姚 剛,郝婷婷,羅翔丹,于挺敏

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春 130041;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,吉林長春 130041; 3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院營養(yǎng)部,吉林長春 130041)

利扎曲普坦對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠行為學(xué)和外周血中疼痛相關(guān)因子水平的影響

姚 剛1,郝婷婷2,羅翔丹3,于挺敏1

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春 130041;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,吉林長春 130041; 3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院營養(yǎng)部,吉林長春 130041)

目的:觀察利扎曲普坦對偏頭痛模型大鼠行為學(xué)和外周血中疼痛相關(guān)因子的影響,探討曲普坦類藥物對偏頭痛的治療作用。方法:24只健康Wistar大鼠隨機分為空白對照組、偏頭痛組、利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組,每組6只。利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠給予利扎曲普坦灌胃,劑量為1 mg·kg－1·d－1(藥物劑量根據(jù)成人常規(guī)每日口服劑量進(jìn)行換算),空白對照組和偏頭痛組大鼠給予生理鹽水灌胃(1 m L·d－1)。各組大鼠連續(xù)灌胃給藥7 d后,偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠制備硝酸甘油型偏頭痛動物模型,空白對照組和利扎曲普坦對照組給予同劑量生理鹽水,記錄各組大鼠給予藥物(硝酸甘油注射劑/生理鹽水)后60～90 min行為學(xué)表現(xiàn);2 h后處死大鼠,留取外周血,檢測各組大鼠血清降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、5-羥色胺(5-HT)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結(jié)果:與偏頭痛組比較,利扎曲普坦治療組大鼠行為學(xué)評分明顯降低(P＜0.05)。與空白對照組比較,偏頭痛組大鼠外周血中CGRP水平明顯升高(P＜0.05);偏頭痛組大鼠外周血中5-HT水平降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與空白對照組比較,利扎曲普坦對照組大鼠外周血中5-HT水平明顯升高(P＜0.05);與偏頭痛組比較,利扎曲普坦治療組大鼠外周血中5-HT水平明顯升高(P＜0.05);各組大鼠外周血中IL-1β和TNF-α水平無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論:利扎曲普坦能夠減輕硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠行為學(xué)癥狀,使偏頭痛大鼠頭痛發(fā)作期外周血中5-HT水平升高,改善偏頭痛發(fā)作時血管舒縮功能紊亂的狀態(tài),減輕因5-HT耗竭而引起的血管過度擴張。

利扎曲普坦;降鈣素基因相關(guān)肽;5-羥色胺;白細(xì)胞介素1β;腫瘤壞死因子α

目前研究[1-4]表明:偏頭痛發(fā)作時患者外周血中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的水平會發(fā)生不同的變化,而且這些變化可能與偏頭痛的發(fā)生、持續(xù)等有關(guān)。曲普坦類藥物是基于偏頭痛發(fā)病的神經(jīng)血管學(xué)說發(fā)展起來的一類治療偏頭痛的特異性藥物,主要是作用于腦血管壁的5-HT1B/1D受體,收縮偏頭痛發(fā)作時擴張的腦血管,其治療機制是否涉及各種疼痛相關(guān)因子并不明確。本研究建立硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型,觀察利扎曲普坦對硝酸甘油型偏頭痛大鼠行為學(xué)癥狀的影響及其偏頭痛發(fā)作期外周血5-HT、CGRP、IL-1β和TNF-α水平的變化,探討曲普坦類藥物對偏頭痛的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器24只健康SPF 級Wistar大鼠(雌雄各半),體質(zhì)量200～220 g,購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心,動物合格證號:SCXK(吉)2003-001。苯甲酸利扎曲普坦(湖北華源世紀(jì)藥業(yè)有限公司,產(chǎn)品批號:120301),硝酸甘油注射劑(山西康寶生物制品股份有限公司,產(chǎn)品批號:20120216),大鼠CGRP酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、大鼠5-HT酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購自北京綠源博德生物科技有限公司。酶標(biāo)儀(ELX800,美國Bio-Tek公司)。

1.2 動物分組和藥物干預(yù)大鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)第二醫(yī)院動物實驗室,室內(nèi)溫度22～26℃,相對濕度40%～60%,光暗周期12 h,自由攝取充足的水和食物,動物模型制備前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。將24只Wistar大鼠隨機分為4組,每組6只:空白對照組、偏頭痛組、利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組。利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠給予苯甲酸利扎曲普坦灌胃,劑量為1 mg·kg－1·d－1(藥物劑量根據(jù)成人常規(guī)每日口服劑量進(jìn)行換算),空白對照組和偏頭痛組大鼠給予生理鹽水灌胃(1 m L·d－1)。各組大鼠連續(xù)灌胃給藥7 d后,偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠制備硝酸甘油型偏頭痛動物模型。

1.3 硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠臀部皮下注射硝酸甘油注射劑(10 mg·kg－1),制備實驗性偏頭痛動物模型,以給藥大鼠出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多、雙耳發(fā)紅、往返運動增多、咬尾等不適表現(xiàn)為造模成功的指標(biāo)[5]?？瞻讓φ战M和利扎曲普坦對照組大鼠臀部皮下注射生理鹽水0.5 m L。

1.4 實驗動物行為學(xué)表現(xiàn)評分記錄各組大鼠給予藥物(硝酸甘油注射劑/生理鹽水)后60～90 min大鼠撓頭、爬籠、咬尾和往返運動的次數(shù)總和(每個癥狀每出現(xiàn)1次計1分)[6]。

1.5 標(biāo)本采集及檢測指標(biāo)硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備成功2 h后,各組大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉劑量:0.3 m L·100 g－1),右心耳采血(約4 m L),3 000 r·min－1離心10 min,分離并提取血清,－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。檢測各組大鼠血清中CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平,按試劑盒說明書操作,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的吸光度(A)值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SAS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。各組大鼠行為學(xué)評分和血清CGRP、 5-HT、IL-1β、TNF-α水平以±s表示,組間比較采用F檢驗。

2 結(jié)果

2.1 硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備成功率偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠均出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多、雙耳發(fā)紅、往返運動增多和咬尾等不適表現(xiàn),造模成功率為100%。

2.2 各組大鼠行為學(xué)評分空白對照組(7.50± 2.78)和利扎曲普坦對照組(7.92±2.25)大鼠行為學(xué)評分明顯低于偏頭痛組(40.25±9.75)和利扎曲普坦治療組(27.67±9.94)(P＜0.05),偏頭痛組大鼠行為學(xué)評分明顯高于利扎曲普坦治療組(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠血清CGRP水平偏頭痛組大鼠血清CGRP水平明顯高于空白對照組(P＜0.05);利扎曲普坦對照組與空白對照組大鼠血清CGRP水平比較無明顯差異(P＞0.05);偏頭痛組與利扎曲普坦治療組大鼠血清CGRP水平比較無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

2.4 各組大鼠血清5-HT水平利扎曲普坦對照組大鼠血清5-HT水平明顯高于空白對照組和偏頭痛組(P＜0.05);利扎曲普坦治療組大鼠血清5-HT水平明顯高于偏頭痛組(P＜0.05);空白對照組和偏頭痛組大鼠外周血中5-HT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠外周血中5-HT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.5 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平空白對照組、偏頭痛組、利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平Tab.1 Levels of CGRP,5-HT,IL-1β,and TNF-αin serum of rats in varions groups [n＝6,±s,ρB/(mg·L－1)]

表1 各組大鼠血清CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平Tab.1 Levels of CGRP,5-HT,IL-1β,and TNF-αin serum of rats in varions groups [n＝6,±s,ρB/(mg·L－1)]

?P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs migraine group.

Group CGRP 5-HT IL-1βTNF-α Control 39.22±14.37 85.27±31.56 5.80±2.29 169.10±27.60 Migraine 57.34±11.46?59.25±46.71 4.45±2.92 131.80±52.64 Rizatriptan control 41.95±25.28 173.47±67.26?△7.40±3.02 184.38±37.04 Rizatriptan treatment 40.51±25.32 160.32±87.99△7.95±3.54 169.82±58.72

3 討論

硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型對于模擬偏頭痛具有良好的信度和效度[7-9]。耳紅、撓頭、爬籠、咬尾和往返運動是硝酸甘油型偏頭痛大鼠主要的行為學(xué)表現(xiàn)[10-12]。模型大鼠耳紅癥狀與硝酸甘油的擴血管作用有關(guān),因此本文作者在進(jìn)行行為學(xué)計分時并未采納此表現(xiàn)。本研究選擇“爬籠、撓頭、咬尾和往返運動”作為行為學(xué)評分的標(biāo)準(zhǔn)。研究[12]顯示:造模60～90 min內(nèi)模型大鼠行為學(xué)改變較為明顯,且穩(wěn)定,不適癥狀一般在3 h后逐漸消失。本研究對于模型大鼠的行為學(xué)變化觀察時點選擇在硝酸甘油造模后60～90 min,造模2 h時留取標(biāo)本(頭痛期內(nèi))。本研究中行為學(xué)評分結(jié)果顯示:偏頭痛組大鼠行為學(xué)改變最明顯,利扎曲普坦治療組大鼠上述行為學(xué)改變也較為明顯,但明顯輕于偏頭痛組大鼠,2組大鼠行為學(xué)評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,證實利扎曲普坦能夠減輕硝酸甘油型偏頭痛大鼠的行為學(xué)癥狀。偏頭痛發(fā)病機制的三叉神經(jīng)血管學(xué)說[13-14]認(rèn)為:CGRP與偏頭痛的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)。CGRP受體拮抗劑對偏頭痛也有滿意的治療效果[15]。臨床研究[2]發(fā)現(xiàn):偏頭痛發(fā)作時外周血中CGRP水平升高,而且偏頭痛的強度和持續(xù)時間與血中CGRP水平呈正相關(guān)關(guān)系。但也有研究[3]發(fā)現(xiàn):在頭痛期和頭痛緩解期CGRP水平降低或無明顯變化。對于上述情況,學(xué)者們推測與留取血樣標(biāo)本的時機有關(guān):頭痛初期,CGRP由神經(jīng)末梢大量釋放,而頭痛持續(xù)一段時間,CGRP經(jīng)過代謝而減少,因此認(rèn)為外周血中CGRP在偏頭痛發(fā)病過程中存在較大的波動[3]。本研究結(jié)果顯示:硝酸甘油注射劑制備的偏頭痛大鼠模型,在2 h時采血(頭痛發(fā)作期),外周血中CGRP水平升高,進(jìn)一步證實偏頭痛發(fā)作期血清CGRP升高的這一現(xiàn)象;利扎曲普坦給藥組大鼠外周血中CGRP水平與空白對照組比較無明顯改變,說明利扎曲普坦對外周血中CGRP水平無明顯影響。

Nagata等[4]報道:有先兆偏頭痛患者血清5-HT水平明顯降低,而無先兆偏頭痛患者血清5-HT與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,從而認(rèn)為有先兆偏頭痛患者5-HT代謝失調(diào)可能與無先兆偏頭痛患者5-HT的代謝狀態(tài)不同。付秋菊等[16]發(fā)現(xiàn):硝酸甘油型偏頭痛大鼠血清5-HT水平明顯下降,給予實驗藥物痛寧膠囊治療后,血清中5-HT水平明顯升高,從而認(rèn)為此藥是通過升高外周血中5-HT水平以治療偏頭痛。本研究結(jié)果顯示:偏頭痛組大鼠外周血中5-HT水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但有下降趨勢,這可能與樣本量較少有一定的關(guān)系;利扎曲普坦對照組大鼠外周血中5-HT水平明顯高于空白對照組,利扎曲普坦治療組大鼠外周血中5-HT水平明顯高于偏頭痛組,提示利扎曲普坦能夠影響外周5-HT系統(tǒng)的代謝狀態(tài),提高偏頭痛大鼠頭痛發(fā)作期外周血中5-HT水平,減輕因5-HT耗竭而引起的血管過度擴張。

外周血中IL-1β和TNF-α均能夠引起P物質(zhì)、一氧化氮等物質(zhì)增加,進(jìn)而誘發(fā)血管通透性增加、血管舒張、血漿外滲以及肥大細(xì)胞脫顆粒等病理改變[17],引發(fā)疼痛。目前研究[18]認(rèn)為:IL-1β和TNF-α在炎性疼痛和癌癥疼痛過程中起著至關(guān)重要的作用,而本研究并未發(fā)現(xiàn)硝酸甘油型偏頭痛大鼠頭痛發(fā)作期外周血中IL-1β和TNF-α有明顯的異常改變,本文作者推測IL-1β和TNF-α與偏頭痛病理生理過程的關(guān)系可能并不密切,這與偏頭痛的發(fā)病機制有關(guān),偏頭痛的疼痛病理過程有別于炎性疼痛和癌癥疼痛等其他疼痛。

[1]Sarchielli P,Alberti A,Baldi A,等.無先兆偏頭痛患者頸內(nèi)靜脈血中的促炎細(xì)胞因子、黏附分子和淋巴細(xì)胞整合素在頭痛發(fā)作時的表達(dá)[J].世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘:神經(jīng)病學(xué)分冊,2006,2(9):46-47.

[2]Han TH,Blanchard RL,Palcza J,et al.The dose proportionality of telcagepant after administration of single oral and intravenous doses in healthy adult subjects[J].Arch Drug Inf,2010,3(4):55-62.

[3]張志堅,吳秀麗,慕容慎行,等.偏頭痛患者頭痛緩解初期血中CGRP與SP含量觀察[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2000, 6(3):133-135.

[4]Nagata E,Shibata M,Hamada J,et al.Serum 5-hydroxytryptamine(5-HT)in migraine during an attack-free period[J].Headache,2006,46(4):592-596.

[5]Yao G,Man YH,Luo XD,et al.Rizatriptan benzoate influences the endogenous pain modulatory system in a rat model of migraine[J].Neural Regenerat Res,2012, 7(2):131-135.

[6]Hargreaves R.New migraine and pain research[J].Headache,2007,47(Supp 1):S26-43.

[7]Bednarczyk EM,Wack DS,Kassab MY,et al.Brain blood flow in the nitroglycerin(GTN)model of migraine: measurement using positron emission tomography and transcranial Doppler[J].Cephalalqia,2002,22(9):749-757.

[8]章正祥,曹克剛,高永紅.從臨床到基礎(chǔ):硝酸甘油實驗性偏頭痛大鼠模型信度和效度評價[J].中國實驗動物學(xué)報, 2009,17(4):312-314.

[9]Yao DY,Sessle BJ.Nitroglycerin facilitates calcitonin generelated peptide-induced behavior[J].Neuroreport,2008, 19(13):1307-1311.

[10]付先軍,宋旭霞,周永紅,等.硝酸甘油型實驗性偏頭痛大鼠模型行為癥狀學(xué)評價[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2005, 4(5):449-451.

[11]鐘榮玲,黃厚才,楊德功,等.鼻噴霧劑對硝酸甘油所致偏頭痛大鼠模型行為癥狀的影響[J].實驗動物科學(xué),2009, 26(4):20-22.

[12]Yao G,Luo XD,Ma DH,et al.Midbrain enkephalin expression in a rat migraine model following intragastric scorpion powder administration[J].Neural Regenerat Res, 2011,6(12):903-907.

[13]Brain SD,Grant AD.Vascular actions of calcitonin generelated peptide and adrenomedullin[J].Physiol Rev,2004, 84(3):903-934.

[14]Theoharides TC,Donelan J,Kandere-Grzybowska K,et al.The role of mast cells in migraine pathophysiology[J].Brain Res Brain Res Rev,2005,49(1):65-76.

[15]Yao G,Yu TM,Han XM,et al.Therapeutic effects and safety of olcegepant and telcagepant for migraine:A Metaanalysis[J].Neural Regenerat Res,2013,8(10):938-947.

[16]付秋菊,楊德功,黃厚才,等.痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛大鼠血清NO和5-HT濃度的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2011,9(9):1096-1098.

[17]朱博馳,姚 剛,于挺敏.頭痛寧膠囊對偏頭痛大鼠中腦P物質(zhì)m RNA表達(dá)的影響[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2012, 18(10):623-628.

[18]黃宇光,徐建國.神經(jīng)病理學(xué)疼痛臨床診療學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010.

Effects of rizatriptan on behavior and pain-related cytokines in peripheral blood of rat models with nitroglycerin-type migraine

YAO Gang1,HAO Ting-ting2,LUO Xiang-dan3,YU Ting-min1
(1.Department of Neurology,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China;2.Department of Nuclear Medicine,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China;3.Department of Nutrition, Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China)

ObjectiveTo observe the influence of rizatriptan on the behavior and pain-related cytokines in peripheral blood of the migraine model rats,and to investigate the theraputic effect of rizatriptan on migraine.MethodsA total of 24 rats were randomly divided into:control group,migraine group,rizatriptan control group and rizatriptan treatment group.The rats in rizatriptan control and rizatriptan treatment groups were intragastrically perfused with rizatriptan,1 mg·kg－1per day(according to the adult daily dose),and the rats in control andmigraine groups were perfused with normal saline,1 m L per day.After 7 d,nitroglycerin was subcutaneously injected into the buttocks of the rats in rizatriptan treatment and migraine groups to induce migraine.Normal saline was injected into the rats in control and rizatriptan control groups.At 60－90 min following nitroglycerin injection, the total number of behavioral symptoms was measured.The serum calcitonin gene-related peptide(CGRP),5-hydroxytryptamine(5-HT),interleukin-1β(IL-1β),and tumor necrosis factor-α(TNF-α)levels were determined using ELISA.ResultsCompared with migraine group,the behavioral score of the rats in rizatriptan treatment group was significantly decreased(P＜0.05).The serum CGRP level of the rats in migraine group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).Compared with control group,the serum 5-HT level of the rats in and migraine group was decreased,but there was no significant differece(P＞0.05);the serum 5-HT level in rizatriptan control group was significantly increased(P＜0.05).The serum 5-HT level of the rats in rizatriptan treatment group was significantly increased compared with migraine group(P＜0.05).The serum IL-1βand TNF-α levels of the rats in varions groups had no significant differences(P＞0.05).ConclusionRizatriptan can relieve the behavior symptoms in nitroglycerin-induced migraine model rats,increase the serum 5-HT level,improve the vasomotor disturbance,and relieve the angiectasis.

rizatriptan;calcitonin gene-related peptide;5-hydroxytryptamine;interleukin-1β;tumor necrosis factor-α

R747.2;R-332

A

2014-01-02

吉林省衛(wèi)生廳青年科研基金資助課題(2013Q020);吉林大學(xué)白求恩青年科研基金資助課題(2013206044)

姚 剛(1983－),男,陜西省勉縣人,主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士,主要從事慢性頭痛的基礎(chǔ)與臨床研究。

于挺敏(Tel:0431-88796298;E-mail:ytm_396＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0981-04

10.13481/j.1671-587x.20140515