王登莉,周 莉,于 升,吳 江,趙 慧

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,吉林長春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春 130021)

不同濃度dbcAMP對SH-SY5Y細胞向γ-氨基丁酸能神經(jīng)元分化潛能的影響

王登莉1,周 莉1,于 升1,吳 江2,趙 慧1

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,吉林長春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春 130021)

目的:建立具有分化成γ-氨基丁酸能神經(jīng)元潛能的神經(jīng)干細胞模型,為γ-氨基丁酸能神經(jīng)元退行性疾病的研究提供適宜的研究載體。方法:應(yīng)用雙丁酰環(huán)腺苷酸(dbc AMP)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞),分為0 mmol·L－1dbc AMP組(對照組)和0.3、0.6、1.0及2.0 dbc AMP組,觀察誘導(dǎo)后各組SH-SY5Y細胞的形態(tài)變化;采用Imge-Pro Plus 5.0軟件測量神經(jīng)元樣細胞神經(jīng)突起長度,計算神經(jīng)突起＞30μm細胞所占細胞總數(shù)的百分率;采用免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)檢測γ-氨基丁酸能神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白——谷氨酸脫羧酶65 (GAD65)的表達,并計算其免疫反應(yīng)陽性率。結(jié)果:形態(tài)學(xué)觀察,對照組SH-SY5Y細胞呈多邊形、圓形或梭型,胞膜光滑,邊界清晰;各濃度dbc AMP組隨著dbc AMP濃度的增加和誘導(dǎo)時間的延長,SH-SY5Y細胞胞體變小、突起變長;1.0 mmol·L－1dbc AMP組細胞互相交織,表現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的表型。SH-SY5Y細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后,與對照組(31.4%±4.2%)比較,0.3、0.6、1.0和2.0 dbc AMP組神經(jīng)突起＞30μm細胞所占細胞總數(shù)的百分率(40.1%±5.7%、47.5%±6.2%、73.1%±3.2%和74.3%±6.1%)明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。SH-SY5Y細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后,與對照組(10.2%±2.1%)比較,0.3、0.6、1.0和2.0 dbc AMP組GAD65陽性細胞表達率(22.1%±2.4%、46.9%±3.2%、70.7%±3.4%和72.3%±3.7%)明顯升高(P＜0.05 或P＜0.01)。結(jié)論:SH-SY5Y細胞具有分化為γ-氨基丁酸能神經(jīng)元樣細胞的潛能,1.0 mmol·L－1是dbc AMP的最佳誘導(dǎo)濃度。

雙丁酰環(huán)磷腺苷;人神經(jīng)母細胞瘤細胞;誘導(dǎo);分化

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器SH-SY5Y細胞購自美國典型培養(yǎng)物細胞庫(American Type Culture Collection,ATCC)。小鼠抗人谷氨酸脫羧酶65 (GAD65)單克隆抗體購自Santa Cruz公司,驢抗小鼠Alexa Fluor 488和DAPI購自美國Invitrogen公司,dbc AMP購自美國Sigma公司,低糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自杭州四季青生物工程公司,胰蛋白酶購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。熒光倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品(IX71),CO2培養(yǎng)箱為日本Sanyo公司產(chǎn)品(MCO-175),超凈工作臺為蘇凈集團安泰公司產(chǎn)品(SW-CJ-1F)。

1.2 細胞傳代培養(yǎng)SH-SY5Y細胞采用含10% FBS、60 mg·L－1青霉素及100 mg·L－1鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液,在5%CO2、37℃飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細胞長到90%融合時,用0.25%的胰蛋白酶消化,以1∶3或1∶4傳代,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞分組和誘導(dǎo)將SH-SY5Y細胞按1× 104/孔的密度接種于放置了蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中。為了減少FBS對dbc AMP誘導(dǎo)分化作用的干擾,在誘導(dǎo)實驗中將培養(yǎng)基中FBS的濃度降低為0.5%。細胞共分為5組,每組設(shè)3個復(fù)孔,均用含0.5%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),包括0 mmol·L－1dbc AMP組(對照組)和0.3、0.6、1.0及2.0 mmol·L－1dbc AMP組,將24孔培養(yǎng)板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天于倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況并拍照。dbc AMP誘導(dǎo)72 h后,取出細胞爬片進行免疫熒光細胞化學(xué)染色。

1.4 神經(jīng)細胞突起長度測量神經(jīng)元樣細胞神經(jīng)突起長度的測量方法參照文獻[7-8]。以細胞核中心為測量起點,突起末端為終點,使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量神經(jīng)突長度,長度＜30μm的突起忽略不計。根據(jù)各視野下標(biāo)尺的測量長度,計算各神經(jīng)突起的實際長度,并計算出各組細胞神經(jīng)突起的平均長度。

1.5 免疫熒光細胞化學(xué)染色和免疫陽性細胞計數(shù)將各組細胞用冷丙酮固定后,0.01 mol·L－1PBS(p H 7.2)沖洗細胞;5%驢血清室溫封閉30 min,滴加小鼠抗人GAD65單克隆抗體(效價1∶25)于4℃孵育過夜(陰性對照組用PBS代替GAD65一抗);0.01 mol·L－1PBS沖洗后,避光滴加熒光標(biāo)記的驢抗小鼠Alexa Fluor 488抗體(效價1∶500),于37℃孵育50 min;0.01 mol·L－1PBS沖洗,DAPI(工作濃度為1 mg·L－1)滴染細胞核5 min,0.01 mol·L－1PBS沖洗;甘油磷酸緩沖液封片后熒光顯微鏡觀察、拍照并計數(shù)。20倍物鏡下,每個樣品隨機選取10個視野,分別計算每個視野下的GAD65免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。各組細胞神經(jīng)突起的長度和神經(jīng)突起＞30μm細胞數(shù)的百分率以±s表示,組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 dbc AMP誘導(dǎo)后SH-SY5Y細胞形態(tài)學(xué)對照組SH-SY5Y細胞培養(yǎng)48或72 h時細胞呈多邊形、圓形或梭型,胞膜光滑,邊界清晰。各濃度dbc AMP組細胞培養(yǎng)24 h時可見細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞兩端開始伸出短小的樹突樣突起。48 h 時0.3 mmol·L－1dbc AMP組只有少數(shù)短突起; 0.6 mmol·L－1dbc AMP組突起增多但突起較短,突起交織現(xiàn)象少;1.0 mmol·L－1dbc AMP組細胞兩端出現(xiàn)長而細的軸突樣突起,并相互交織連接。隨著dbc AMP誘導(dǎo)時間的延長,各濃度dbc AMP組細胞形態(tài)變化均很明顯,誘導(dǎo)72 h時1.0 mmol·L－1dbc AMP組越來越多的細胞突起變長,細胞相互交織現(xiàn)象更明顯,表現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的表型,且細胞的平均神經(jīng)突起長度也隨著dbc AMP濃度的增加而變長。見圖1。

在誘導(dǎo)72 h時,1.0 mmol·L－1dbc AMP組突起＞30μm的細胞數(shù)占細胞總數(shù)的(73.1± 3.2)%,與對照組[(31.4±4.2)%]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);神經(jīng)突起平均長度為(98.37±4.57)μm,與對照組[(41.77±4.58)μm]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。2.0 mmol·L－1dbc AMP組神經(jīng)突起平均長度增加,達到(112.86±5.25)μm,突起＞30μm的細胞所占比例為(74.3±6.1)%,與1.0 mmol·L－1dbc AMP組比較無明顯變化(P＞0.05)(表2),并且同一放大倍數(shù)視野下細胞總數(shù)減少。group;E,F:0.6 mmol·L－1dbc AMP group;G,H:1.0 mmol·L－1dbc AMP group;I,J:2.0 mmol·L－1dbc AMP group.“→”:Long neurites after dbc AMP induction;Bar＝50μm.

圖1 各組SH-SY5Y細胞形態(tài)學(xué)Fig.1 Morphology of SH-SY5Y cells in various groupsA,C,E,G,I:48 h after dbc AMP treatment;B,D,F,H,J:72 h after dbc AMP treatment;A,B:Control group;C,D:0.3 mmol·L－1dbc AMP

表1 各組SH-SY5Y細胞神經(jīng)突起的平均長度Tab.1 Average lengths of neurites of SH-SY5Y cells in various groups(n＝3,±s,l/μm)

表1 各組SH-SY5Y細胞神經(jīng)突起的平均長度Tab.1 Average lengths of neurites of SH-SY5Y cells in various groups(n＝3,±s,l/μm)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs control group.

Group Average length of neurite (t/h) 48 72 Control 41.43±4.66 41.77±4.58 dbc AMP(mmol·L－1) 0.3 53.61±6.91?70.11±6.26?0.6 70.17±7.25?80.61±7.10?1.0 84.02±7.83??98.37±7.83??2.0 104.53±8.22??112.86±8.50??

表2 各組神經(jīng)突起＞30μm細胞占總細胞數(shù)的百分率Tab.2 Percentages of cells with neurites longer than 30μm in various groups(n＝3,±s,η/%)

表2 各組神經(jīng)突起＞30μm細胞占總細胞數(shù)的百分率Tab.2 Percentages of cells with neurites longer than 30μm in various groups(n＝3,±s,η/%)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs control group.

Group Percentage of cells with neurites＞30μm (t/h) 48 72 Control 10.32±3.56 31.46±4.22 dbc AMP(mmol·L－1) 0.3 37.23±4.79?40.17±5.77?0.6 42.72±4.44?45.53±6.23?1.0 62.46±3.44??73.16±3.22??2.0 72.64±5.77??74.33±6.11??

2.2 免疫熒光細胞化學(xué)染色及免疫陽性細胞計數(shù)

通過免疫熒光細胞化學(xué)染色鑒定γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的標(biāo)志物GAD65的表達,陽性產(chǎn)物被熒光標(biāo)記的抗體染成綠色,分布在細胞膜上,而陰性對照(即2.0 mmol·L－1dbc AMP組染色過程中未加GAD65一抗)僅有細胞核被DAPI染成藍色,細胞膜上無特異性染色。0.3 mmol·L－1dbc AMP 組GAD65陽性細胞數(shù)量少,陽性率為(22.1± 2.40)%;0.6 mmol·L－1dbc AMP組GAD65陽性細胞數(shù)增多,陽性率達到(46.9±3.2)%; 1.0 mmol·L－1dbc AMP組陽性細胞率高達(70.7±3.4)%,與對照組[(10.2±2.1)%]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);2.0 mmol·L－1dbc AMP組GAD65陽性細胞率為(72.3± 3.7)%,與1.0 mmol·L－1dbc AMP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2(插頁一)。

3 討論

γ-氨基丁酸能神經(jīng)元是人類大腦發(fā)生過程中基本神經(jīng)元類型,包括抑制性神經(jīng)元和興奮性神經(jīng)元,前者屬中間神經(jīng)元,釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸,參與形成局部抑制回路[9]。在胚胎神經(jīng)干細胞和成體神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)時,如果只加入血清不加入任何其他誘導(dǎo)因素,神經(jīng)干細胞分化的神經(jīng)元均為γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,該現(xiàn)象提示γ-氨基丁酸能神經(jīng)元是神經(jīng)干細胞自然分化的產(chǎn)物。本實驗選擇的分化誘導(dǎo)劑為細胞本身就存在的第二信使c AMP的衍生物dbc AMP,檢測細胞分化的標(biāo)志性蛋白為γ-氨基丁酸能神經(jīng)元產(chǎn)生γ-氨基丁酸的限速酶GAD65,以此探討SH-SY5Y細胞系是否具有神經(jīng)干細胞特性和能否成為人神經(jīng)干細胞模型。

由于SH-SY5Y細胞能夠在體外長期培養(yǎng),通過誘導(dǎo)分化可使細胞形態(tài)接近成熟神經(jīng)元,在實驗中提供穩(wěn)定的細胞數(shù),具有許多神經(jīng)元的生化和生理特征而被作為實驗性神經(jīng)科學(xué)研究的神經(jīng)元細胞模型[10]。SH-SY5Y細胞形態(tài)學(xué)改變是其細胞分化的表性特征,形態(tài)學(xué)的成熟程度是判斷分化誘導(dǎo)成功與否的重要標(biāo)志。細胞形態(tài)分化成熟的標(biāo)準(zhǔn)為有1個或1個以上的突起長度延伸至胞體直徑2倍以上[11];神經(jīng)元細胞的神經(jīng)突起長度的測量方法參照Neumann等[7]和Li等[8]的報道,長度＜30μm的突起忽略不計。本研究結(jié)合這2種標(biāo)準(zhǔn),較為準(zhǔn)確地對分化后的細胞進行了系統(tǒng)的測量。本實驗結(jié)果表明:一定濃度dbc AMP可誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變,隨著誘導(dǎo)劑濃度的逐漸增加,SH-SY5Y細胞從最初的多邊形、圓形或梭型逐漸演變?yōu)橛休^長細胞突起的形態(tài),這些突起逐漸伸長并相互交織成網(wǎng),最長的突起可達120μm,約為細胞體直徑的6倍。Dodurga等[12]發(fā)現(xiàn): SH-SY5Y細胞在10 mmol·L－1RA誘導(dǎo)第3天出現(xiàn)神經(jīng)突起,并隨著誘導(dǎo)時間的延長,神經(jīng)突起隨之變長,呈現(xiàn)出神經(jīng)元表型。上述結(jié)果表明SH-SY5Y細胞在一定誘導(dǎo)條件下具有分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能。

誘導(dǎo)劑的種類、濃度及作用時間是成功誘導(dǎo)分化干細胞的重要因素。c AMP是細胞內(nèi)第2信使,其不僅在調(diào)節(jié)新陳代謝過程中起到很重要的作用,而且能夠改變細胞形態(tài),影響細胞分化。體外實驗中,c AMP衍生物dbc AMP可以滲透到細胞內(nèi),提高細胞內(nèi)c AMP水平,從而模擬體內(nèi)某種刺激,所以本實驗選擇dbc AMP為SH-SY5Y細胞分化的誘導(dǎo)劑[13]。本研究結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度dbc AMP處理后,光學(xué)顯微鏡下可見SH-5Y5Y細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化,細胞喪失了未分化的腫瘤細胞形態(tài);當(dāng)dbc AMP濃度為1.0 mmol·L－1時,細胞胞體明顯變小,而且伸出長突起,具有類似神經(jīng)元的形態(tài);而0.3和0.6 mmol·L－1dbc AMP作用下胞體未見明顯變化。

2.0 mmol·L－1dbc AMP誘導(dǎo)下,SH-SY5Y細胞神經(jīng)突起長度及GAD65陽性細胞率與1.0 mmol·L－1dbc AMP組比較無明顯改變,并且細胞總數(shù)減少,說明高濃度dbc AMP對細胞生長有毒副作用。因此本研究最終確定1.0 mmol·L－1是dbc AMP的最佳誘導(dǎo)濃度。

γ-氨基丁酸能神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白GAD有2種同工酶,根據(jù)其相對分子質(zhì)量的不同分為GAD65 和GAD67。在神經(jīng)系統(tǒng)中,GAD65和GAD67通常存在于相同的γ-氨基丁酸能神經(jīng)元內(nèi),但分別由不同的基因編碼,在含量和亞細胞分布上存在差異[14]。本研究采用GAD65標(biāo)記γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,通過免疫熒光細胞化學(xué)染色,熒光顯微鏡下可見GAD65表達部位位于細胞膜上。

綜上所述,SH-SY5Y細胞能夠成為人神經(jīng)干細胞模型,其具有神經(jīng)干細胞特性,在一定條件下可分化為γ-氨基丁酸能神經(jīng)元。本實驗結(jié)果為探討胚胎神經(jīng)干細胞定向分化的分子機制提供了適宜的研究載體。

[1]Manabe T,Tatsumi K,Inoue M.L3/Lhx8 is involved in the determination of cholinergic or GABAergic cell fate[J].J Neurochem,2005,94(3):723-730.

[2]Kume T,Kawato Y,Osakada F,et al.Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype[J].Neurosci Lett,2008,443(3):199-203.

[3]Cernaianu G,Brandmaier P,Scholz G,et al.All-trans retinoic acid arrests neuroblastoma cells in a dormant state.Subsequent nerve growth factor/brain derived neurotrophic factor treatment adds modest benefit[J].J Pediatr Surg, 2008,43(7):1284-1294.

[4]P?hlman S,Odelstad L,Larsson E,et al.Phenotypic changes of human neuroblastoma cells in culture induced by 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate[J].Int J Cancer, 1981,28(5):583-589.

[5]Singh J,Kaur G.Transcriptional regulation of polysialylated neural cell adhesion molecule expression by NMDA receptor activation in retinoic acid-differentiated SH-SY5Y neuroblastoma cultures[J].Brain Res,2007,1154(18): 8-21.

[6]Haoming L,Guohua J,Peipei Z,et a1.Upregulation of Lhx8 increase VACh T expression and ACh release inneuronal cell line SHSY5Y[J].Neurosci Lett,2014,559(1):184-188.

[7]Neumann S,Bradke F,Tessier-Lavigne M,et al.Regeneration of sensory axons within the injured spinal cord induced by intraganglionie c AMP elevation[J].Neumn, 2002,34(6):885-983.

[8]Li W,Walus L,Rabaeehi SA,et al.A neutralizing anti-Nogo66 receptor monoclonal antibody reverses inhibition of neurite outgrowth by central nervous system myelin[J].J Biol Chem,2004,279(42):43780-43788.

[9]Hughes LF,Turner JG,Parrish JL,et al.Processing of broadband stimuli across A1 layers in young and aged rats[J].Hear Res,2010,264(1/2):79-85.

[10]Ciccarone V,Spengler BA,Meyers MB,et al.Phenotypic diversification in human neuroblastoma cells:expression of distinct neural crest lineages[J].Cancer Res,1989, 49(1):219-225.

[11]Xie HR,Chang M,Zhang YH,et al.The study of differentiation of SH-SY5Y cells induced by two methods[J].Prog Modern Biomed,2011,11(1):63-67.

[12]Dodurga Y,Gundogdu G,Koc T,et al.Expression of URG4/URGCP,Cyclin D1,Bcl-2,and Bax genes in retinoic acid treated SH-SY5Y human neuroblastoma cells[J].Contemp Oncol,2013,17(4):346-349.

[13]Abraham W,Theodore T.Morphological transformation of Chinese hamster cells by dibutyryl adenosine cyclic 3′:5′-monophosphate and testosterone[J].Proc Natl Acad Sci USA,1971,68(2):358-361.

[14]Abbott S,Hugues LF,Bauer CA,et al.Detection of glutamate decarboxylase isoforms in rat inferior colliculus following acoustic exposure[J].Neuroscience,1999, 93(4):1375-1381.

Influence of different concentrations of dbc AMP in differentiation potentiality of SH-SY5Y cells to GABAergic-like cells

WANG Deng-li1,ZHOU Li1,YU Sheng1,WU Jiang2,ZHAO Hui1
(1.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Department of Neurology,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo establish a nerve stem cell model possessing the potentiality of differentiating into γ-aminobutyric acid neuron-like cells(GABAergic-like cells),and provide eligible investigative vector for study on GABAergic neurons degenerative diseases.Methods Dibutyryl cyclic adenosine monophosphate(dbc AMP)was applied to induce human neuroblastoma SH-SY5Y cells,and the SH-SY5Y cells were divided into control group (0 mmol·L－1dbc AMP),0.3 mmol·L－1dbc AMP group,0.6 mmol·L－1dbc AMP group,1.0 mmol·L－1dbc AMP group and 2.0 mmol·L－1dbc AMP group;the morphological changes of SH-SY5Y cells were observed.The Image-Pro Plus 5.0 software was used to measure the length of neurites of the neuron-like cells,and the percentage of the SH-SY5Y cells with neurites longer than 30μm was calculated.The immunofluorescence cytochemistry technique was utilized to test GAD65 positive cells,and the positive rate of immune response was calculated.ResultsThe results of light microscope observation showed that the cells in control group were polygonal,circular or shuttle type with smooth membrane and clear boundaries.With the increasing of the concentrations of dbc AMP and the prolongation of time,the morphology of SH-SY5Y cells’bodies became smaller with longer processes in dbc AMP groups.The cells interwined each other and showed mature neuron phenotype in 1.0 mmol·L－1dbc AMP group.Compared with control group(31.4%±4.2%),the percentages of the cell with neurites longer than 30μm in 0.3,0.6,1.0,and 2.0 dbc AMP groups(40.1%±5.7%,47.5%±6.2%, 73.1%±3.2%,and 74.3%±6.1%)72 h after induction were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01).Compared with control group(10.2%±2.1%),the GAD65 positive expression rates in 0.3,0.6,1.0,and 2.0 mmol·L－1,dbc AMP groups(22.1%±2.4%,46.9%±3.2%,70.7%±3.4%,and 72.3%±3.7%)72 h after induction were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionThe SH-SY5Y cells have the potentiality of differentiating into GABAergic-like cells,and 1.0 mmol·L－1is the optimal concentration of dbc AMP.

dibutyryl cyclic adenosine monophosphate;human neuroblastoma cells;induction;differentiation神經(jīng)干細胞研究多使用小鼠神經(jīng)母細胞瘤(N2A細胞株)作為細胞模型[1],但在研究人胚胎神經(jīng)干細胞時,N2A細胞株有一定的局限性,因為小鼠遺傳學(xué)特征與人類相比有一定差異,尤其是在基因重組研究中不能互為替代,因此尋找一個有神經(jīng)干細胞特征、適合于研究人胚胎神經(jīng)干細胞定向分化的細胞模型尤為重要。人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y來源于不成熟的腫瘤性神經(jīng)嵴細胞,具有干細胞特性,是研究神經(jīng)細胞終末分化的重要細胞模型。雙丁酰環(huán)磷腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate,dbc AMP)[2]、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)[3]、佛波醇酯(tetradecanoyl phorbolacetate,TPA)[4]和維甲酸(retinoic acid, RA)[5]均能誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞分化。在RA和BDNF共存的情況下,SH-SY5Y細胞具有向膽堿能神經(jīng)元分化的表型[6]。但SH-SY5Y細胞能否分化為γ-氨基丁酸能神經(jīng)元類型,目前尚未見報道。本研究采用不同濃度dbc AMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞,應(yīng)用免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)檢測SH-SY5Y細胞向γ-氨基丁酸能神經(jīng)元分化的潛能,為建立一種適合于研究人類神經(jīng)干細胞定向分化分子機制的細胞模型提供實驗依據(jù)。

R741

A

2013-11-22

國家自然科學(xué)基金資助課題(81171219);吉林大學(xué)211工程項目資助課題(2010)

王登莉(1987－),女,江蘇省南通市人,在讀醫(yī)學(xué)碩士,主要從事神經(jīng)干細胞研究。

趙 慧(Tel:0431-85619477,E-mail:zhaohui＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-0933-05

10.13481/j.1671-587x.20140505