宋麗娟,韓 彬

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸感染科,遼寧錦州 121001)

血必凈對LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生和iNOS及核轉(zhuǎn)錄因子κB蛋白表達(dá)的影響

宋麗娟,韓 彬

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸感染科,遼寧錦州 121001)

目的:探討血必凈對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)損傷的保護(hù)作用,研究在血必凈干預(yù)下一氧化氮(NO)產(chǎn)生、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法:將體外培養(yǎng)的VEC分為對照組、LPS(1 mg·L－1)組、LPS(1 mg·L－1)＋血必凈(25 g·L－1)組、LPS(1 mg·L－1)＋吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC,20μmol·L－1)組,在給予LPS前預(yù)先用血必凈和PDTC孵育1 h。采用Western blotting法檢測iNOS和核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)蛋白的表達(dá)情況,采用Griess法檢測上清液中NO的水平。結(jié)果:與對照組比較,LPS組VEC中NO水平、iNOS和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)。與LPS組比較, LPS＋血必凈組VEC中NO水平、iNOS和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與LPS組比較,LPS＋PDTC組VEC中NO水平和iNOS及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。LPS＋血必凈組與LPS＋PDTC組比較,VEC中NO水平和iNOS蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),LPS＋PDTC組VEC中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯低于LPS＋血必凈組(P＜0.05)。結(jié)論:血必凈能抑制VEC中NO的產(chǎn)生和iNOS蛋白的表達(dá),其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB而抑制炎癥反應(yīng)。

血必凈;核轉(zhuǎn)錄因子-κB;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;一氧化氮;血管內(nèi)皮細(xì)胞

近年來研究[1-2]表明:革蘭陰性菌感染所引起的膿毒血癥可導(dǎo)致敗血癥性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等嚴(yán)重疾患,是臨床上危重患者死亡的首要原因。經(jīng)典的抗感染治療難以有效地控制膿毒血癥的發(fā)病率及死亡率。位于革蘭陰性菌外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)亦稱內(nèi)毒素,是其致病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。越來越多的研究[2]表明:血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VEC)在LPS引起的內(nèi)毒素休克和多器官功能衰竭等病理過程中也起關(guān)鍵作用。血必凈(Xuebijing,XBJ)是一類中藥復(fù)合制劑,其主要成分為紅花、川芎、丹參、赤芍和當(dāng)歸等,具有抗菌、抗毒和抗炎作用[3]。目前國內(nèi)研究[4]發(fā)現(xiàn):血必凈對內(nèi)毒素刺激的VEC有保護(hù)作用,可緩解VEC受損并可使重要臟器損傷程度減輕,研究[5]顯示:血必凈同時還具有強(qiáng)效抗內(nèi)毒素及調(diào)節(jié)免疫功能的作用。國外研究[6]報道:當(dāng)發(fā)生膿毒癥時血必凈可通過識別核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factorκB, NF-κB)起到抑制作用,但這方面的研究報道甚少。本研究觀察血必凈對LPS激活VEC中誘導(dǎo)型—氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、NF-κB表達(dá)及一氧化氮(nitric oxide,NO)水平的影響,旨在為臨床膿毒癥致VEC損傷后的保護(hù)提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑VEC購自上海交通大學(xué)實(shí)驗室。ECM培養(yǎng)基購自美國Sciencell公司;LPS購自美國Sigma公司,采用PBS配制成2 g·L－1溶液,過濾滅菌后備用;NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)和NO試劑盒購自江蘇碧云天公司;兔抗人NF-κB p65和iNOS多克隆抗體購自博奧森公司;血必凈生藥濃度為500 g·L－1,10 m L/支,靜脈注射液制劑,購自天津紅日制藥廠(批號: 080108)。

1.2 VEC培養(yǎng)及鑒定將VEC接種于培養(yǎng)瓶中,采用含5%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素及1%內(nèi)皮生長因子(ECGS)的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng),2～3 d更換培養(yǎng)液1次,待細(xì)胞生長約80%融合時采用0.25胰蛋白酶消化傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗。采用免疫熒光染色法鑒定。

1.3 實(shí)驗分組將細(xì)胞懸浮液采用無菌ECM培養(yǎng)液洗滌2～3次,取細(xì)胞懸液0.1μL,采用0.4%臺盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/孔,接種于6孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。不同濃度血必凈對NO水平影響的實(shí)驗:①對照組,采用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h; ②LPS組,將LPS(1 mg·L－1)(預(yù)實(shí)驗得出)與細(xì)胞共孵育24 h;③不同濃度血必凈組,采用12.5、25.0和50.0 g·L－1血必凈預(yù)先與細(xì)胞孵育1 h,再給予1 mg·L－1LPS與細(xì)胞共孵育24 h。血必凈和PDTC對NO、iNOS和NF-κB水平影響的實(shí)驗:①對照組,采用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h;②LPS組,將LPS (1 mg·L－1)(預(yù)實(shí)驗得出)與細(xì)胞共孵育24 h; ③LPS＋血必凈組,采用25.0 g·L－1血必凈(通過前一實(shí)驗得出)預(yù)先與細(xì)胞孵育1 h,再給予1 mg·L－1LPS與細(xì)胞共孵育24 h;④LPS＋PDTC組,采用20μmol·L－1PDTC預(yù)先與細(xì)胞孵育1 h,之后加入1 mg·L－1LPS再與細(xì)胞共孵育24 h。

1.4 NO水平測定收集各處理組細(xì)胞上清液, 于4℃、5 000 r·min－1離心5 min,取上清儲存于－80℃以檢測NO水平。以NO在培養(yǎng)基中形成的穩(wěn)定終末產(chǎn)物NO2－的濃度代表NO的產(chǎn)生量。離心后取上清液50μL,在各孔中加入50μL Griess reagentⅠ和50μL Griess reagentⅡ,于室溫下540 nm波長處測定吸光度(A)值,根據(jù)樣本的A值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到樣本中NO2－的濃度。

1.5 Western blotting法檢測iNOS和NF-κB蛋白表達(dá)水平細(xì)胞培養(yǎng)24 h,用PBS終止刺激并洗滌細(xì)胞2次,用細(xì)胞刮勺將細(xì)胞刮下,嚴(yán)格按操作步驟提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白水平。取50 g樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,加抗iNOS和抗NF-κB p65(1∶400),4℃孵育過夜,洗膜,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,37℃下孵育1 h,DAB顯色,采用圖像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)帶A值,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白A值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各組細(xì)胞上清中NO水平和iNOS、NF-κB蛋白表達(dá)水平以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度血必凈作用下LPS誘導(dǎo)的VEC中NO水平與對照組比較,LPS組和LPS＋血必凈組VEC中NO水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與LPS組比較,不同濃度量血必凈組VEC中NO的水平明顯下降(P＜0.05)。25.0 和50.0 g·L－1血必凈組VEC中NO水平明顯低于12.5 g·L－1血必凈組(P＜0.05)。見表1。本實(shí)驗得出血必凈最適濃度為25 g·L－1。

表1 血必凈作用下VEC中NO的水平Tab.1 Levels of NO in VEC after treated with XBJ [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

表1 血必凈作用下VEC中NO的水平Tab.1 Levels of NO in VEC after treated with XBJ [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05 compared with LPS group;＃P＜0.05 compared with 12.5 g·L－1XBJ group.

Group NO Control 1.993±0.553 LPS(1 mg·L－1)24.155±5.171??LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(12.5 g·L－1)16.672±2.115?△LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(25.0 g·L－1)12.174±1.259?△＃LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(50.0 g·L－1)9.680±2.348??△＃

2.2 血必凈和PDTC作用下LPS誘導(dǎo)的VEC中NO水平與對照組比較,LPS組NO的水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與LPS組比較,LPS＋血必凈(25 g·L－1)組和LPS＋PDTC組VEC中NO水平明顯降低(P＜0.05或 P＜0.01),而后二組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

2.3 各組VEC中iNOS蛋白表達(dá)水平與對照組比較,LPS組VEC中iNOS蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01);與LPS組比較,LPS＋血必凈組和LPS＋PDTC組VEC中iNOS蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);而后二組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1和表3。

表2 各組VEC中NO水平Tab.2 Levels of NO in VEC in various groups [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with LPS group.

Group NO Control 1.666±0.562 LPS(1 mg·L－1)24.891±2.841??LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(25.0 g·L－1)11.806±1.601?△LPS(1 mg·L－1)＋PDTC(20μmol·L－1)8.822±0.921?△△

圖1 Western blotting法檢測各組VEC中iNOS蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of iNOS protein in VEC in various groups detected by Western blotting method Lane 1:Control group;Lane 2:LPS group;Lane 3:LPS＋XBJ group;Lane 4:LPS＋PDTC group.

表3 各組VEC中iNOS和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of iNOS and NF-κB p65 proteins in VEC in various groups(n＝3,±s)

表3 各組VEC中iNOS和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of iNOS and NF-κB p65 proteins in VEC in various groups(n＝3,±s)

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with LPS group;＃P＜0.05 compared with LPS＋XBJ group.

Group iNOS NF-κB p65 Control 0.096±0.012 0.043±0.005 LPS(1 mg·L－1)0.844±0.119??0.197±0.036??LPS(1 mg·L－1)＋XBJ (25.0 g·L－1)0.452±0.052?△△0.104±0.014?△LPS(1 mg·L－1)＋PDTC (20μmol·L－1)0.297±0.064?△0.069±0.011?△△＃

2.4 各組VEC中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平與對照組比較,LPS組VEC中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01);與LPS組比較, LPS＋XBJ組和LPS＋PDTC組VEC中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與LPS＋血必凈組比較,LPS＋PDTC組VEC中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。見圖2和表3。

圖2 Western blotting法檢測各組VEC中NF-κB p65蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB p65 protein in VEC in variuos groups detected by Western blotting methodLane 1:Control group;Lane 2:LPS group;Lane 3:LPS＋XBJ group;Lane 4:LPS＋PDTC group.

3 討 論

血必凈是一類活血化瘀的中藥復(fù)合制劑,含多種藥物成分,其中主要有效成分為丹參素、川芎嗪、芍藥苷、紅花黃色素和阿魏酸等,有以下幾種重要的作用:①調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答;②強(qiáng)效拮抗內(nèi)毒素;③清除氧自由基;④調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)的活性;⑤擴(kuò)張冠脈和外周血管,降低血管通透性等。本研究以VEC為研究對象,以iNOS和NO為靶點(diǎn)探討血必凈保護(hù)VEC的作用機(jī)制。

目前一氧化碳合酶(NOS)有3種異構(gòu)體,分別為神經(jīng)元型一氧化氮合酶(n NOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和iNOS。其中eNOS有調(diào)節(jié)鈣離子活性的作用,iNOS和n NOS與毒素和細(xì)胞因子的介導(dǎo)有密切關(guān)系,并參與轉(zhuǎn)錄及翻譯等一系列復(fù)雜的過程從而調(diào)節(jié)NO的生成量[7]。正常情況下,VEC中iNOS維持在一個較低水平,當(dāng)受到外界因素如感染及發(fā)生應(yīng)激性反應(yīng)的情況下,尤其是膿毒血癥、SIRS、MODS等,iNOS表達(dá)水平明顯高于正常水平,最終使NO生成量增高[8]。NO是由NOS催化左旋精氨酸(L-Arg)的氧化反應(yīng)生成,用以舒張血管和抑制血小板凝集,對維持正常的VEC及其完整性非常重要[9]。然而,在未感染之前,細(xì)胞中僅含有微量的NO (pmol),當(dāng)NO產(chǎn)生過量時,會出現(xiàn)細(xì)胞損傷,使毛細(xì)血管的通透性增加,滲出增加,同時可以抑制心肌收縮力及降低血管多種收縮因子的敏感度,從而導(dǎo)致感染性休克的發(fā)生。

血必凈對抗炎癥保護(hù)臟器的作用已得到多個學(xué)者的認(rèn)可,其相關(guān)研究也較多。周紅萍等[10]研究發(fā)現(xiàn):血必凈可降低體內(nèi)內(nèi)毒素的水平;雪琳等[11]在研究LPS誘導(dǎo)發(fā)生MODS的模型中觀察到血必凈能抑制TNF-α的表達(dá);李志軍等[12]在家兔研究中得出血必凈可降低LPS刺激VEC后產(chǎn)生一系列應(yīng)激性反應(yīng)如NOS水平和內(nèi)皮素表達(dá)等。謝穎光等[13]證實(shí):血必凈注射液能顯著降低重癥患者血循環(huán)中NO水平,可以保護(hù)重癥患者的VEC,改善重癥患者的病情。朱海云等[14]發(fā)現(xiàn):血必凈注射液可降低膿毒癥大鼠iNOS表達(dá)水平,表明血必凈注射液能抑制膿毒癥大鼠iNOS的表達(dá)。趙光舉等[15]觀察了血必凈注射液對創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肺組織iNOS活性和NO水平影響的結(jié)果表明:血必凈注射液能顯著下調(diào)肺組織中iNOS活性及NO生成。本研究結(jié)果與謝穎光等[13]和朱海云等[14]的研究結(jié)果相符合。由此可見,血必凈可通過降低NO水平和iNOS表達(dá)以改善LPS導(dǎo)致的炎性損傷,從而能起到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。

本研究結(jié)果顯示:LPS能上調(diào)VEC中iNOS 和NF-κB p65表達(dá)及NO水平,分別加入血必凈及阻斷劑組PDTC后,VEC中iNOS、NF-κB p65的表達(dá)和NO水平均有所下調(diào),且2組iNOS表達(dá)和NO水平下降較接近,這說明血必凈抑制VEC 中iNOS表達(dá)和NO水平可能是通過抑制NF-κB發(fā)揮作用,也間接地反映了LPS可能通過激活NF-κB通路上調(diào)iNOS蛋白表達(dá)和NO水平,從而發(fā)生了瀑布式連鎖反應(yīng)。另外,本實(shí)驗選擇NF-κB p65亞基作為靶基因,發(fā)現(xiàn)血必凈和NF-κB阻斷劑PDTC均顯著抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)。NF-κB p65蛋白是NF-κB的一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄亞基,最常見的NF-κB以異源二聚體P65∶P50的形式出現(xiàn)[16]。NF-κB作為細(xì)胞中重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,是多條炎癥通路的交匯點(diǎn)[17],這與國內(nèi)研究[18]報道的血必凈能抑制NF-κB的表達(dá)、有效降低膿毒癥患者病死率,進(jìn)而抑制血管內(nèi)膜炎性反應(yīng)的研究結(jié)果相吻合。但由于預(yù)先給予血必凈及阻斷劑處理后未降到正常水平,從而推斷LPS感染VEC可能僅部分激活NF-κB,說明還有可能通過其他通路介導(dǎo)。由此可推斷:血必凈有可能通過抑制NF-κB的激活以抑制LPS誘導(dǎo)的VEC中iNOS表達(dá)和NO水平,進(jìn)而發(fā)揮抗炎和保護(hù)內(nèi)皮的作用。

綜上所述,血必凈可通過抑制NF-κB活性進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)和VEC損傷,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Influence of Xuebijing in production of NO and expressions of iNOS and NF-κB induced by LPSin vascular endothelial cells

SONG Li-juan,HAN Bin
(Department of Respiratory and Infections Medicine,First Affiliated Hospital,Liaoning Medical University, Jinzou 121001,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of Xuebijing(XBJ)on the injury of vascular endothelial cells(VEC)induced by lipopolysaccharide(LPS),and to study the mechanisms of the production of nitric oxide (NO)and the expressions of inducible nitric oxide sytnhase(iNOS)and signal transduction under XBJintervention condition.MethodsThe cultured VEC were divided into control group,LPS(1 mg·L－1)group,LPS (1 mg·L－1)＋XBJ(25 g·L－1)group,LPS(1 mg·L－1)＋pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC,20μmol·L－1) group;XBJ and PDTC were administrated 1 h before incubation of with LPS.Western blotting method was used to detect the expressions of iNOS and NF-κB p65 protein.The level of NO in the supernatant was measured by Griess reagent.ResultsComparaed with control group,the NO level and the expression levels of iNOS protein and NF-κB p65 protein in VEC in LPS group were significantly increased(P＜0.01).Compared with LPS group,the NO level and the expression levels of iNOS protein and NF-κB p65 protein in VEC in LPS＋XBJ group weresignificantly decreased(P＜0.05 or P＜0.01);the NO level and the expression levels of NF-κB p65 protein and iNOS protein in VEC in LPS＋PDTC group were significantly decreased(P＜0.05 or P＜0.01).There were no significant differences of the NO levels and the expression levels of iNOS protein between LPS＋XBJ group and LPS＋PDTC group(P＞0.05),but the expression level of NF-κB p65 protein in LPS＋PDTC group was lower than that in LPS＋XBJ group(P＜0.05).ConclusionXBJ can inhibit the production of NO and the expression of iNOS protein in VEC;its mechanism may be related to inhibiting the activation of NF-κB to control inflammation.

Xuebijing;nuclear factorκB;inducible nitric oxide synthase;nitric oxide;vascular endothelial cells

R285.5

A

2013-11-28

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(20092189)

宋麗娟(1981－),女,山西省大同市人,在讀醫(yī)學(xué)碩士,主要從事呼吸感染與膿毒癥方面的研究。

韓 彬(Tel:0416-4197095,E-mail:hanbin9500＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0997-05

10.13481/j.1671-587x.20140518