劉宏+郭巧生+史紅專+王嘉+李燕嫻

[摘要] 利用石蠟切片、HE及AB-PAS染色法研究不同月齡螞蟥口器組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示1～3月齡口徑與口寬增加幅度較小，分別為0.6，0.3 mm；3～4月齡增幅最大，為1.2 mm；4～6月齡口徑、口寬達(dá)到最大值，基本不再增加?？诖轿挥诳诓孔钋岸说耐饩?，外被薄的保護(hù)膜，隨著生長口膜上皮細(xì)胞由立方上皮細(xì)胞到柱狀細(xì)胞再到長柱狀細(xì)胞?？谇簧钐幑灿?個顎，較大1個居背面，另外2個較小的分居左右腹側(cè)，與肌肉質(zhì)的咽相連，顎從外到內(nèi)由角質(zhì)層、上皮細(xì)胞層、肌層、顎腔組成，顎上均存在具有分泌酸性顆粒的乳突，從2月齡開始存在大量酸性顆粒狀物質(zhì)；口腔由內(nèi)向外由黏膜層、黏膜下層、肌層組成，周圍有著豐富的圍口神經(jīng)。咽由內(nèi)向外由黏膜層、肌層、漿膜層構(gòu)成，黏膜褶皺隨生長增高增厚，黏膜上皮由復(fù)扁平上皮變?yōu)橹鶢钌掀?，肌層發(fā)達(dá)且隨著生長逐漸增厚，4月齡厚度最大。螞蟥黏液細(xì)胞主要由管狀、梨狀2種形態(tài)4種著色類型構(gòu)成，不同時期AB-PAS染色變化不大，口唇1月齡黏液細(xì)胞少，2，3月齡黏液細(xì)胞增多且主要為Ⅱ型黏液細(xì)胞，口腔中含有較多Ⅰ型黏液腺細(xì)胞，咽部肌層下的結(jié)締組織層分布著較少的Ⅱ型黏液細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞] 螞蟥；口器；組織學(xué)；組織化學(xué)

螞蟥Whitmania pigra Whitman，又稱寬體金線蛭，在分類上隸屬于環(huán)節(jié)動物門Annelida蛭綱Hirudinea無吻蛭目Arhynchobdellida黃蛭科Haemopidae^[1]，該種為《中國藥典》（2010年版）藥材水蛭的基原動物之一^[2]，也是我國水蛭藥材市場的主流品種。近年來隨著水蛭藥材的短缺和藥品價格的不斷攀升，螞蟥人工養(yǎng)殖日趨受到重視、取得初步成功并進(jìn)行了一定規(guī)模的推廣，但由于螞蟥目前還沒有專屬配合飼料，極大程度地限制了螞蟥的規(guī)?；l(fā)展。

螞蟥口器與其食性及食物規(guī)格關(guān)系密切，但目前對螞蟥的研究多側(cè)重在藥理和生理方面^[3-9]，有關(guān)螞蟥口器的基礎(chǔ)研究還未見報道。本研究擬針對不同月齡螞蟥口器的組織和組織化學(xué)進(jìn)行研究，在補(bǔ)充和完善螞蟥生物學(xué)資料的基礎(chǔ)上，為螞蟥人工飼料的研究和生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料

螞蟥卵繭采自江蘇寶應(yīng)水蛭養(yǎng)殖基地，并經(jīng)郭巧生教授鑒定為黃蛭科動物螞蟥W. pigra的卵繭。螞蟥自6月份孵化出繭后每個月末取樣1次，直至11月份收獲為止，每階段取樣10條。6月份記做1月齡，7月份記做2月齡，以此類推。

2 方法

將采集的螞蟥放在10%乙醇中10 min，待其昏迷并舒展身體后，分別測量其口徑、口寬，取其口器用Bouin氏液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度 5 μm），伊紅-蘇木精（HE）染色，AB-PAS法染色，中性樹膠封片。觀察螞蟥口器發(fā)育情況，OLYMPUS BX-51顯微鏡觀察并拍照。

3 結(jié)果與分析

3.1 口徑變化

從螞蟥口徑、口寬變化趨勢圖中可以看出，1月齡口徑、口寬分別為（0.43±0.01），（0.24±0.04）mm。2月齡口徑、口寬分別為（0.59±0.01），（0.35±0.03） mm。3月齡口徑、口寬分別為（1.03±0.01），（0.55±0.02） mm。4月齡口徑、口寬分別為（2.24±0.23），（1.79±0.09） mm。5月齡口徑、口寬分別為（2.42±0.14），（1.83±0.24） mm。6月齡口徑、口寬分別為（2.48±0.25），（1.91±0.08） mm。1～3月齡口徑與口寬增加幅度較小，3～4月齡增幅最大，4～6月齡口徑、口寬達(dá)到最大值，基本不再增加（圖1）。

3.2 口咽部黏液細(xì)胞類型

根據(jù)AB-PAS黏液細(xì)胞染色結(jié)果，將螞蟥口部

根據(jù)螞蟥黏液細(xì)胞的形狀將黏液細(xì)胞分為梨形黏液細(xì)胞和管狀黏液細(xì)胞。所有的蛭類都有梨形腺^[1]，螞蟥中的梨形腺細(xì)胞較大，由表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而成，分布于表皮細(xì)胞下層，體積較大，球形或梨形，細(xì)胞基部有細(xì)胞核等細(xì)胞器，其分泌顆粒含有酸性粘多糖。管狀腺細(xì)胞深入到肌肉層，其下端為一圓形較小的基部，上端有一特長的長管，通過表皮細(xì)胞之間開口于體表（圖2）。

3.3 不同月齡螞蟥口器組織學(xué)及組織化學(xué)

3.3.1 口唇部 口唇位于口部最前端的外緣，外被保護(hù)膜，口的周圍有口膜。1月齡口唇部保護(hù)膜不明顯，口膜上皮細(xì)胞排列緊密，為立方上皮細(xì)胞，細(xì)胞核位于細(xì)胞基底部，上皮組織下層為疏松結(jié)締組織（圖3-1）。2月齡保護(hù)膜清晰呈紫紅色，口膜上皮細(xì)胞變?yōu)橹鶢罴?xì)胞，上皮細(xì)胞下分泌細(xì)胞緊密排列（圖3-2）。3月齡上皮細(xì)胞變?yōu)殚L柱狀細(xì)胞，結(jié)締組織增厚（圖3-3）。4，5，6月齡口唇組織結(jié)構(gòu)變化不大（圖3-4，3-5，3-6）。

1月齡口唇黏液細(xì)胞較少，僅零星分布在疏松結(jié)締組織層，呈藍(lán)色（Ⅱ型黏液細(xì)胞）（圖3-7）。2月齡口唇黏液細(xì)胞增多，上皮層、結(jié)締組織層均有分布，主要以Ⅱ，Ⅳ型黏液細(xì)胞為主，有少量的Ⅲ型黏液細(xì)胞分布，黏液細(xì)胞呈球狀、管狀等（圖3-8）。3月齡口唇上皮及結(jié)締組織層分布有大量黏液細(xì)胞，以Ⅱ型為主，主要為小型管狀細(xì)胞（圖3-9）。

3.3.2 顎 顎是螞蟥消化管前端重要取食器官之一，顎位于口腔深處，共有3個，較大1個居背面，另外2個較小的左右各分居腹側(cè)，與肌肉質(zhì)的咽相連，顎從外到內(nèi)由角質(zhì)層、上皮細(xì)胞層、肌層、顎腔組成，肌層圍成顎腔。顎頂上存在具分泌作用的錐形乳突（圖4-1）。

在螞蟥生長發(fā)育過程中顎部組織結(jié)構(gòu)變化不大。在2月齡時，顎上出現(xiàn)酸性顆粒狀物，經(jīng)AB-PAS染色呈現(xiàn)較多且較小的紅色顆粒狀物，此后一直存在且逐漸增多（圖4-2，4-3，4-4）。

3.3.3 口腔 口腔由內(nèi)向外依次為黏膜層、黏膜下層、肌層組成，在口腔的周圍有著豐富的圍口神經(jīng)。1月齡黏膜褶微小，黏膜上皮為復(fù)扁平上皮，黏膜層結(jié)締組織增厚，黏膜下層出現(xiàn)少量空泡狀分泌細(xì)胞，無漿膜層（圖5-1）。2月齡從口腔往咽部方向，復(fù)扁平上皮細(xì)胞層數(shù)逐漸增多，黏膜褶增高（圖5-2）。3月齡口腔面積明顯增大，黏膜層出現(xiàn)次級皺襞，肌層明顯，約2～3層環(huán)?。▓D5-3）。4月齡口腔黏膜褶皺明顯增高且次級皺襞發(fā)達(dá)，結(jié)締組織增厚（圖5-4）。4，5，6月齡口腔組織結(jié)構(gòu)變化不大（圖5-5，5-6）。endprint

口腔上皮外有保護(hù)膜，經(jīng)AB-PAS染色后，呈紅色，未見有明顯著色的黏液細(xì)胞分布，1月齡時口腔中有少量的Ⅰ型黏液腺細(xì)胞，呈管狀，開口于口腔（圖5-7）。2月齡時口腔內(nèi)黏液腺細(xì)胞增多且增大，黏膜層存在未被染色的分泌細(xì)胞，口腔腔面被染成紅色（圖5-8）。3月齡后AB-PAS染色與2月齡相比無明顯變化（圖5-9）。

3.3.4 咽部 咽部從內(nèi)向外由黏膜層、肌層、漿膜層構(gòu)成。咽部肌層發(fā)達(dá)，有5～10個指狀突起。1月齡咽部指狀突起較平滑，黏膜層為復(fù)扁平上皮，肌層為5～8層環(huán)形肌，中間夾雜著10余條縱行肌，肌層厚約為（147.53±15.19） μm（圖6-1）。2月齡黏膜褶變寬，黏膜層出現(xiàn)少量的空泡狀分泌細(xì)胞，肌層厚約（162.74±16.69） μm（圖6-2）。3月齡黏膜褶開始出現(xiàn)次級皺襞，黏膜上皮為扁平上皮，固有層清晰可見，肌層厚約為（191.76±28.30） μm，出現(xiàn)漿膜層（圖6-3）。4月齡黏膜層高且肌層異常增厚，次級皺襞發(fā)達(dá)，黏膜上皮為單層柱狀上皮，紋狀緣發(fā)達(dá)，肌層厚約（210.56±28.57） μm（圖6-4）。4，5，6月齡螞蟥咽部組織結(jié)構(gòu)變化不大（圖6-4，6-5，6-6）。

咽部經(jīng)AB-PAS染色后，上皮組織呈現(xiàn)含有中性粘多糖的紅色。1月齡黏膜層中未見明顯著色的黏液細(xì)胞分布，肌層下的結(jié)締組織層中零星分布著Ⅱ型球狀或囊狀黏液細(xì)胞（圖6-7）。2月齡時結(jié)締組織層中出現(xiàn)少量Ⅳ型黏液細(xì)胞（圖6-8）。3月齡咽部組織化學(xué)染色結(jié)果與2月齡無明顯差異（圖6-9）。

4 討論

4.1 螞蟥口器結(jié)構(gòu)與攝食的關(guān)系

口器是螞蟥從外界攝取營養(yǎng)物質(zhì)的重要通道，螞蟥的口器包括口唇部、口腔、顎、咽等組成。螞蟥通過顎、咽以及口部的分泌細(xì)胞共同作用完成攝食過程。

絕大部分動物取食的方式?jīng)Q定于其特殊的口器結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)現(xiàn)蟬和蚊子等利用一部分特化成細(xì)長口針的上顎和下顎進(jìn)行取食^[10]，蝴蝶等利用由左、右下顎中發(fā)達(dá)的外顎葉嵌合而成的喙吸食花中蜜汁^[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明螞蟥的顎是咽前緣肌肉特化的結(jié)構(gòu)，其咽部肌肉異常發(fā)達(dá)，當(dāng)螞蟥取食時，通過咽部環(huán)肌橫向擴(kuò)張、縱肌縱向擴(kuò)張，拉動顎不斷運(yùn)動，將食物研碎，然后通過咽的擴(kuò)張和收縮將食物運(yùn)送到更細(xì)的食管中。

圍口神經(jīng)是重要的化學(xué)感受器，在螞蟥攝取食物過程中起了很大的作用。蛭類覓食時通常利用頭部和其他部位的體節(jié)感受器來感受水的波動^[12-13]，來判斷食物的位置，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示螞蟥口腔部有著豐富的圍口神經(jīng)，當(dāng)其攝取食物后一般利用口咽腔特殊的感受器對食物進(jìn)行最后的判別。

4.2 螞蟥口徑與食物規(guī)格的關(guān)系

研究表明動物適口食物規(guī)格與口徑密切相關(guān)，同時從食物規(guī)格與口徑的關(guān)系可以推測其食性。劉煥亮等對白鯽^[14]、代田昭彥曾對鮭、鰻^[15]、吳慶龍對加州鱸魚^[16]不同生長階段取食規(guī)格和食性的研究表明，食物大小接近口寬或略小于口寬時，都是魚食性魚類；遠(yuǎn)小于口寬時，是浮游生物食性魚類；和口寬相重疊時，是肉食性和雜食性魚類。通過長期飼養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)螞蟥主要以螺螄為食。螞蟥主要取食螺螄的內(nèi)臟囊，這可能是由于螺螄的內(nèi)臟囊的大小與螞蟥口徑大小相似便于取食。通過解剖發(fā)現(xiàn)，螞蟥除了攝食螺螄外還在其消化管內(nèi)發(fā)現(xiàn)類似藻類的殘留物，螞蟥生活的水體中存在著大量的浮游生物和底棲生物，初步判斷螞蟥為雜食性動物，除了以螺類主食外，也可能取食一些浮游生物等。

4.3 螞蟥黏液細(xì)胞在進(jìn)食中的作用

黏液細(xì)胞能分泌黏液，黏液中含有黏多糖、糖蛋白及各種水解性酶類等成分^[17]，它是普遍存在于水生動物上皮中的一種腺體細(xì)胞，具有許多生理功能^[18]。蛭類體表分泌的黏液可以起到防止機(jī)械損傷、保持濕潤、維持滲透壓、抑菌和殺菌作用，能抵抗病原微生物的入侵^[19]。

本研究結(jié)果表明，螞蟥口部黏液細(xì)胞的類型和分布與各部分的結(jié)構(gòu)與功能也有著密切的關(guān)系。螞蟥在自然界主要以螺類為食^[2]，其攝食時可能會帶進(jìn)病原微生物，而黏液細(xì)胞分泌的水解酶等溶菌抗菌物質(zhì)可能在防止病原生物從消化道進(jìn)入體內(nèi)方面發(fā)揮重要作用?？谀ぢ懵对隗w外，直接與河水接觸，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)螞蟥口唇中黏液細(xì)胞類型較多且數(shù)量大，可能與其具有防止河水沖擊以及河水中病原生物進(jìn)入的功能有關(guān)。顎主要功能是通過咽部肌層的收縮將食物吞進(jìn)消化管，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)口腔上皮中夾雜分布著數(shù)量較多的Ⅰ型黏液細(xì)胞，其分泌的中性黏液通過導(dǎo)管輸送到口腔，可能起到浸潤和軟化食物，便于食物運(yùn)輸?shù)淖饔谩?/p>

此外有研究表明口咽黏液細(xì)胞分泌的黏液，可粘著水中的浮游生物^[20-21]，螞蟥口部的黏液細(xì)胞分泌的黏液是否可以粘著水體中的浮游生物還有待于今后進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]楊潼. 中國動物志·環(huán)節(jié)動物門蛭綱[M]. 北京：科學(xué)出版社，1996：136.

[2]中國藥典. 一部[S]. 2010：77.

[3]史紅專，劉飛，郭巧生. 溫度對螞蟥生長及攝食規(guī)律影響的初步研究[J]. 中國中藥雜志，2006，31（23）：1944.

[4]宋大祥，馮鐘琪. 螞蟥[M]. 北京：科學(xué)出版社，1978：12.

[5]Jin W J，Zhang R J. Pressure sensation by an anterior pagoda neuron population distributed in multiple ganglia in the leech，Whitmania pigra [J]. J Comp Physiol A，2002，188（3）：165.endprint

[6]Shen D W，Lu Q W，Wang L. Ultrastructure of electrical synapses between nociceptive and anterior pagoda neurons in the CNS of the leech （Whitmania pigra） [J]. Invert Neurosci，2002，4（4）：193.

[7]史紅專，劉飛，郭巧生. 寬體金線蛭耗氧率與窒息點(diǎn)的初步研究[J]. 中國中藥雜志，2005，30（23）：1817.

[8]劉麗芳，曾群，金蓉鶯，等. 中藥水蛭各部位提取物對高分子葡聚糖所致大鼠血瘀模型的影響[J]. 中成藥，2003，25（7）：5891.

[9]譚毓治，徐彭，張孝友，等. 去頭水蛭醇提物抗血栓作用的研究[J]. 中國中藥雜志，1999，24（10）：6221.

[10]鄭樂怡，歸鴻. 昆蟲分類[M]. 南京：南京師范大學(xué)出版社，1999.

[11]顏忠誠. 昆蟲的口器[J]. 生物學(xué)通報，2005，40（9）：7.

[12]S E Blackshaw. Morphology and distribution of touch cell terminals in the skin of the leech[J]. J Physiol，1981，320：219.

[13]S E Blackshaw，J G Nicholls，I Parnas. Physiological responses，receptive fields and terminal arborizations of nociceptive cells in the leech[J]. J Physiol，1982，326：251.

[14]劉煥亮，張秀梅，楊云龍，等. 白鯽攝食器官胚后發(fā)育生物學(xué)研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，1993，17（1）：40.

[15]代田昭彥. 水產(chǎn)餌料生物學(xué)[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1985：165.

[16]吳慶龍，鄭柏年. 加州鱸魚仔幼魚口器結(jié)構(gòu)與食性的研究[J]. 生態(tài)學(xué)報，1993，13（3）：283.

[17]Harris J E，Watson A，Hunt S. Histochemical analysis of mucous cells in the epidermis of brown trout Salmo trutta [J]. J Fish Biol，1973，5：345.

[18]Shan K K，Agarwal S K. Histochemistry of adhesive dise epidermis of a hill stream fish，Garra gotyla [J]. J Anim Morphol ，1991，38（1/2）：9.

[19]劉飛，史紅專，郭巧生，等. 螞蟥內(nèi)臟器官和皮膚的組織結(jié)構(gòu)觀察[J]. 中國中藥雜志，2006，31（22）：1849.

[20]Northcott M E，Beveridge M C. The development and structure of pharyngeal apparatus associated with filter feeding in tilapias（Oreochromis niloticus）[J]. J Zool，1988，215：133.

[21]Berg C，Boogaart J，Sibbing F，et al. Implications of gill arch movements for filter feeding：an X-ray cinematographical study of filter-feeding white bream（Blicca bjoerkna） and common bream（Abramis brama）[J]. J Exp Biol，1994，191：257.

Histological and histochemical studies on mouthpart of

Whitmania pigra at different months age

LIU Hong，GUO Qiao-sheng，SHI Hong-zhuan*，WANG Jia，LI Yan-xian

（Institute of Chinese Medicinal Materials，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

[Abstract] Mouthpart developmental histology of Whitmania pigra at different month of age were studied by paraffin section，HE staining combined alcian blue and periodic acid schifts reaction procedure （AB-PAS）. The following results was obtained： Change ranges： oral width 0.6 mm （1-3 month），1.2 mm （3-4 month）； oral diameter 0.3 mm （1-3 month）； 1.2 mm （3-4 month），the oral size reached maximum during 4-6 months and unchanged thereafter. Oral lip had a thin protective film located in the front of the mouthpart. The W. pigra possessed three jaws in oral cavity，the big one was in dorsum，the other two separated on both side of abdomen respectively. Jaws and muscular pharynx were interrelated closely. The jaws were composed by cuticle，epithelial layer，muscularis and jaw cavity from outside to inside. In the front of jaws had mastoid abdomen with function of secreting acidophilic granule from 2 month age. Oral cavity was composed by mucosa，submucosa and muscularis inside and outside. Oral cavity was rich of peristomial nerves. And pharynx was composed of mucosa，muscularis，adventitia from inside to outside. The folds height and width become heighten and thicken. Mucosa epithelium from complex flat epithelium changed into columnar epithelium，muscularis gradually developed into thickened along with growing. Muscular thickness reached maximum at 4 months. Mucous cells of W. pigra were classified into Ⅰ-Ⅳ types based on different staining and two mainly morphological shapes （Tubular，Pear-shaped）. Jaws，oral cavity，pharynx by AB-PAS staining showed little changes at different month of age. Mucous cells were few at 1 month age，and type Ⅱ cells were increased rapidly in 2-3 month age in oral lip. Oral cavity contains more mucous gland cells type Ⅰ. Under the muscularis there were connective tissues which distributed a few of mucous cells type Ⅱ.

[Key words]Whitmania pigra；mouthpart；histology；histochemistry

doi：10.4268/cjcmm20141221endprint