左志剛,胡 敏,劉 珊,李志敏,姜 歡,李洪發(fā)

(1.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院正畸科,天津 300070;2.吉林大學口腔醫(yī)院正畸科,吉林長春 130021; 3.天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所,天津 300051)

大鼠齦溝液吸潮紙尖采集方法的建立及其評價

左志剛1,胡 敏2,劉 珊3,李志敏1,姜 歡2,李洪發(fā)1

(1.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院正畸科,天津 300070;2.吉林大學口腔醫(yī)院正畸科,吉林長春 130021; 3.天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所,天津 300051)

目的:建立并評價大鼠齦溝液(GCF)吸潮紙尖采集方法,為大鼠齦溝液分析奠定基礎。方法:選取健康雄性大鼠20只,隨機分為GCF組和唾液組,每組各10只。15＃吸潮紙尖分別采集GCF組大鼠右上第一磨牙腭側齦溝內液體和唾液組大鼠唾液。樣本離心后進行SDS-PAGE分析及蛋白豐度檢測,分析2組樣本的蛋白成分。結果:GCF組樣本電泳結果可見相對分子質量約為77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白質條帶,尤以66 000處條帶亮度最高。唾液組樣本在相對分子質量約為66 000、60 000和48 000附近隱約可見蛋白質條帶,條帶亮度較低。2組樣本66 000條帶處蛋白豐度值比較差異有統計學意義(P＜0.05)。結論:GCF組樣本的蛋白條帶數量以及種類不同于唾液組樣本,證明本實驗利用15＃吸潮紙尖袋內多次取樣法可排除唾液、血液干擾,成功采集大鼠GCF。

齦溝液;吸潮紙尖;蛋白分析;大鼠,Wistar

齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)是結締組織內的液體不斷通過齦溝內壁上皮和結合上皮進入齦溝內所形成[1],是唯一直接從體液滲出的液體。目前國內外對于GCF成分的研究多以人為研究對象,動物GCF采集分析的研究并不多見。濾紙條法是目前最常用的GCF采集方法,國內外學者[2-5]采用濾紙條法多選用Whatman 3號濾紙條作為主要材料采集動物GCF,其缺點如下:①濾紙條2 mm的寬度增加了插入牙周袋的難度;②濾紙條兩直角鋒利,沿牙面插入牙周袋內時,加大牙周袋內壁出血的幾率,使采集的樣本呈血性;③濾紙條需要手工裁剪成10 mm×2 mm規(guī)格的長方形,占用工作人員的大量時間,且精確度不佳,操作時夾持不便;④失誤操作容易使GCF和唾液混淆,造成后續(xù)實驗結果的不準確。

本研究結合目前研究條件,嘗試利用吸潮紙尖采集大鼠GCF。吸潮紙尖是牙科專用根管清洗材料,其主要成分是棉纖維,吸水性強,60 s內吸紅汞溶液遷移距離10 mm,41℃水中不分解。其相對于傳統濾紙條的優(yōu)點如下:①吸潮紙尖是外型具有一定錐度的圓柱體,沒有兩個直角尖,插入牙周袋時順暢,不易劃破袋內壁組織,且其規(guī)格齊全,其長度、錐度和直徑符合國際標準,不同規(guī)格的紙尖在夾持部位用不同顏色標記。實驗中可根據牙周袋口松緊和插入時堅挺的程度選擇合適的型號,降低了插入牙周袋的難度;②吸潮紙尖具有良好的彈性和相當的硬度,縱向強度高,不易劃破袋內壁組織,減少了采樣插入牙周袋內刺破袋內壁組織造成出血的機率,去除了樣本被血液污染的干擾因素;③吸潮紙尖采樣操作應用效果優(yōu)于Whatman 3號濾紙條,解決了操作者夾持柄問題,省去手工裁剪操作。本研究通過SDS-PAGE分析樣本的蛋白成分,排除了唾液對采集樣本純度的干擾,證明所采集樣本為大鼠GCF,成功建立大鼠GCF吸潮紙尖采集方法,為后續(xù)實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器20只健康雄性Wistar大鼠,體質量為(0.25±0.02)kg,由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供(動物合格證號: 0015004)。速眠新和蘇醒靈(吉林大學和平校區(qū)提供),丙烯酰胺、N,N’-亞甲雙丙烯酰胺和N, N,N’,N’-四甲基二乙胺(美國Sigma公司),十二烷基硫酸鈉和L-甘氨酸(北京鼎國生物技術有限責任公司),磷酸酯酶(天津市化學試劑研究所),低分子量蛋白質標準(上海生工生物工程技術服務有限公司),考馬斯亮藍R-250(長春寶泰克生物技術有限公司)。15＃吸潮紙尖(北京達雅鼎醫(yī)療器械有限公司),Mikro 22R型低溫高速離心機(德國Hettich-Zentrifugen公司),HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱東聯電子開發(fā)公司),DYC-242型垂直電泳槽和DYY-5型電泳儀(北京六一儀器廠),Phast Image掃描儀(Pharmacia LKB,瑞典),微量振蕩器MH-1(江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠),超低溫冰箱(－80℃)和低溫冰箱(－20℃)(日本Sanyo公司)。

1.2 實驗動物分組20只健康雄性Wistar大鼠分籠喂養(yǎng),自由飲水,室溫控制在約25℃,隨機分為GCF組和唾液組,每組10只。15＃吸潮紙尖分別采集GCF組大鼠右上第一磨牙腭側齦溝內液體和唾液組大鼠唾液。

1.3 取 樣大鼠經速眠新(0.8～1.2 m L·kg－1)肌注麻醉后仰臥固定,置開口器(圖1,見插頁五)。將GCF組大鼠右上磨牙頰側以棉卷隔濕,氣槍吹干受試牙面及周圍牙齦黏膜,鈍性牙周探針工作端背部輕壓受試牙腭側牙齦邊緣,使游離齦與牙面輕微分開,將預先剪掉尖端0.5 mm并已高溫高壓消毒的15＃吸潮紙尖輕輕插入右上第一磨牙近、遠中腭側齦溝內至有輕微阻力即停止(約1.0 mm),留置30 s后取出,間隔1 min后重復2次,帶血樣本棄去,立即將紙尖密封于已消毒好的微型離心管中。15＃吸潮紙尖采集唾液組大鼠舌下區(qū)唾液,置于已高溫高壓消毒好的微型離心管中。

1.4 樣本處理各組樣本提取后,立即加入1%磷酸鹽緩沖液(PBS,p H 7.2)120μL,常溫下洗脫1 h,15 000 r·min－1離心5 min,提取100μL上清液,－80°保存。

1.5 SDS-PAGE分析制備凝膠,取經處理好的樣本進行SDS-PAGE分析,電泳后凝膠采用考馬斯亮藍R250染色。脫色后使用硝酸銀染色法對凝膠進行染色。銀染色凝膠用Phast Image掃描儀進行掃描,根據標準蛋白質的遷移率測定各樣本條帶蛋白質亞基的相對分子質量,并進行各條帶的定量分析。SDS-PAGE電泳的某一蛋白質條帶的光密度(A)值與該條帶面積乘積為此條帶的豐度(abundance),反映該條帶蛋白質的水平。

1.6 統計學分析采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計分析。2組樣本中所含蛋白條帶數和蛋白豐度以±s表示,組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 SDS-PAGE電泳分析GCF組樣本電泳結果:清晰可見相對分子質量約為77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白質條帶,其中除28 000處蛋白質條帶亮度略低外,其他條帶亮度均高,尤以66 000處亮度最高,在相對分子質量為66 000～116 000范圍內,可見3～4條亮度高低不等的蛋白質條帶。唾液組樣本電泳結果:在相對分子質量約為66 000、60 000和48 000處隱約可見蛋白質條帶,條帶亮度較低。見圖2。

2.2 2組蛋白條帶數對比分析2組樣本蛋白條帶數目不同,GCF組為(7.400±0.699)條蛋白帶,唾液組為(3.400±0.699)條蛋白帶,二者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 2組蛋白豐度應用Phast Image掃描儀掃描各樣本主要蛋白的蛋白豐度,2組樣本相對分子質量66 000處蛋白的蛋白豐度比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖2 GCF組和唾液組大鼠樣本SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Electrophoregram of rat samples in GCF group and saliva group detected by SDS-PAGELane 1:Standard protein marker;Lane 2:GCF group;Lane 3:Saliva group.

表1 GCF組和唾液組樣本蛋白豐度檢測結果Tab.1 Determination results of protein abundance of samples in GCF group and saliva group(±s)

表1 GCF組和唾液組樣本蛋白豐度檢測結果Tab.1 Determination results of protein abundance of samples in GCF group and saliva group(±s)

?P＜0.05 compared with GCF group.“－”:No protein bands.

Group Protein abundance 77 000 66 000 60 000 55 000 51 000 48 000 28 000 GCF 0.35±0.24 0.57±0.33 －0.34±0.28 0.37±0.23－0.26±0.21 Saliva－0.20±0.16?0.19±0.14－－0.17±0.13－

3 討論

口腔環(huán)境中的液體包括唾液與GCF。唾液是由涎腺分泌的,經過導管系統排入口腔,廣泛存在于口腔環(huán)境中。GCF的成分與血清相近,因為其成分主要來源于血清,含有電解質、氨基酸和免疫球蛋白等,具有抗菌和增強牙齦免疫的能力。GCF的其他成分來源于細菌、牙周局部細胞產生的間質液及上皮和結締組織的破壞產物等[6]。在牙周組織病變或改建過程中,GCF的成分可能發(fā)生微量改變[7-12]。目前國內外GCF研究[13-15]已經涉足到口腔醫(yī)學各個學科,包括口腔修復科、口腔種植科、正畸科和兒科等。近年來越來越多的研究[16]發(fā)現:牙周病與全身疾病密切相關,并且由于GCF具有方便、無創(chuàng)和準確等優(yōu)點,GCF的研究已不僅僅局限在口腔醫(yī)學領域范疇,而是深入到其他臨床醫(yī)學之中,應用越來越廣泛。

正常情況下,齦溝內存在菌斑微生物及其代謝產物,且齦溝內始終有滲透梯度的變化,故齦溝內有少量GCF聚積。GCF的采集方法一般有齦溝沖洗法、濾紙條法和微吸管法,采集方法不同,GCF的質和量亦有差異。齦溝沖洗法主要適合于研究齦溝內細胞種類的鑒定和數目及功能的分析,短時間內限定位點的齦溝徹底沖洗法可獲得代表性齦溝內樣本[17]。濾紙條法和微吸管法主要用于GCF的生化分析。微吸管法可定量采集較大量的GCF,但缺點是易對袋壁組織產生較大的刺激,引起毛細血管通透性增加,使GCF樣本被血清稀釋和“污染”[18],且此法的誤差較大。濾紙條法是目前最常用的方法,該法操作方便,對組織無損傷,而且誤差小,重復性好。濾紙條法又分為袋內法和袋外法,袋外法避免了濾紙插入時對齦溝上皮的物理性刺激,但獲得的GCF量較少,可能導致GCF被唾液污染;袋內法較袋外法獲得的GCF量多,但對局部的刺激可能導致血清稀釋作用。由此可見,在采集量少的GCF時很容易被存在于整個口腔的唾液污染,所以本研究對采集樣本進行蛋白分析,比較GCF組樣本與唾液組樣本蛋白條帶數及蛋白種類,證明本實驗利用吸潮紙尖在采集過程中可以排除唾液干擾,成功采集大鼠GCF。

本研究結果顯示:GCF組樣本蛋白條帶與唾液組比較差異有統計學意義。由于蛋白質是GCF的重要成分,其來源于血漿、宿主細胞的產物、組織破壞降解產物、菌斑及其產物。唾液中99%是水,有機物主要是唾液淀粉酶、黏多糖、黏蛋白和溶菌酶等,無機物有鈉、鉀、鈣、氯和硫氰離子等,蛋白含量很少。所以,蛋白質含量多的GCF電泳會出現較多的蛋白條帶,而蛋白含量少的唾液則會出現較少的蛋白條帶。SDS-PAGE結果顯示: GCF組樣本和唾液組樣本中所含蛋白質種類也不相同。GCF組樣本中可見相對分子質量約為77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白質條帶,條帶亮度較高,該結果與周華等[19]對人GCF蛋白質成分的電泳分析結果相似,且與血清蛋白質區(qū)帶相一致,說明這些蛋白是GCF的主要血清蛋白質;唾液組樣本在相對分子質量約為66 000、60 000和48 000處隱約可見亮度較低的蛋白質條帶,GCF組樣本中出現的蛋白質在唾液組樣本中未檢測到,而相對分子質量為60 000和48 000的蛋白質只在唾液組樣本中檢測到,相對分子質量為66 000的蛋白質在2組樣本中均檢測出, 但GCF組樣本該蛋白質的蛋白豐度值高于唾液組樣本。本實驗結果表明:GCF組樣本的蛋白質條帶無論是數量還是種類顯著多于唾液組樣本的蛋白質條帶,說明GCF組樣本的蛋白質成分更復雜,由此可將二者區(qū)分,證明利用吸潮紙尖可以成功采集到未被唾液污染的大鼠GCF樣本。

Johnson等[20]通過體內、體外實驗證明:吸潮紙尖的吸潮性、分離洗脫的回收率和采集臨床樣本的檢測效果均與傳統濾紙條無明顯差異。本實驗選擇15＃吸潮紙尖代替濾紙條采集GCF,在采集及貯存過程中,需注意以下幾點情況:①在實驗前減去吸潮紙尖尖端5 mm處以增加其前端強度;②操作須在安靜、平靜的狀態(tài)下進行,操作者不宜緊張,采集過程中應細致、準確、謹慎;③由于大鼠口角不易完全拉開,且頰側前庭溝軟組織較多,頰側術區(qū)視野不宜完全暴露,故本實驗選擇采集上頜第一磨牙腭側近遠中部位齦溝液;④GCF采集前充分干燥牙齒及周圍組織,用鈍性牙周探針工作端背部輕壓受試牙腭側牙齦邊緣,使游離齦與牙面輕微分開,易于紙尖的插入;⑤紙尖插入至有輕微阻力即停止(約1.0 mm),留置30 s后取出,可見紙尖前端約2 mm處為透明色液體浸漬;⑥由于吸潮紙尖采集GCF量較少,且為減小第1次取樣時齦溝內可能存留唾液的干擾,本實驗采取多次取樣法,即間隔1 min后再重復取樣2次;⑦帶血樣本棄去;⑧本實驗采用洗提法加離心法處理樣本;⑨樣本以PBS作為緩沖液,－80℃保存。

在以往的動物實驗中,由于誤操作容易使GCF和口腔中的唾液、血液等其他液體混淆,造成后續(xù)實驗結果的不準確。在本實驗中,取樣時棄去帶血樣本排除了血液的干擾。

綜上所述,利用15＃吸潮紙尖袋內多次取樣法可以成功采集大鼠GCF,排除了唾液、血液等口腔中其他液體的干擾,為后續(xù)實驗中GCF的分析奠定了基礎。

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Establishment and evaluation of method to collect rat gingival crevicular fluid by using absorbent paper points

ZUO Zhi-gang1,HU Min2,LIU Shan3,LI Zhi-min1,JIANG Huan2,LI Hong-fa1
(1.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300070, China;2.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 3.Institute of Cardiovascular Diseases,Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300051,China)

ObjectiveTo establish and evaluate the method to collect the rat gingival crevicular fluid(GCF)by using absorbent paper points,and to lay foundation for analysis on GCF.Methods20 healthy male rats were selected and randomly divided into GCF group and saliva group.The GCF of the right upper molar gingival trough of the rats in GCF group and the saliva of the rats in saliva group were collected by using 15＃absorbent paper points.The SDS-PAGE analysis and abundance detection were applied to analyze the protein bands of the samples in two groups.ResultsThe SDS-PAGE analysis identified the proteins at 77 000,66 000,55 000,51 000,and 28 000,especially 66 000 in GCF group.While saliva group had lower brightness protein bands at 66 000,60 000, and 48 000.The data of protein abundance of 66 000 between two groups had statistically significant difference (P＜0.05).ConclusionThe number and types of the protein bands are different between GCF Group and saliva group,so using 15＃absorbent paper points can collect the rat GCF successfully.

gingival crevicular fluid;absorbent paper points;protein analysis;rats,Wistar

R783.5

A

2013-11-27

吉林省科技廳科研基金資助課題(20080042-1);天津醫(yī)科大學科學基金青年項目資助課題(2012KYQ13)

左志剛(1982－),男,河北省張家口市人,主治醫(yī)師,醫(yī)學碩士,主要從事口腔正畸學研究。

李洪發(fā)(Tel:022-23332097,E-mail:leehongfa＠yahoo.com.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1028-05

10.13481/j.1671-587x.20140524