楊 冬, 馬建中, 高 敏, 崔亞麗

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021; 3.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710069)

0 引言

金磁納米微粒是表面包覆金殼的磁性納米復(fù)合微粒，因其兼具膠體金獨特的光學(xué)性質(zhì)及磁性材料的超順磁性，而在生物分離[1]、免疫學(xué)檢測[2]、靶向給藥[3]、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]、固定化酶[5]等諸多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景.

當將金磁納米微粒與生物分子，特別是與免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)結(jié)合并用以免疫檢測時，蛋白分子在顆粒表面的有效偶聯(lián)是構(gòu)建免疫探針及實施后續(xù)檢測的前提.其中，偶聯(lián)率的確定可以為分析蛋白分子在顆粒表面的空間分布提供有效依據(jù)，且對檢測效果，主要指特異性及靈敏度的評價分析具有現(xiàn)實意義[6-8].

基于金磁納米微粒的表面特性，本實驗采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-dimethyllaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)作為連接因子，以化學(xué)鍵合的方式將鏈親合素(Streptavidin,SA)分子偶聯(lián)于金磁微粒表面，排除定量方法中的干擾因素和物質(zhì)，以Lowry蛋白定量法測得準確的偶聯(lián)率，通過金磁納米微粒的密度的計算，并結(jié)合蛋白分子的分子量計算得出鏈親合素在顆粒表面的分布個數(shù)，為基于金磁納米微粒的免疫探針的結(jié)構(gòu)分析提供了一種可靠的方法.

1 實驗部分

1.1 主要試劑

金磁納米微粒，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，聚丙烯酸鈉(PAA)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，鏈親合素(SA)，三氯乙酸(分析純)，Lowry試劑盒.

1.2 主要儀器

UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津；VORTEX 1 MS 3型渦旋混勻器，德國IKA；5425D型離心機，德國Eppendorf；5700型傅立葉紅外光譜儀，美國Nicolet；電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜，Thermo Elemental；移液器，德國Eppendorf.

1.3 實驗方法

1.3.1 金磁納米微粒表面修飾及元素分析

取金磁納米微粒30 mg(5 mg/mL)，加入等體積的CTAB溶液(5 mmol/L)，攪拌30 min，置于磁性分離器上磁性分離，棄去上清液，以去離子水重懸.加入5 mL聚丙烯酸鈉(PAA，1 mg/mL)，攪拌60 min，反應(yīng)結(jié)束后棄去上清液，洗滌3次，最后以去離子水定容至10 mL，備用.取1 mL修飾后的金磁納米微粒于真空烘箱過夜，稱重.

將表面修飾的復(fù)合粒子稀釋成稀溶液，用移液器吸取30μL滴加在碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上，充分干燥后，在透射電子顯微鏡(TEM)下觀察修飾后的微粒分散度及表面形貌.

取一定量的金磁納米微粒于玻璃皿中，置于80 ℃的烘箱中干燥過夜.取粉末樣品進行紅外光譜(FTIR)分析，表征微粒表面特征官能團.

取表面修飾后的微粒10 mg，加入王水溶化，過夜烘干后，以去離子水重懸.采用電感耦合等離子發(fā)射儀(ICP-AES)測定元素金及鐵的含量，計算金磁納米顆粒的密度.

1.3.2 Lowry蛋白定量

(1)標準曲線的繪制

Lowry蛋白定量的原理見文獻[9]，Lowry試劑盒操作步驟如下：

①分別取A2、A3、A1液體，按1∶1∶100順序混合，放置0.5 h后使用.

②取標準品BSA和SA，分別以去離子水稀釋為0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、1 280μg/mL的標準品系列溶液.

③分別取標準品系列溶液20μL，加入A液1 mL，放置0.5 h后加入B液100μL，迅速混勻(避光操作)，旋轉(zhuǎn)0.5 h，以紫外可見分光光度計測定A750值，每個樣品做三次平行，取平均值繪制標準曲線.

(2)EDC對蛋白定量的測定干擾規(guī)律

配制樣品中蛋白含量為50μg/mL，EDC終濃度分別為0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、1 280μg/mL的樣品液系列，按前述方法測定樣品的蛋白含量，比較加EDC前后蛋白含量的測定值.

(3)對EDC干擾的消除

取樣品液1 mL，加0.15 mL三氯乙酸溶液，混勻，室溫放置15 min，4 ℃，12 000 rpm離心5 min，小心地吸棄上清，重復(fù)上述步驟2次，Lowry法測定蛋白含量.

1.3.3 金磁納米微粒偶聯(lián)蛋白及偶聯(lián)率的計算

取1 mg金磁納米微粒，磁分離棄去上清液，以0.2 mL磷酸緩沖液(PB×1，pH 6.7)重懸，加入20μg EDC溶液(10 mg/mL)，冰浴超聲處理20 min，加入SA溶液(5 mg/mL)，使其終濃度為50μg/mL，超聲處理60 min，磁分洗滌3次，0.2 mL的PB緩沖液4 ℃保存，取濃度50μg/mL的SA溶液、磁分得到上清液，以及第一次的洗滌液，分別測定蛋白含量，計算偶聯(lián)率.

2 結(jié)果與討論

2.1 金磁納米微粒的表征

金磁納米微粒的表面修飾原理參見文獻[10].從圖1(a)可以看出，采用CTAB及PAA對微粒表面修飾后，可以得到顏色紅亮的微粒溶液.由于金磁納米微粒的表面等離子體共振現(xiàn)象，金磁納米微粒在可見光范圍內(nèi)存在一個吸收光譜帶，其最大吸收峰位在540 nm左右，且其位置會隨粒徑分布、分散介質(zhì)的變化及材料表面組成等而產(chǎn)生相應(yīng)的紅移或藍移[11].當金磁納米微粒溶液呈現(xiàn)紅亮的顏色時，代表其具有良好的分散穩(wěn)定性.表面修飾后的金磁納米顆粒為規(guī)則的球狀(如圖1(b)所示)，通過Nano Measure計算，其平均粒徑為41.89 nm.

為確定金磁納米微粒的表面修飾效果，將修飾后的微粒反復(fù)洗滌，去除未包裹的PAA后，80 ℃真空烘箱干燥, 以紅外光譜分析表面特征官能團.如圖1(c)所示，表面修飾前的金磁微粒的2 920 cm-1, 2 850 cm-1, 1 401 cm-1, 以及 960 cm-1等處的吸收峰來自于表面活性劑CTAB，即2 920 cm-1及2 850 cm-1處的吸收峰來自于C-H的對稱伸縮振動，1 401 cm-1為C-H的不對稱振動，而960 cm-1處的吸收峰則來自于CTAB的季胺鹽極性頭[12,13].中性溶液中，PAA鏈上的羧基會產(chǎn)生部分解離形成羧酸根，因而在1 550 cm-1和1 400 cm-1處出現(xiàn)特征峰[14,15].

對比表面修飾前后的譜圖，修飾后的金磁微粒具有來自于聚丙烯酸羧基官能團，表明PAA通過羧基與CTAB的季胺極性頭包裹在了顆粒外層，形成的聚合物外殼可以為顆粒提供離子穩(wěn)定性及空間位阻，從而保持顆粒具有良好的分散穩(wěn)定性[10,16].

通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)的元素定量分析(如圖1(d)所示)，結(jié)果表明表面修飾后的金磁納米微粒中Au含量為10.8%、Fe含量約為16.2%，即：

mAu∶mFe3O4=10.8∶22.4

如果將金磁納米微?？醋魇蔷鶆虻囊?guī)則球體顆粒,如圖1(d)所示[17],則其密度計算公式如下 ：

其中,ρAu=19.3×106g/m3，ρFe3O4=5.18×106g/m3，求解出d=14.5 nm，計算出金磁納米微粒的平均密度為ρFe3O4@Au=18.71×106g/m3，則金磁納米微粒的濃度N=1.46×1012個/mg.

(a)金磁納米微粒及表面等離子體共振吸收峰 (b)金磁納米微粒的透射電子顯微鏡圖(TEM) (c)紅外光譜譜圖(FTIR) (d)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)表征的元素定量分析圖1 金磁納米微粒的表征結(jié)果

2.2 蛋白定量的標準曲線

除了操作過于繁瑣的凱氏定氮法，以及靈敏度差的紫外吸收法外，還可以應(yīng)用較為廣泛的蛋白定量方法包括考馬斯亮藍法(Bradford法)，二喹啉甲酸法(BCA法)以及Lowry法(Folin-phenol reagent)等.然而，Bradford法形成的化合物的光吸收值在595 nm，BCA法形成的復(fù)合物的光吸收值在562 nm，使得金磁納米微粒本身特征峰位的移動都會對定量結(jié)果產(chǎn)生巨大影響，因而，選擇Lowry法進行蛋白定量.

以SA和BSA為標準品繪制得到的標準曲線如圖2所示.結(jié)果表明，蛋白含量-吸光度的線性關(guān)系都比較顯著，然而兩種蛋白得到的標準方程明顯存在區(qū)別.這是由于蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基的量的不同，導(dǎo)致了等量的不同蛋白所顯示的顏色深度不一致，因而產(chǎn)生了誤差[18].因此，本實驗以需要偶聯(lián)的目標蛋白SA作為標準品，標準方程為A=4.165×10-4c+0.011，標準偏差為0.994.

圖2 Lowry法中以鏈親合素(SA)和牛血清 蛋白(BSA)作為標準品繪制的標準曲線

2.3 EDC對蛋白定量的干擾

在納米粒表面偶聯(lián)蛋白，可以通過物理吸附和化學(xué)鍵合的方法.物理吸附對納米粒的表面特性要求較高，吸附于納米粒表面的蛋白分子易于脫落而重新進入到溶液中，因而能過物理吸附得到的蛋白標記納米粒不穩(wěn)定.為得到更穩(wěn)定的蛋白功能化金磁微粒，我們采用碳二亞胺(EDC)作為連接因子，通過金磁微粒表面的羧基與肽鏈上的胺基反應(yīng)，將蛋白分子化學(xué)鍵合至金磁納米微粒表面，其反應(yīng)示意圖如圖3所示.

圖3 碳二亞胺(EDC)作為連接因子實現(xiàn) 金磁納米微粒偶聯(lián)蛋白的示意圖

然而，實驗中發(fā)現(xiàn)微克級的碳二亞胺就會對

Lowry蛋白定量法產(chǎn)生干擾[19,20]，如圖4所示.以不含SA的系列濃度EDC溶液來進行Lowry法檢測.結(jié)果表明，EDC濃度-吸光度符合直線關(guān)系，標準方程為A=4.421×10-4c+0.012，其標準偏差為0.999.

為研究EDC對蛋白定量的干擾，配制了含有SA終濃度為50μg/mL、EDC終濃度為0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、1 280μg/mL的樣品液系列.按前述方法測定樣品的蛋白含量，對比得到EDC對蛋白定量的影響.結(jié)果表明，在有蛋白存在時，小濃度的EDC(c<200μg/mL)對蛋白定量的影響較小，可以通過EDC的線性方程去除干擾，然而隨著EDC濃度的增大，所產(chǎn)生的干擾愈加嚴重，因而難以得到準確的測定值.

在納米顆粒偶聯(lián)蛋白的操作過程中，往往需要加入過量的EDC，以提高蛋白在顆粒表面的偶聯(lián)，得到最大的偶聯(lián)率.所以，偶聯(lián)率的測定必須消除體系中EDC對Lowry法的干擾.

圖4 EDC對Lowry蛋白定量法的干擾

2.4 對EDC干擾的消除

采用三氯乙酸沉淀蛋白后，再進行Lowry法蛋白定量所得的結(jié)果如表1所示.可以看出，當?shù)鞍字谢煊胁煌瑵舛鹊腅DC時,可參照《歐洲藥典》引入三氯乙酸，先沉淀蛋白后進行測定，可以消除EDC引起的干擾現(xiàn)象，從而準確定量體系中的蛋白含量.

表1 Lowry法檢測含50 μg/mL鏈親合素(SA)的不同濃度的EDC溶液

2.5 偶聯(lián)率的評價

金磁納米微粒表面偶聯(lián)蛋白前后，取50μg/mL的SA溶液作為Apre樣品液，以三氯乙酸沉淀偶聯(lián)后蛋白作為Apost樣品液，并收集洗滌液作為Awash樣品液，通過Lowry法進行蛋白定量，測定結(jié)果如表2所示.

表2 偶聯(lián)前后蛋白定量結(jié)果

SA在溶液中的含量減少表明SA在金磁納米微粒表面成功偶聯(lián).由于EDC作為連接因子，在后續(xù)洗滌中SA被洗脫的量很少，其中偶聯(lián)率的評價公式為：

通過計算可得,金磁納米微粒表面SA的偶聯(lián)率達到28.43%，結(jié)合SA的相對分子量以及金磁鈉米微粒的濃度，其偶聯(lián)量為：

其中，L=6.02×1023，N=1.46×1012個/mg，MSA=64 kDa，則計算所得偶聯(lián)量為18個SA/個金磁微粒.

3 結(jié)論

對納米微粒進行定量表面功能化，不但可為免疫探針結(jié)構(gòu)的研究提供了空間分布信息，也為后續(xù)檢測性能的評價提供了參考數(shù)據(jù)及評價依據(jù).因此，本研究通過微粒表面的蛋白偶聯(lián)率的測定和計算，為構(gòu)建基于金磁納米微粒的免疫探針，提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考.

在本研究的計算方法中，采用了平均粒徑來計算金磁納米微粒的密度.因為納米級微粒的粒徑分布大多符合正態(tài)分布，應(yīng)是具有一定范圍的粒徑分布[21]，因而會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)一定的偏差；同時，本研究中以三氯乙酸來消除EDC對Lowry蛋白定量的干擾，由于離心去上清等操作的有限性，可能溶液中會有EDC的殘留，從而導(dǎo)致偶聯(lián)后的蛋白定量結(jié)果略偏大.因此，本研究的計算結(jié)果只能為實驗提供一定參考，真正精確的微粒表面的蛋白定量還需要進一步努力.

綜上所述，本文以聚電解質(zhì)PAA修飾金磁納米微粒，采用EDC將SA分子偶聯(lián)于微粒表面，用三氯乙酸沉淀法來消除溶液中未反應(yīng)的EDC對Lowry蛋白定量方法的干擾，確定了微粒表面蛋白的偶聯(lián)量，同時結(jié)合金磁納米微粒密度及SA分子量的數(shù)據(jù)，計算得出金磁納米微粒表面SA的偶聯(lián)量為18個SA/金磁微粒.

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