趙靜 向陽

作者單位：100730 北京 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科

專家論壇

絨癌耐藥機(jī)制的研究現(xiàn)狀

趙靜 向陽

作者單位：100730 北京 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科

向陽，教授、博士研究生導(dǎo)師?，F(xiàn)任中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科副主任,國際滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤學(xué)會執(zhí)行委員及第17屆侯任主席，中華醫(yī)學(xué)會婦科腫瘤分會常委，中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會委員，中國抗癌協(xié)會婦科腫瘤專業(yè)委員會常委，北京醫(yī)學(xué)會婦科腫瘤分會主任委員，北京醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科分會副主任委員。主要致力于婦科腫瘤的臨床及實驗研究。1998年及2000年兩次獲得北京市科技進(jìn)步獎二等獎，2005年及2007年兩次獲得中華醫(yī)學(xué)科技獎，2006年獲得國家科技進(jìn)步獎二等獎。享受國務(wù)院政府特殊津貼。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表論文300余篇，其中SCI收錄40余篇。主編及參與編寫醫(yī)學(xué)著作10余部。

絨毛膜癌（choriocarcinoma，簡稱絨癌）是能通過化療治愈的首個婦科實體腫瘤，化療是其主要的治療方式。但是，仍有20%的患者化療后發(fā)生耐藥達(dá)不到治愈的效果?；熌退幨且粋€極為復(fù)雜的過程，包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。由于腫瘤細(xì)胞的遺傳性和生化特性的變化較為復(fù)雜，化療造成的最初損傷到癌細(xì)胞耐藥之間存在復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，是多基因、多信號通路和多系統(tǒng)共同參與的過程。不同的個體產(chǎn)生耐藥的機(jī)制不同，絨癌患者耐藥后再進(jìn)行個體化治療是最佳的治療模式。

子宮腫瘤；絨毛膜癌；化療；原發(fā)性耐藥；獲得性耐藥

絨毛膜癌（choriocarcinoma，簡稱絨癌）是一種發(fā)生于育齡婦女的滋養(yǎng)細(xì)胞惡性腫瘤，可發(fā)生于任何類型的妊娠，包括葡萄胎、自然流產(chǎn)和異位妊娠或足月妊娠后。在世界范圍內(nèi)絨癌的發(fā)生率差異明顯，亞洲（每120～200次妊娠中發(fā)生1例）和拉丁美洲絨癌的發(fā)生率明顯高于歐洲或北美洲（每2 000次妊娠中發(fā)生1例）。該腫瘤破壞性極強(qiáng)，早期可通過血運(yùn)轉(zhuǎn)移到全身。自甲氨喋呤（MTX）、更生霉素（KSM）等一系列有效的化療藥物應(yīng)用于該疾病治療之后，絨癌的治愈率可達(dá)80%～90%，使其成為能通過化療治愈的首個婦科實體腫瘤，也是人類最早得以治愈的實體腫瘤之一，因此，化療是其主要的治療方式。然而，仍有20%的患者發(fā)生耐藥達(dá)不到治愈的目的，化療耐藥成為絨癌治療失敗的主要原因之一［1］?；熌退幨且粋€極為復(fù)雜的過程，由化療造成的最初損傷到癌細(xì)胞耐藥之間存在復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，由多基因、多信號通路等參與。因此，目前關(guān)于絨癌的耐藥機(jī)制尚不明確。本文就絨癌耐藥的相關(guān)機(jī)制研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 絨癌耐藥的分類

絨癌對藥物的耐受性同其他腫瘤相似，可分為兩大類：原藥耐藥和多藥耐藥（multidrug resistance，MDR），原藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞只對某種特定結(jié)構(gòu)和功能的藥物產(chǎn)生耐藥，而對其他藥物不產(chǎn)生交叉耐藥，如5-氟尿嘧啶（5-FU）和抗代謝藥物等。絨癌患者發(fā)生的耐藥大多屬于此類，一般更換化療藥物或化療方案仍可獲得治愈效果。MDR是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后，對其他多種結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也有耐藥性。如生物堿類抗癌藥物（紫杉醇等）、鬼臼毒素類（Vp-16和VM-26）等都極易發(fā)生MDR。難治性、復(fù)發(fā)性絨癌患者發(fā)生的耐藥大多屬于此類。MDR又可分為原發(fā)性耐藥（primary resistance）和獲得性耐藥（acquired resistance），前者是指第一次化療時存在的腫瘤細(xì)胞耐藥；后者指腫瘤細(xì)胞與化療藥物反復(fù)作用后產(chǎn)生的對化療藥物的耐受性，其中以后者比較常見［2］。MDR產(chǎn)生的機(jī)制復(fù)雜，主要有以下幾個方面：藥理耐藥、生化耐藥、細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)耐藥等。

2 絨癌耐藥機(jī)制及相關(guān)蛋白的研究

2.1 藥理耐藥

由于機(jī)體對藥物的影響導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物有效濃度降低而形成的耐藥。臨床上，由于個體差異，患者常常發(fā)生不同程度的化療毒副反應(yīng)。由于化療毒副反應(yīng)較重而得不到及時、有效地處理，患者不能按時完成一個療程的化療，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物達(dá)不到治療的有效濃度而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。目前，隨著集落刺激因子的應(yīng)用，藥理耐藥現(xiàn)象逐漸減少。

2.2 生化耐藥

由于腫瘤細(xì)胞的遺傳性和生化特性發(fā)生復(fù)雜的變化，致使腫瘤細(xì)胞通過不同的機(jī)制對藥物產(chǎn)生耐藥。主要包括：細(xì)胞內(nèi)藥物外排及胞內(nèi)藥物重新分布、細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)啟動、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)以及藥物靶酶的水平改變或藥物與細(xì)胞內(nèi)酶親和力的改變導(dǎo)致耐藥。

2.2.1 細(xì)胞內(nèi)藥物外排及胞內(nèi)藥物重新分布導(dǎo)致耐藥 此過程涉及跨膜流出泵的活化如多藥耐藥基因（multi-drug resistance 1，MDR1）及其產(chǎn)物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multi-drug resistance related protein，MRP）和細(xì)胞內(nèi)藥物運(yùn)輸系統(tǒng)和藥物隔離的改變?nèi)绶文退幍鞍祝╨ung resistance protein，LRP）等。MDR1編碼ATP依賴性轉(zhuǎn)膜運(yùn)載體P-gp，P-gp具有能量依賴的跨膜藥物外輸泵功能，可將細(xì)胞內(nèi)底物包括多種抗腫瘤藥物泵出胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物集聚濃度下降而產(chǎn)生耐藥，從而呈現(xiàn)典型的MDR表型。幾乎所有人類腫瘤細(xì)胞中均有不同程度的MDR1/P-gp的表達(dá)，在化療不敏感或療效差的腫瘤中MDR1的表達(dá)異常增高［3，4］。但是，在某些具有MDR現(xiàn)象的腫瘤中，無法檢測到MDR1基因及其表達(dá)產(chǎn)物P-gp。這些非P-gp MDR細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在另一種膜糖蛋白，即MRP。MRP與P-gp一樣，具有藥物的膜外排泵作用，呈現(xiàn)非P-gp的MDR表型。體外研究證實多種耐藥腫瘤細(xì)胞株中均有MRP的表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)水平與腫瘤患者的臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［5］。MRP主要通過以下4種方式降低胞內(nèi)藥物濃度：①識別轉(zhuǎn)運(yùn)谷胱甘肽和細(xì)胞毒性藥物耦合底物，經(jīng)ATP參與，直接將藥物通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和胞吐的方式排出；②將藥物分布于亞細(xì)胞器間接影響藥物濃度；③改變離子通道活性，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH值改變，從而導(dǎo)致藥物外排；④使藥物活性成分脫離其作用部位而產(chǎn)生耐藥。MRP與依托泊甙、柔紅霉素、順鉑及米托蒽醌等耐藥相關(guān)［5］。LRP首次在MDR肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，可能通過3種機(jī)制引起MDR：①阻止以細(xì)胞核為靶點的藥物通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核；②使進(jìn)入細(xì)胞核的藥物在發(fā)生藥效前被泵出細(xì)胞核；③細(xì)胞質(zhì)中的藥物進(jìn)入囊泡，通過胞吐作用排出細(xì)胞外。Schuurhuis等［6］研究發(fā)現(xiàn)61株癌細(xì)胞中有78%的細(xì)胞株LRP為陽性，而且LRP陽性的細(xì)胞不僅對傳統(tǒng)抗腫瘤藥物（如阿霉素、長春新堿、絲裂霉素等）產(chǎn)生耐藥，對鉑類、烷化劑等也產(chǎn)生耐藥。Zhang等［7］發(fā)現(xiàn)JAR MDR細(xì)胞株（JAR/Vp-16）中存在P-gp介導(dǎo)的Vp-16耐藥，導(dǎo)入JWA基因（又稱ARL6IP5基因，ADP-ribosylationlike factor 6 interacting protein 5）可增加JAR絨癌細(xì)胞株對Vp-16的化療敏感性。

北京協(xié)和醫(yī)院根據(jù)絨癌耐藥患者常用的化療方案，分別采用間歇誘導(dǎo)和連續(xù)誘導(dǎo)的方法，建立了針對FUDR/5-FU/MTX/Vp-16/KSM耐藥的人絨癌JeG-3耐藥細(xì)胞株。應(yīng)用熒光定量PCR方法進(jìn)行化療藥物相應(yīng)靶酶和常見耐藥相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的檢測，結(jié)果在5-FU和Vp-16間歇誘導(dǎo)形成的耐藥細(xì)胞株中檢測到MDR1的表達(dá)，未檢測到MRP、LRP的表達(dá)，表明MDR1參與了5-FU和Vp-16誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的過程［8］。馮鳳芝等［9］利用人腫瘤壞死因子-alpha（hTNF-α）基因?qū)隞eG-3/Vp-16耐藥細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)hTNF-α通過調(diào)節(jié)MDR1和P-gp蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)絨癌細(xì)胞耐藥。崔竹梅等［10］將白細(xì)胞介素-2（IL-2）轉(zhuǎn)染到JeG-3/Vp-16耐藥株中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-2后，耐藥細(xì)胞中MDR1 mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)陰，藥物敏感性增強(qiáng)，但同時檢測的MRP、LRP的表達(dá)則無明顯改變。以上研究表明MDR1在Vp-16誘導(dǎo)的絨癌耐藥中發(fā)揮重要作用，IL-2、hTNF-α能夠逆轉(zhuǎn)MDR1表達(dá)增高的絨癌耐藥細(xì)胞株對Vp-16的耐藥性。在FUDR間斷誘導(dǎo)及5-FU連續(xù)誘導(dǎo)過程中，發(fā)現(xiàn)LRP基因的表達(dá)與絨癌耐藥呈正相關(guān)。但是，在MTX連續(xù)和KSM間接誘導(dǎo)過程中，不同藥物濃度誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株MDR1基因的表達(dá)與親本細(xì)胞比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示MDR1不參與MTX和KSM誘導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生過程。因此，MDR1、LRP和P-gp蛋白可以作為絨癌耐藥的靶標(biāo)。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)的解毒系統(tǒng)啟動導(dǎo)致耐藥 細(xì)胞內(nèi)的解毒系統(tǒng)包括P450家族、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S transferase，GST）等，它能將外來毒素及中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化而解毒，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞毒藥物失活而引起耐藥［11］。GSTπ即酸性GST，是腫瘤細(xì)胞和組織中最常見的同工酶，在許多耐藥細(xì)胞特別是MDR表型的細(xì)胞中高表達(dá)。GST通過催化GSH與親電物質(zhì)結(jié)合，減少藥物代謝產(chǎn)生的活性氧對膜脂質(zhì)損傷；同時GST通過清除細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物，防止藥物與靶細(xì)胞DNA結(jié)合等機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞MDR的形成。北京協(xié)和醫(yī)院對常見耐藥相關(guān)基因在各個耐藥細(xì)胞系建立過程中的動態(tài)表達(dá)譜進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)GSTπ基因的表達(dá)與5-FU間接誘導(dǎo)和連續(xù)誘導(dǎo)、KSM間接誘導(dǎo)的JeG-3細(xì)胞耐藥的過程中，與細(xì)胞耐藥性之間呈明顯的正相關(guān)。表明GSTπ可能參與了絨癌耐藥的形成。

2.2.3 通過藥物靶酶的水平改變或藥物與細(xì)胞內(nèi)酶親和力的改變而導(dǎo)致耐藥 這些藥物靶酶包括TopoⅡ、二氫葉酸還原酶和微管蛋白等。最常見的是TopoⅡ介導(dǎo)的非經(jīng)典的多藥耐藥機(jī)制。由于TopoⅡ的活性降低，使通過TopoⅡ介導(dǎo)的抗腫瘤作用亦降低；另外，DNA TopoⅡ羥基磷酸化使藥物、酶和DNA之間的作用關(guān)系受到干擾繼而產(chǎn)生耐藥。TopoⅡ介導(dǎo)的耐藥譜包括阿霉素、長春新堿、Vp-16及羥基喜樹堿等［12］。北京協(xié)和醫(yī)院在對FUDR/5-FU/MTX/Vp-16/KSM各個耐藥細(xì)胞系建立過程中TopoⅡα的動態(tài)表達(dá)譜進(jìn)行探討，未發(fā)現(xiàn)TopoⅡα的表達(dá)差異［13，14］。因此，藥物靶酶水平的變化是否參與絨癌耐藥尚需大量的實驗研究進(jìn)一步探討。

2.2.4 DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng) 許多化療藥物能靶向引起DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂從而殺傷腫瘤細(xì)胞，但是腫瘤細(xì)胞內(nèi)同時存在DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)。DNA損傷修復(fù)過程包括錯配修復(fù)（MMR）、核苷酸切除修復(fù)（NER）和堿基切除修復(fù)（BRE）等。其中NER只對烷化劑和鉑類等作用于DNA分子的化療藥物耐藥，MMR參與氟嘧啶、鉑類化合物的耐藥。鉑類藥物在絨癌治療中有重要作用，因此，DNA損傷修復(fù)的機(jī)制在絨癌耐藥中可能有一定的作用。北京協(xié)和醫(yī)院應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)比較親本絨癌細(xì)胞株JeG-3與耐藥細(xì)胞株JeG-3/FUDRA1蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶HSPA5/PDIA3/CRT在不同藥物和不同方式誘導(dǎo)的耐藥株中的表達(dá)上調(diào)。采用RNA干擾技術(shù)驗證了沉默HSPA5/PDIA3/CRT能增加化療敏感性。利用免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)CRT在細(xì)胞內(nèi)定位轉(zhuǎn)變，提示耐藥絨癌細(xì)胞可以通過提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理，由化療藥物誘發(fā)的錯誤折疊蛋白增強(qiáng)損傷修復(fù)能力而獲得耐藥表型［15］。因此，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白在絨癌耐藥的發(fā)生中有一定的作用。

3 細(xì)胞凋亡相關(guān)的耐藥

細(xì)胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制。促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因的過度表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少而產(chǎn)生化療耐藥。促凋亡基因/蛋白如p53、Fas、TRAIL和bax等表達(dá)減少、抗凋亡基因/蛋白如p63、bcl-2等表達(dá)過度，都能導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的發(fā)生。北京協(xié)和醫(yī)院應(yīng)用免疫組化法測定轉(zhuǎn)導(dǎo)TNF-α基因的絨癌耐藥（JeG-3/Vp-16）移植瘤中bcl-2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯減低，表明TNF-α通過增加細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性［16］。同時發(fā)現(xiàn)JeG-3/Vp-16耐藥細(xì)胞中p53上調(diào)，凋亡調(diào)控因子（PUMA）的表達(dá)下調(diào)，腺病毒攜帶的PUMA感染JeG-3/Vp-16耐藥細(xì)胞能增加對5-FU和Vp-16的敏感性［17］。劉曉霞等［18］發(fā)現(xiàn)4，5，7-三羥異黃酮（genistein）通過誘導(dǎo)絨癌耐藥細(xì)胞株JAR/MTX的凋亡而有效地抑制耐藥細(xì)胞的增殖，并且呈劑量依賴性抑制。以上研究表明，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因/蛋白參與了絨癌耐藥的形成。

4 自噬與化療耐藥

自噬（autophagy）是一種高度保守、普遍存在于真核生物中的現(xiàn)象，是細(xì)胞對外源性刺激的適應(yīng)性反應(yīng)。自噬在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮“雙刃劍”的作用［19］，一方面自噬作為細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的機(jī)制使腫瘤能夠?qū)垢鞣N理化威脅因素而逃逸死亡；另一方面過度依賴會引起腫瘤細(xì)胞的caspase非依賴型程序性細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)許多抗腫瘤治療均能誘導(dǎo)自噬，且自噬與伊馬替尼、曲妥株單抗、5-FU和依托泊苷等產(chǎn)生的耐藥有關(guān)。通過自噬抑制子如3-MA、CQ和baflomycin A，或通過shRNA沉默抑制自噬的相關(guān)分子，抑制自噬相關(guān)的信號通路如PI3K/AKT/mTOR通路，能提高耐藥細(xì)胞對化療或放療的敏感性［20］。北京協(xié)和醫(yī)院在觀察FUDR/MTX耐藥株的超微結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)自噬小體較敏感株細(xì)胞明顯增加；與凋亡相關(guān)的caspase家族中caspase 4的表達(dá)下調(diào)；以Western blot法檢測LC3-Ⅱ（自噬標(biāo)志物）在耐藥株中的表達(dá)高于敏感株，應(yīng)用自噬抑制劑baflomycin A抑制自噬，逆轉(zhuǎn)了MTX的耐藥（待發(fā)表）。以上研究提示自噬可能參與絨癌耐藥形成的過程。因此，靶向干預(yù)自噬可能是逆轉(zhuǎn)絨癌耐藥的新方法。

5 總結(jié)與展望

滋養(yǎng)細(xì)胞惡性腫瘤的化療耐藥是一個極為復(fù)雜的過程，由化療造成的最初損傷到最終的癌細(xì)胞耐藥之間存在多基因、多信號通路構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控體系，具有多因素、多途徑和多層次的特點。不同個體產(chǎn)生的耐藥機(jī)制不同。因此，在不斷探索滋養(yǎng)細(xì)胞惡性腫瘤耐藥機(jī)制的同時，基于患者耐藥特點的個體化治療是治療耐藥患者的最佳選擇。

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［2013-12-15收稿］［2014-02-25修回］［編輯 阮萃才］

R737.33

A

1674-5671（2014）02-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.02

國家自然科學(xué)基金資助項目（81272890）【通信作者】向 陽。E-mail：xiangy@pumch.cn