類敏感的卵巢癌細胞高表達DNA-PKcs mRNA，當接受順鉑刺激后，DNA-PKcs mRNA的表達水平明顯下降，在獲得性耐藥形成過程中隨順鉑給藥次數(shù)的增加而下降，當耐藥細胞產(chǎn)生以后，DNA-PKcs的基因表達始終在較低的水平。說明DNA-PKcs的表達下降可能與鉑類耐藥形成相關。

對256例卵巢癌患者DNA-PKcs基因表達分析表明，DNA-PKcs的表達水平與患者對鉑類治療初次反應和鉑類耐藥產(chǎn)生呈負相關，而Cox回歸模型分析顯示對鉑類治療初次反應和鉑類耐藥產(chǎn)生是影響患者生存時間的危險因素。Kaplan-Meier單因素生存分析表明，DNA-PKcs高表達組患者的生存時間明顯長于低表達組患者的生存時間。上述結果提示DNA-PKcs可能作為判斷卵巢癌鉑類耐藥產(chǎn)生的標志分子。

既往研究表明DNA-PKcs是DNA-PK復合物由一個催化亞基DNA-PKcs和兩個調節(jié)亞基Ku80和Ku70組成，是DNA損傷修復的關鍵酶。DNA-PKcs在腫瘤組織、腫瘤旁組織及正常組織中均有表達，表明DNA-PKcs對DNA的損傷修復能力是一種基本的細胞功能，腫瘤的發(fā)生都與DNA-PKcs的損傷有關，DNA-PKcs受損后其活性下降，使人體極易發(fā)生各種惡性腫瘤［6］。鉑類藥物治療腫瘤的關鍵是誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞的增殖、生長。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA-PKcs高表達的患者相對于低表達的患者對鉑類治療高度敏感［7］。Stronach等［8］研究表明Akt信號通路參與卵巢癌細胞凋亡，DNA-PKcs可以維持Akt信號通路。DNA-PKcs除了參與DNA修復，還參與DNA復制調控、免疫球蛋白和T細胞表面抗原受體V（D）J重組，作為轉錄因子調節(jié)某些基因的表達，細胞程序性死亡的信號轉導、維持端粒結構等多種生化反應［9］。因此，我們推測DNA-PKcs的低表達可能使卵巢癌細胞不能得到有效的DNA修復以及不能啟動細胞凋亡程序，從而促進卵巢癌細胞增殖和復發(fā)。

通過基因芯片、分子雜交等分析發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs在細胞惡性轉化的早期階段受到抑制，惡性轉化后其表達又上升，表明腫瘤細胞同樣可利用DNA-PKcs的修復功能進行生長、增殖［10］。前列腺癌細胞核染色DNA-PKcs陽性與放療抵抗密切相關［11］。DNA-PKcs和PARP-1可能通過激活細胞自噬誘導乳腺癌化療耐藥［12］。DNA-PKcs的表達對腫瘤耐藥可能具有雙向作用，具體取決于DNA-PKcs修復與細胞凋亡相關途徑還是耐藥相關途徑如細胞自噬等。DNA-PKcs可否用于判斷卵巢癌鉑類耐藥的產(chǎn)生，還需要進一步分析DNA-PKcs調控的下游機制，有關方面有待深入研究。

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［2014-04-09收稿］［2014-05-22修回］［編輯 阮萃才］

Dynamics of DNA-dependent protein kinase expression in the development of platinum resistance and correlation with clinical factors

SHI Li-jun△，LI Meng-di△，LI Li，WANG Qi（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；Key Laboratory of High Incidence of Tumors of the Guangxi Region，Ministry of Education；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

WANG Qi.E-mail：qi_catcat@163.com

Objective To analyze the dynamics of DNA-dependent protein kinase（DNA-PKcs）expression in a nude mouse model of platinum resistance，as well as correlate the dynamics with clinicopathological characteristics of ovarian cancer patients，in order to develop an experimental system for individualized chemotherapy.Methods DNA-PKcs expression was measured by real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Pearson correlation was used to examine associations between expression levels and clinical factors in patients with ovarian cancer.Kaplan-Meier analysis was used to examine association of DNA-PKcs expression with progression-free survival（PFS）and overall survival（OS）.Factors affecting patient survival were identified by Cox regression.Result DNA-PKcs expression was significantly lower in transplanted platinum-resistant tumors than in platinum-sensitive controls（P=0.003）.Development of drug resistance was associated with a gradual decrease in DNA-PKcs expression，which remained low during the production of platinum-resistant tumor cells.Pearson analysis showed that DNA-PKcs expression correlated negatively with both patient response to platinum treatment and the level of platinum resistance（P=0.000）.Kaplan-Meier analysis showed significantly higher survival rates for patients at an early FIGO stage，patients without residual disease，patients who responded to primary platinum treatment，patients sensitive to platinum，and patients with high DNA-PKcs expression（P＜0.05）.Cox regression identified two factors affecting survival time in patients with ovarian cancer：response to primary platinum treatment（P=0.047）and platinum resistance（P=0.047）.DNA-PKcs expression was significantly higher in patients who responded completely to platinum treatment than in patients with stable or progressive tumors（P=0.000）.Similarly，DNA-PKcs expression was significantly higher in platinumsensitive patients than in platinum-resistant ones（P=0.000）.Conclusion The development of platinum resistance may be associated with a reduction in DNA-PKcs expression，suggesting that DNA-PKcs may be a useful biomarker of platinum resistance in ovarian cancer.

Ovarian neoplasm；Drug resistance，Platinum；DNA-dependent protein kinase

R735.7

A

1674-5671（2014）02-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.04

國家自然科學基金資助項目（81360341）；廣西科學研究與技術開發(fā)計劃資助項目（桂科攻1140003A-34）；廣西自然科學基金資助項目（2011GXNSFA018190）；廣西醫(yī)學科學實驗中心開放基金資助項目（KFJJ2010-3）【通信作者】王 琪。E-mail：qi_catcat@163.com