趙朝華,吳樹強,茍興春,米亞靜,楊吉平,史利利,成娟娟

(1.西安醫(yī)學院人體解剖學教研室,陜西西安 710021;2.西安醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科,陜西西安 710077; 3.西安醫(yī)學院基礎與轉化研究所,陜西西安 710021)

姜黃素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中NO和S100β水平的影響

趙朝華1,吳樹強2,茍興春3,米亞靜3,楊吉平1,史利利1,成娟娟1

(1.西安醫(yī)學院人體解剖學教研室,陜西西安 710021;2.西安醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科,陜西西安 710077; 3.西安醫(yī)學院基礎與轉化研究所,陜西西安 710021)

目的:觀察姜黃素對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中一氧化氮(NO)和S100β水平的影響,探討姜黃素對缺血性腦損傷保護作用的機制。方法:成年SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和姜黃素處理組,每組24只。采用線栓法阻斷大腦中動脈(MCAO)2 h誘導建立暫時性局部腦缺血模型,姜黃素處理組大鼠術前連續(xù)3 d給予腹腔注射姜黃素溶液,于腦缺血再灌注后24和72 h采用TTC染色觀察腦梗死體積,硝酸還原酶法和ELISA法分別檢測各組大鼠腦組織中NO和S100β水平。結果:與模型組比較,姜黃素處理組大鼠腦缺血再灌流24和72 h時腦梗死體積明顯減小(P＜0.05)。與假手術組比較,模型組大鼠腦缺血再灌注24和72 h時腦組織中NO和S100β水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較,姜黃素處理組大鼠腦缺血再灌注24和72 h時腦組織中NO水平明顯降低(P＜0.05),腦缺血再灌注72 h時腦組織S100β水平明顯降低(P＜0.05)。結論:姜黃素能明顯減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的程度,降低腦組織中NO和S100β水平,提示腦組織中NO和S100β水平降低可能與姜黃素的神經(jīng)保護作用有關。

姜黃素;腦缺血再灌注;一氧化氮;S100β

在腦缺血再灌注損傷中一氧化氮(NO)既有擴張血管、改善缺血組織血供、抑制血小板凝集和減輕缺血再灌注損傷的作用[1],又有介導和加重缺血再灌注損傷的毒性作用[2],劑量不同作用效果不同。腦內S100β水平的改變亦是腦缺血損傷的重要病理學變化[3]。腦內S100β表達水平與梗死體積呈同步變化;血清S100β水平的升高與腦缺血后神經(jīng)組織損傷程度的進程有密切關聯(lián),S100β水平的升高是引發(fā)腦細胞進一步損傷的重要原因,對缺血損傷的發(fā)展和轉歸有著重要的影響[4],且NO和S100β之間有著密切的聯(lián)系[5]。研究[6]顯示:姜黃素(curcumin)作用于腦缺血的損傷過程可發(fā)揮保護神經(jīng)作用,但機制并不明確。姜黃素對于腦缺血再灌注后NO和S100β這2種重要分子的影響迄今未見報道。本研究通過姜黃素預處理后建立大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型,研究腦缺血再灌注損傷后腦組織中NO和S100β水平的變化,探討姜黃素對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑72只健康雄性SD大鼠(SPF級)由第四軍醫(yī)大學動物中心提供,動物許可證號:SYXK(陜2008-004),鼠齡8～12周,體質量240～280 g,實驗前常規(guī)環(huán)境分籠飼養(yǎng)至少7 d。S100βELISA試劑盒(第四軍醫(yī)大學生理學教研室提供),S100β單克隆抗體和S100β多克隆抗體均由武漢博士德公司提供。姜黃素購自美國Sigma公司。

1.2 動物分組及模型復制動物隨機分為假手術組、模型組和姜黃素組,每組24只。姜黃素組大鼠于造模前連續(xù)3 d腹腔注射75 mg·kg－1姜黃素溶液(0.1 g·L－1,生理鹽水溶解)1次,模型組(n＝24)給予等體積生理鹽水。參考Longa等[7]描述的管腔內線栓技術閉塞右側大腦中動脈(MACO)誘導建立暫時性局部腦缺血大鼠模型。模型制備:大鼠給予10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉,做頸部前正中切口,分離暴露右側頸部血管,用微動脈夾暫時夾閉頸總動脈和頸內動脈,將一端加熱呈光滑球形的3-0尼龍線(寧波醫(yī)用縫線廠)經(jīng)頸外動脈插入頸內動脈至感到有輕微阻力為止,進線長約18 mm。栓塞2 h后輕輕抽出尼龍線至頸外動脈切口處。手術期間使用電熱毯維持大鼠體溫在36.5℃～37.5℃。大鼠分別存活24和72 h。假手術組大鼠只分離血管,不插尼龍線。常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)。MCAO后2 h參照Bederson等[8]方法進行神經(jīng)功能損傷程度的評定,0級:行為正常;1級:提尾懸空左側前肢屈曲,肩內收;2級:抵抗對側推力下降,伴前肢屈曲;3級:自發(fā)性側向旋轉運動,伴抵抗對側推力下降和前肢屈曲。評定為3級者視為成功腦缺血模型,用于后續(xù)實驗。

1.3 腦組織液制備各組于再灌注24和72 h時分別取6只大鼠,水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后,斷頭取腦,用冷生理鹽水沖洗,去除腦膜、小腦,稱質量后,制成10%勻漿。15 000 r·min－1離心30 min取上清液,待檢。所有操作在4℃下完成。

1.4 腦梗死體積測定各組分別于再灌注24和72 h時處死6只大鼠,斷頭取腦,－20℃冷凍10 min后,行2 mm厚冠狀切片,將切片立即置于預熱的2%TTC中,于37℃恒溫下避光染色30 min,而后置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12 h,照相輸入計算機。梗死體積百分比＝(對側正常組織容積－同側正常組織容積)/對側正常組織容積×100%。

1.5 腦組織中NO和S100β水平測定將所得腦組織提取液置于721 nm分光光度計,利用硝酸還原酶法呈色,讀取吸光度(A)值,計算NO水平。所得腦組織提取液通過雙抗體夾心ELISA法檢測S100β水平,按S100βELISA試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。各組大鼠腦梗死體積、NO和S100β水平以x ±s表示,組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠腦梗死體積腦缺血再灌注24 h時TTC染色顯示:模型組大鼠未梗塞側半球正常腦組織呈現(xiàn)鮮紅色,而在栓塞側半球大腦中動脈(MCA)供血區(qū)出現(xiàn)大面積明顯的未被染色的白色缺血梗死區(qū),最大梗死面積主要出現(xiàn)在前囟前和后3 mm之間的部位,梗死區(qū)涉及到額葉、頂葉和顳葉的上外側皮質以及尾殼核等結構。腦缺血24 h 時,姜黃素組大鼠平均腦梗死體積百分比為(10.81±3.92)%,模型組為(19.03±5.74)%,與模型組比較姜黃素組腦梗死體積明顯減小(P＜0.05)。腦缺血72 h時,模型組大鼠腦梗死體積進一步擴大,姜黃素組腦梗死體積百分比為(17.34± 4.71)%,明顯小于模型組(25.98%±4.97%) (P＜0.05)。見圖1(插頁一)。

2.2 各組大鼠腦組織中NO水平與假手術組比較,腦缺血再灌注24 h時,模型組和姜黃素組大鼠腦組織中NO水平升高(P＜0.05);72 h時姜黃素組和模型組大鼠腦組織NO水平升高更為顯著(P＜0.05),但是姜黃素組大鼠腦組織中NO水平在腦缺血再灌注24和72 h后均顯著低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織中NO和S100β水平Tab.1 Levels of NO and s100βin brain tissue of rats in various groups(n＝6,±s)

表1 各組大鼠腦組織中NO和S100β水平Tab.1 Levels of NO and s100βin brain tissue of rats in various groups(n＝6,±s)

?P＜0.05 vs sham operation group;△P＜0.05 vs model group.

Group NO[cB/(μmol·L－1)]S100β[ρB/(μg·L－1)] (t/h) 24 7224 72 Sham operation 17.68±1.89 16.97±2.76 6.68±0.09 6.67±1.36 Model 22.34±3.38?28.56±2.96?8.34±1.38?10.57±1.46?Curcumin 18.45±2.08?△24.71±2.84?△7.41±1.98?8.79±1.24?△

2.3 各組大鼠腦組織中S100β水平與假手術組比較,大鼠腦缺血再灌注24 h時模型組和姜黃素組大鼠腦組織中S100β水平升高(P＜0.05),至72 h時2組S100β水平明顯升高(P＜0.05)。在腦缺血再灌注72 h時姜黃素組大鼠腦組織中S100β水平明顯低于模型組(P＜0.05)。見表1。

3 討論

本研究結果顯示:姜黃素預處理后大鼠腦缺血再灌注后的梗死體積明顯減少,與以往研究[6,9]結果一致,證明了姜黃素對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。腦缺血再灌注后腦組織中NO水平在24和72 h持續(xù)升高;姜黃素預處理后,腦缺血再灌注后同一時間點腦組織中NO水平明顯降低。腦缺血再灌注24 h時腦組織中S100β水平略有升高, 72 h時顯著升高,與NO水平升高亦有一定平行關系,而姜黃素預處理后腦缺血再灌注72 h時腦組織中S100β水平與模型組比較顯著降低。

有研究[10]證實:過量的NO具有神經(jīng)毒性作用,可以抑制核糖核苷酸還原酶或與細胞中含鐵酶類結合形成NO-鐵復合物,抑制細胞代謝,甚至導致細胞死亡,還可以與超氧陰離子O2－反應生成亞硝?；庪x子(ONOO－),而后也可生成OH－和NO2,直接攻擊膜性結構。研究[6,11]證實:創(chuàng)傷區(qū)NO增多,神經(jīng)毒性增強可能是神經(jīng)細胞死亡的重要原因之一。本實驗結果顯示:腦缺血24 h時大鼠腦組織中NO水平已明顯升高,之后持續(xù)升高,至72 h NO升高至2倍。隨著NO水平升高大鼠腦梗死體積也在擴大。而過多的NO可能通過以上機制在腦缺血再灌注后期發(fā)揮著加重腦損傷的作用。姜黃素有效地降低了腦缺血再灌注損傷后腦組織中NO水平,可能是其發(fā)揮腦缺血再灌注損傷后腦保護作用的原因之一。

NO與S100β有著密切關系,有研究[12]證實: S100β劑量依賴性誘導星形膠質細胞中的一氧化氮合酶(iNOS)表達,從而誘導體外培養(yǎng)的膠質細胞釋放NO,通過NO依賴性通道引起細胞凋亡。因此本文作者亦檢測了腦組織中S100β水平變化,結果顯示:腦缺血再灌注24 h時大鼠腦組織S100β水平略有升高,72 h時明顯升高,與NO水平升高有一定平行關系,可能與上述機制有關。而姜黃素預處理后,腦缺血再灌注72 h時腦組織中S100β水平明顯低于模型組,說明姜黃素預處理在腦缺血再灌注后能明顯抑制腦組織中S100β水平。研究[13]表明:過量的S100β在腦缺血損傷中發(fā)揮神經(jīng)毒性作用,說明姜黃素可能同時通過各種途徑抑制腦缺血再灌注后NO和S100β水平和二者之間的相互作用,這可能是其發(fā)揮腦缺血后神經(jīng)保護作用的原因之一,但具體的機制還有待于進一步研究。

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Influence of curcumin in NO and S100βlevels in brain tissue of rats after focal cerebral ischemia reperfusion injury

ZHAO Zhao-hua1,WU Shu-qiang2,GOU Xing-chun3,MI Ya-jing3,YANG Ji-ping1, SHI Li-li1,CHENG Juan-juan1
(1.Department of Human Anatomy,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China;2.Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital,Xi’an Medical University,Xi’an 710077,China; 3.Institute of Foundation and Transformation,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China)

ObjectiveTo observe the influence of curcumin in the levels of nitric oxide(NO)and S100βin the brain tissue of the rats after cerebral ischemia reperfusion,and to explore the neuroprotective mechanism of curcumin.MethodsAdult male SD rats were randomly divided into sham operation group,model group and curcumin group, and 18 rats in every group.Curcumin was intraperitoneally injected daily for 3 consecutive days before inducing focal cerebral ischemia in the SD rats by middle cerebral artery occlusion(MCAO)for 2 h.TTC staining was used toobserve the infarction volume.Nitrate reductase assay was used to detect the level of NO in brain tissue of the rats.The level of S100βin brain was detected by ELISA method.ResultsCompared with model group,the brain infarction volumes of the rats 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion in curcumin group were significantly decreased(P＜0.05).Compared with sham operation group,the NO and S100βlevels in the brain tissue 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion of the rats in model group were significantly increased(P＜0.05); compared with model group,the levels of NO in the brain tissue 24 and 72 h after cerebral ischemia reperfusion in curcumin group were remarkably decreased(P＜0.05);compared with modee group,the level of S100βin the brain tissue 72 h after cerebral iscemia reperfusion in curcumin group was remarkably decreased(P＜0.05).ConclusionCurcumin can significantly reduce the degree of ischemia reperfusion injury in the rats and reduce the levels of NO and S100βin brain tissue,which suggests that the decrease of NO and S100βlevels in brain tissue may be associated with the neuroprotective effect of curcumin.

curcumin;cerebral ischemia reperfusion;nitric oxide;S100β

R363;R965

A

2014-01-15

國家自然科學基金資助課題(81071060);陜西省科技廳科技計劃項目資助課題(2013JQ3017);西安醫(yī)學院科研基金資助課題(10FC012)

趙朝華(1978－),女,陜西省西安市人,講師,醫(yī)學碩士,主要從事腦缺血性疾病發(fā)病機制和防治方面的研究。

茍興春(Tel:029-6177472,E-mail:gouxingchun＠189.cn)

時間: 2014-08-27 14:46

網(wǎng)絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1446.005.html

1671-587Ⅹ(2014)05-0925-04

10.13481/j.1671-587x.20140503