拉 宗,王建霞,崔 倪,李明月,邢樹剛,任 博,張麗紅,李 偉,李玉林

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院病理學系病理生物學教育部重點實驗室,吉林長春 130021;2.西藏大學醫(yī)學院病理學教研室,西藏拉薩 850000)

乳腺浸潤性導管癌微環(huán)境中CD4和CD8陽性T細胞表達與血管新生的關聯(lián)性分析

拉 宗1,2,王建霞1,崔 倪?,李明月1,邢樹剛1,任 博1,張麗紅1,李 偉1,李玉林1

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院病理學系病理生物學教育部重點實驗室,吉林長春 130021;2.西藏大學醫(yī)學院病理學教研室,西藏拉薩 850000)

目的:檢測乳腺浸潤性導管癌微環(huán)境中CD4及CD8陽性T淋巴細胞的表達,探討其與乳腺癌間質微血管密度(MVD)的關系。方法:應用免疫組織化學SP法檢測37例乳腺浸潤性導管癌組織及10例癌旁組織中CD4、CD8及CD34的表達,并對其在癌及癌旁組織中的表達差異進行分析。采用Spearman相關性分析方法分析CD4、CD8及CD4與CD8陽性表達率的比值(CD4/CD8比值)與MVD的相關性。結果:CD4在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性表達率為(22.63±11.53)%,低于癌旁組織[(34.09±10.41)%](P＜0.05),隨著乳腺癌組織學級別的升高,CD4陽性表達率逐漸降低(P＜0.05)。CD8在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性表達率為(14.27± 9.03)%,高于癌旁組織[(10.51±1.88)%],但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),隨著乳腺癌組織學級別的升高, CD8陽性表達率逐漸升高(P＜0.01)。在癌旁組織及乳腺浸潤性導管癌組織中CD4/CD8比值分別為3.24±1.02 和2.16±2.17,兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);隨著乳腺癌組織學級別的升高CD4/CD8比值降低(P＜0.01)。乳腺浸潤性導管癌組織中的MVD值明顯高于癌旁組織(P＜0.05),并且隨乳腺癌組織學級別的升高, MVD值呈遞增趨勢。相關性分析,MVD與CD4陽性表達率呈負相關關系(r＝－1.000,P＜0.001),與CD8陽性表達率呈正相關關系(r＝0.984,P＜0.001),與CD4/CD8比值呈負相關關系(r＝－0.984,P＜0.001)。結論:乳腺浸潤性導管癌間質CD4陽性T淋巴細胞減少,CD8陽性T淋巴細胞增多,CD4/CD8比值下降,提示在乳腺癌微環(huán)境中T細胞處于免疫抑制狀態(tài)。

乳腺腫瘤;T淋巴細胞;腫瘤血管新生;CD4;CD8

腫瘤微環(huán)境由腫瘤實質和間質兩部分構成,腫瘤間質包括免疫細胞、炎癥細胞、成纖維細胞和微血管等。腫瘤微環(huán)境中的組成成分在腫瘤的生長、浸潤和轉移等破壞機體正常組織過程中起著不可忽視的作用[1]。腫瘤從發(fā)生到轉移的整個過程是腫瘤細胞與間質相互作用的結果。微環(huán)境中的免疫狀態(tài)尤其是細胞介導的免疫反應能直接反應機體局部對腫瘤的反應狀況[2-3]。有文獻[4]報道:一些惡性腫瘤微環(huán)境中免疫細胞及其分泌的相關因子參與腫瘤生長侵襲的調節(jié),惡性腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞與腫瘤間質血管新生也存在相互作用關系。綜合分析腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞以及腫瘤間質新生血管之間相互作用的研究尚未見文獻報道。本實驗應用人乳腺癌組織標本,通過免疫組織化學方法檢測乳腺癌組織微環(huán)境中免疫細胞的類型及數(shù)量,并分析其與腫瘤血管新生之間的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集吉林大學第一醫(yī)院2010年9月—2011年11月行外科手術且經臨床病理醫(yī)生確診的乳腺浸潤性導管癌組織標本37例,其中Ⅰ級8例、Ⅱ級25例、Ⅲ級4例。37例標本均包括癌組織以及癌旁組織,取材時,癌旁組織為距癌結節(jié)2 cm以內的帶乳腺腺體的正常組織,且避開壞死區(qū)。所有研究對象術前均未接受任何治療,均無糖尿病、類風濕和甲狀腺功能亢進等自身免疫性疾病史及免疫治療史,年齡35～70歲,平均年齡48歲。所采集的標本均經患者知情同意且經吉林大學第一醫(yī)院倫理委員會的同意。

1.2 免疫組織化學染色采用免疫組織化學染色SP法,CD4多克隆抗體購自美國Bioworld技術公司,CD8單克隆抗體購自美國Epitomics公司, CD34單克隆抗體購自北京中山技術公司,SP免疫組織化學試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術有限公司。石蠟切片脫蠟至水化,用枸櫞酸鹽修復液進行抗原修復,冷卻至室溫后水洗,CD4抗體1∶200倍稀釋,CD8抗體1∶800倍稀釋, CD34抗體為即用型,4℃孵育過夜,其他實驗步驟按SP試劑盒說明書進行。以已知陽性組織作為陽性對照,以PBS為一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定標準CD4及CD8陽性表達顆粒定位于淋巴細胞膜,結果判斷標準參照文獻[5],淋巴細胞膜中出現(xiàn)棕黃色為陽性表達,對陽性細胞所占百分率進行評分:1分為≤10%,2分為11%～30%,3分為31%～50%,4分為＞50%;＜3分為陰性,≥3分為陽性。

MVD結果的判定:以CD34表達陽性作為微血管的標志,CD34陽性染色顆粒定位于血管內皮細胞胞膜和胞漿中。內皮細胞形成條狀或隙狀等孤立或簇狀結構,棕染。按Weinder法并稍加改進, 在100倍顯微鏡下,確定5個觀察微血管的密集區(qū),然后在200倍顯微鏡下計數(shù)每個密度區(qū)中1個視野的微血管數(shù)量,無論有無管腔,凡是單個孤立內皮細胞或多個內皮細胞緊密排列計數(shù)為1個微血管,凡是管腔的面積大于8個紅細胞的直徑并帶有較厚肌層的微血管均不計數(shù)在內。以5個視野區(qū)域微血管數(shù)的均值表示腫瘤的MVD。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。CD4及CD8陽性表達率、CD4與CD8陽性表達率的比值(CD4/CD8比值)和MVD以±s表示,組間比較采用t檢驗;CD4陽性表達率、CD8陽性表達率和CD4/CD8比值與乳腺癌間質MVD的相關性分析采用Spearman等級相關檢驗。

2 結果

2.1 CD4及CD8在乳腺浸潤性導管癌和癌旁組織淋巴細胞中的表達CD4及CD8均表達于腫瘤間質T淋巴細胞的胞膜上,并且呈現(xiàn)在腫瘤間質微血管周圍分布較集中的特點。見圖1和2(插頁五和六)。

CD4在乳腺浸潤性導管癌間質淋巴細胞中陽性表達率為(22.63±11.53)%,與癌旁組織陽性表達率[(34.09±10.41)%]比較明顯降低(P＜0.05);并且隨著乳腺癌組織學級別的升高,CD4陽性表達率逐漸降低(P＜0.05)。CD8在乳腺浸潤性導管癌間質淋巴細胞中陽性表達率為(14.27± 9.03)%,與癌旁組織陽性表達率[(10.51± 1.88)%]比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);隨著乳腺癌組織學級別的升高,CD8陽性表達率逐漸升高(P＜0.01)。在癌旁組織及浸潤性導管癌中CD4/CD8比值分別為3.24±1.02及2.16±2.17,二者比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);隨著乳腺癌組織學級別的升高,其比值降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表1。

2.2 CD34在乳腺浸潤性導管癌和癌旁組織間質血管內皮細胞中表達應用抗CD34單克隆抗體,標記腫瘤間質中微血管內皮細胞(圖3,見插頁六),計數(shù)MVD。在癌旁組織中MVD為38.47± 5.32,在乳腺浸潤性導管癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級中MVD分別為41.99±8.05、64.04±10.14和79.61± 4.66。乳腺浸潤性導管癌組織中的MVD值明顯高于癌旁組織(P＜0.05),并且隨乳腺癌組織學級別的升高,MVD呈遞增趨勢。

表1 CD4及CD8在乳腺浸潤性導管癌及癌旁組織間質淋巴細胞中的表達Tab.1 Expressions of CD4 and CD8 in breast invasive ductal carcinoma and adjacent tissues(±s)

表1 CD4及CD8在乳腺浸潤性導管癌及癌旁組織間質淋巴細胞中的表達Tab.1 Expressions of CD4 and CD8 in breast invasive ductal carcinoma and adjacent tissues(±s)

?P＜0.05 compared with adjacent tissue group;△P＜0.01 compared with gradeⅠgroup.

Group n CD4(η/%)CD8(η/%)CD4/CD8 Adjacent tissue 10 34.09±10.41 10.51±1.88 3.24±1.02 Invasive ductal carcinoma 37 22.63±11.53?14.27±9.03 2.16±2.17 GradeⅠ8 31.81±9.92 7.20±0.65 4.42±1.68 GradeⅡ25 19.70±9.51△17.64±9.65△1.12±1.93△GradeⅢ4 16.38±1.09△17.98±1.59△0.91±0.06△

2.3 CD4陽性表達率、CD8陽性表達率及CD4/ CD8比值與乳腺癌組織間質MVD的相關性分析CD4和CD8陽性表達率、CD4/CD8比值及MVD值均呈非正態(tài)分布。CD4陽性表達率與MVD呈負相關關系(r＝－1.000,P＜0.001);CD8陽性表達率與MVD呈正相關關系(r＝0.984,P＜0.001);CD4/CD8比值與MVD呈負相關關系(r＝－0.984,P＜0.001)。

3 討論

腫瘤細胞間質中聚集的淋巴細胞被稱為腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL),主要包括輔助性T淋巴細胞(CD4陽性T細胞)和細胞毒性T淋巴細胞(CD8陽性T細胞)。因其與腫瘤細胞密切接觸,被認為是機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的直接而又特異的識別者[6-8]。CD4陽性T細胞是抗原提呈細胞,其通過直接或者間接的作用,協(xié)調B細胞分化成漿細胞產生抗體,并且可以激活CD8陽性T細胞。CD8陽性T細胞不僅可以通過分泌細胞因子以提高免疫效應,也能直接殺傷腫瘤細胞。CD4和CD8陽性T細胞共同構成免疫調節(jié)的中心樞紐,二者的平衡承擔著維持機體正常免疫應答的作用[9-11]。因此在腫瘤微環(huán)境中,浸潤的免疫細胞的數(shù)量改變及功能變化,在一定程度上反映了機體抗腫瘤反應的狀態(tài)[12-16]。

為了驗證CD4和CD8在乳腺癌組織間質淋巴細胞中表達的變化規(guī)律,本文作者檢測了37例乳腺癌及癌旁乳腺組織間質中CD4和CD8的表達,結果顯示:CD4在乳腺浸潤性導管癌間質淋巴細胞中的表達水平明顯低于癌旁組織;并且隨著乳腺癌組織學級別的升高,CD4陽性表達率降低;CD8在乳腺浸潤性導管癌間質淋巴細胞中的表達率則明顯高于癌旁組織,并隨著乳腺癌組織學級別的升高,CD8陽性表達率升高;分析CD4/CD8比值,結果顯示:乳腺癌組織CD4/CD8比值低于癌旁組織,但二者比較差異無統(tǒng)計學意義,在浸潤性導管癌各級別之間CD4/CD8比值比較差異有統(tǒng)計學意義;Spearman相關性分析結果顯示:CD4陽性表達率與MVD呈負相關關系,而CD8陽性表達率與MVD呈正相關關系,CD4/CD8比值與MVD呈負相關關系。以上研究結果證實:在乳腺癌惡性進展的過程中,CD4陽性T細胞進行性減少,而CD8陽性T細胞增多,二者的比值明顯下降。CD4/CD8比值能反映機體的免疫狀態(tài)和抗腫瘤能力[17-18]。然而目前國際上對于淋巴細胞亞群以及CD4/CD8比值并未建立統(tǒng)一數(shù)值,尤其腫瘤間質浸潤淋巴細胞中CD4/CD8比值的提示意義尚有待進一步研究證實。有研究[19-20]表明:在惡性腫瘤的演進過程中,腫瘤細胞產生一些免疫抑制因子(IL-10、TGF-β等),抑制淋巴細胞分化增殖,淋巴細胞表面CD4細胞抗原減少,對CD4陽性T細胞產生抑制作用,而CD8陽性T細胞反應性增多,通過抑制抗體的合成、分泌,抑制T細胞的自我增殖。因此,CD4/CD8比值下降使機體免疫水平處于抑制狀態(tài),容易導致腫瘤轉移。本研究中相關性分析結果顯示:CD4/CD8比值與MVD呈負相關關系,進一步驗證腫瘤微環(huán)境中免疫抑制狀態(tài)越明顯,腫瘤間質血管新生能力越強,但二者之間的潛在調控關系有待進一步研究證實。

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?吉林大學臨床醫(yī)學專業(yè)5年制2011級

Correlation of CD4 and CD8 positive lymphocytes with tumor angiogenesis in microenvironment of breast invasive ductal carcinoma

LA Zong1,2,WANG Jian-xia1,CUI Ni?,LI Ming-yue1,XING Shu-gang1,REN Bo1, ZHANG Li-hong1,LI Wei1,LI Yu-lin1
(1.Department of Pathology,School of Basic Medical Sciences,Key Laboratory of Pathobiology, Ministry of Education,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Department of Pathology, School of Medical Sciences,University of Tibet,Lasa 850000,China)

breast neoplasms;T lymphocytes;tumor angiogenesis;CD4;CD8

R737.9

A

2014-02-24

吉林省科技廳自然科學基金資助課題(20130102084JC);吉林大學白求恩醫(yī)學科研支持計劃資助課題(2013101005);吉林大學“大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃”國家級項目資助課題(2013A71249)

拉 宗(1975－),女,西藏自治區(qū)拉薩市人,講師,醫(yī)學碩士,主要從事腫瘤間質病理生物學方面的研究。

李玉林(Tel:0431-85619481,E-mail:ylli＠jlu.edu.cn);

李 偉(Tel:0431-85619481,E-mail:liwei2006＠jlu.edu.cn)

時間: 2014-08-27 14:41

網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1441.002.html

1671-587Ⅹ(2014)05-1069-05

10.13481/j.1671-587x.20140531

Abstract:Objective To detect the percentages of CD4＋,CD8＋T lymphocytes in the breast invasive ductal carcinoma microenvironment,and to analyze their correlation with breast carcinoma microvessel density(MVD).MethodsThe expressions of CD4,CD8 and CD34 were detected in 10 cases of adjacent normal breast tissue and 37 cases of breast invasive ductal carcinoma tissue by immunohistochemistry.The correlations between CD4,CD8, CD4/CD8 and MVD were analyzed by Spearman correlation analysis.ResultsThe CD4 expression level (22.63%±11.53%)in breast invasive ductal carcinoma tissue was lower than that in adjacent tissue(34.09%± 10.41%),and there was statistically significant difference(P＜0.05).With the increasing of the histological grade of breast cancer,grade,the expression level of CD4 was gradually decreased(P＜0.05).The CD8 expression level (14.27%±9.03%)in breast invasive ductal carcinoma tissue was higher than that in adjacent tissue(10.51%± 1.88%),but there was no statistically significant difference(P＞0.05).With the increasing of the histological grade of breast cancer,the expression level of CD8 was gradually increased(P＜0.01).The CD4/CD8 ratios in adjacent tissue group and breast invasive ductal carcinoma tissue group were 3.24±1.02 and 2.16±2.17,and there was no statistically significant difference between them(P＞0.05).With the increasing of histological grade of breast invasive ductal carcinoma,the CD4/CD8 ratios were decreased(P＜0.01).The MVD in breast invasive ductal carcinoma tissue was obviously higher than that in adjacent tissue,and it showed an increasing trend with the increasing of the histological grade of breast invasive ductal carcinoma(P＜0.05).The correlation analysis showed that the MVD was negatively correlated with the CD4 expression(r＝－1.000,P＜0.001)as well as CD4/CD8 ratio(r＝－0.984,P＜0.001),and was positively correlated with the CD8 expression level(r＝0.984,P＜0.001).ConclusionThe expression of CD4 is decreased in breast cancer tissue,the expression of CD8 is elevated, and the CD4/CD8 ratio is decreased,which suggests that T cells in the breast cancer microenvironment are immunosuppressed.