花 莉， 彭香玉， 范 洋， 解井坤

(陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

石油是一種成分極其復(fù)雜的混合物，并且不同來源的原油的成分具有很大區(qū)別.石油中的烴類一般可分為兩類：飽和烴類(直鏈烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴等)和不飽和烴類(烯烴、炔烴、單環(huán)芳烴、多環(huán)芳烴、雜環(huán)芳烴等)[1].微生物降解就是利用石油烴類作為碳源，經(jīng)過一系列氧化、還原、分解、合成等生化作用，將石油污染物礦化轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的無機(jī)物質(zhì)CO2和 H2O的過程.

Kiesele[2]在研究細(xì)菌和霉菌對(duì)石油降解能力時(shí),發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Acinetobactercalcoaeticus只能降解C22～C30的石油烴并且對(duì)石油有乳化作用;而Serratiamarcescens只降解C20～C28的石油烴并且對(duì)石油具有較大吸附能力；霉菌Candidatropicalis能降解 C12～C32的石油物質(zhì)，還具有較大的乳化石油的能力.

不同微生物對(duì)不同石油烴的成分有不同的降解能力，或者在降解過程中起著不同的作用.Lee等[3]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)己烷能被Rhodococcussp. EC1降解；Chakraborty等[4]發(fā)現(xiàn)在提供硝酸鹽電子受體情況下，DechloromonasRCB能降解苯；Cerqueira等[5]發(fā)現(xiàn)將多種能降解含油污泥的菌混合投加后降解效果有明顯的提高.

基于石油組分的復(fù)雜性及單菌株降解物質(zhì)的有限性，本文以中國石油化工集團(tuán)公司0#柴油為唯一碳源，通過分析單菌株及其混合菌的降解代謝產(chǎn)物來研究石油烴的降解機(jī)制，從而為篩選功能微生物提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種來源

(1)居植物柔武士菌(Raoultellaplanticola)，在 GenBank中序列登錄號(hào)為KC753502，以下簡稱為R.planticola.

(2)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，在GenBank中序列登錄號(hào)為KC753507，以下簡稱為S.marcescens.

(3)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，在GenBank中序列登錄號(hào)為KC753503，以下簡稱為B.cereus.

(4)克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，在GenBank中序列登錄號(hào)為KC753504，以下簡稱為K.variicola.

上述4株單菌，由本實(shí)驗(yàn)室從中國石油長慶石化公司附近的油泥中分離篩選鑒定所得.混合菌按照前期響應(yīng)面優(yōu)化混合菌配比實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制，其中R.planticola、S.marcescens、B.cereus、K.variicola等的高濃度菌液(OD590=0.5)分別按接種量4%、2%、2%、2%等的比例組合.

1.2 培養(yǎng)基

(1)原油培養(yǎng)基[6]：(NH4)2SO45 g，KCl 1.1 g，NaCl 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.028 g，KH2PO41.5 g，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微量元素 5 mL，蒸餾水1 L，柴油 10 g，調(diào)pH 7.2，121 ℃滅菌20 min.

微量元素液成分( g· L-1) 包括ZnSO4·7H2O 0.29 g，CaCl20.24 g，CuSO4·5H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.17g.

(2)富集培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g， NaCl 10 g，蒸餾水1 L，調(diào)pH 為7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.3 降解率的測定

將4單菌株及其混合菌制成菌懸液，以相同接種量加入到100 m L 原油培養(yǎng)基中，做3個(gè)平行試驗(yàn)，放入30 ℃搖床中( 轉(zhuǎn)速為120 r·min-1) 培養(yǎng)5天，然后用重量法測定殘余柴油的含量[8].以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，用四氯化碳回收殘余原油，濾液過濾到已稱重的圓底燒瓶中，除去菌懸液，旋蒸后干燥，稱重，采用如下計(jì)算公式：

降解率=(m1-m2)/m1×100%

式中：m1為對(duì)照組的殘油質(zhì)量，g；m2為樣品殘油質(zhì)量，g.

1.4 殘油組分GC-MS分析

將殘油萃取液用CCl4定容至100 mL，取1 mL移至進(jìn)樣瓶中用于GC-MS檢測.GC-MS運(yùn)行條件為：

(1)色譜條件[9]

色譜柱為 HP-5 ms 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；載氣：He；進(jìn)樣模式：分流,分流比為 50∶1；采樣時(shí)間：1.00 min；柱前壓：8.2 psi;進(jìn)樣口溫度：250 ℃；起始溫度：60 ℃，保持 2.0 min，以 20.0 ℃·min-1升至 300 ℃，保持 10 min；進(jìn)樣量 1μL.

(2)質(zhì)譜條件

傳輸線溫度：250 ℃；阱溫：220 ℃；電離方式：EI；電離能：70 eV；掃描模式：全掃描；掃描質(zhì)量范圍：2～1 050 amu.

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌株和混合菌的降解比較

以柴油為唯一碳源，在5天的降解實(shí)驗(yàn)中,各單菌株及混合菌對(duì)柴油降解效率如圖1所示,依次為：混合菌>K.variicola>B.cereus>S.marcescens>R.planticola.在投加單一菌時(shí)，R.planticola、S.marcescens、B.cereus、K.variicola等的降解率均不高，分別為41.83%、48.39%、49.29% 和54.87%.混合菌的降解率為64.27%，比單菌株降解更為有效.

實(shí)驗(yàn)所用的柴油成分復(fù)雜，包括烷烴、烯烴、環(huán)烷烴、芳香烴和多環(huán)芳烴等.一種細(xì)菌可能只對(duì)其中的某種或有限的幾種組分起作用，因而對(duì)不同類污染物的利用具有一定的局限性.Mukred 等[10]研究表明,混合菌能降解長鏈脂肪族化合物,而單菌株只能降解短鏈或中長鏈的脂肪族化合物;葉淑紅等[11]發(fā)現(xiàn)混合菌在石油烴的降解中能夠充分發(fā)揮各菌種之間的協(xié)同作用，比單菌株降解更為有效.

因此，為了更深入地了解單菌株及混合菌在降解石油烴中發(fā)揮的作用及其降解途徑，本論文對(duì)單菌株及混合菌培養(yǎng)5天后的降解產(chǎn)物進(jìn)行了GC-MS分析.

圖1 單菌株及混合菌對(duì)柴油的降解

2.2 降解代謝產(chǎn)物分析

經(jīng)GC-MS分析,得到了單菌株及混合菌降解產(chǎn)物總離子流色譜圖(見圖2所示).氣相色譜分離后的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)過質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，并查對(duì)有關(guān)質(zhì)譜和氣相色譜資料，綜合各項(xiàng)分析并對(duì)各色譜峰加以確認(rèn).選定的不加菌對(duì)照組的6種主要組分如圖2(a)所示，以此來研究單菌株及混合菌對(duì)柴油的降解途徑.

2.2.1 支鏈烯醇的降解

微生物降解直鏈烷烴時(shí)，可對(duì)單末端、雙末端和次末端進(jìn)行氧化.降解過程為:石油降解菌將直鏈烷烴氧化為醇，醇經(jīng)過脫氫酶氧化變?yōu)槿┭趸優(yōu)橹舅?，脂肪酸通過β-氧化降解為乙酰輔酶A，后者或進(jìn)入三羧酸循環(huán)，分解成CO2和H2O，并釋放出能量，或進(jìn)入其他生化過程[12].

支鏈烷烴與直鏈烷烴降解途徑相似.但相對(duì)于直鏈烷烴而言，支鏈的存在會(huì)增加微生物氧化降解的阻力.這是因?yàn)檠趸纸獾牟课恢饕窃谥辨溕习l(fā)生，而靠近側(cè)鏈的一端較難發(fā)生氧化反應(yīng).烷烴的支鏈降低了分解速率，使含有支鏈結(jié)構(gòu)的烴類降解速度慢于相同碳數(shù)的直鏈烴類[13].

(a) 不加菌對(duì)照組圖譜 (b) R.planticola降解產(chǎn)物圖譜

(c) S.marcescens降解產(chǎn)物圖譜 (d) B.cereus降解產(chǎn)物圖譜

(e) K.variicola降解產(chǎn)物圖譜 (f) 混合菌降解產(chǎn)物圖譜圖2 單菌株及混合菌降解產(chǎn)物GC-MS圖譜

針對(duì)圖2(a)中11.615 min出現(xiàn)帶有甲基支鏈的Z,Z-2-甲基-3,13-十八碳二烯醇(2-Methyl-Z,Z-3,13-octadecadienol),經(jīng)過5天培養(yǎng)，在R.planticola和K.variicola降解產(chǎn)物中只發(fā)現(xiàn)(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-).故可推測支鏈烯烴醇的微生物降解途徑與支鏈烷烴相似，可能先脫除甲基的支鏈，減少微生物氧化降解阻力，然后使原來靠近側(cè)鏈一端的羥基能發(fā)生與直鏈烷烴相似的氧化途徑，氧化為羧基并產(chǎn)生某些雙鍵的位移.當(dāng)混合菌中發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物Z,E-3,13-十八碳二烯醇(Z,E-3,13-Octadecadien-1-ol)時(shí)，可以肯定R.planticola和K.variicola具有脫烷基作用，能加速石油中支鏈烴的降解.

2.2.2 (Z)-9-十八烯醛的降解

由圖2(c)15.060 min和圖2(d)14.735 min降解產(chǎn)物中丙二醇-油酸酯(Propyleneglycol monoleate)的出現(xiàn)可知，S.marcescens、B.cereus及混合菌等具有把醛基氧化為羧酸的功能.

2.2.3 烯烴的降解

對(duì)于水油兩相反應(yīng)，長鏈烯烴因其較差的水溶性而使反應(yīng)活性較差，因此，通常利用表面活性劑形成的膠束作用來增加烯烴的水溶性，同時(shí)烯烴增溶到膠束中后，有利于在末端雙鍵參與配位而引入羰基[14].

不同微生物對(duì)1-十六碳烯(1-Hexadecene)降解程度不同.由圖2(c)14.206 min可知S.marcescens只能雙鍵發(fā)生位移生成內(nèi)烯烴的中間產(chǎn)物(順-11-十六碳烯醛)；圖2(b)13.936 min發(fā)現(xiàn)R.planticola能在此基礎(chǔ)上繼續(xù)脫氫生成二烯烴中間產(chǎn)物(順，順-7,10-十六碳二烯醛)；分別在圖2(d)、圖2(e)和圖2(f)中依次有B.cereus、K.variicola及混合菌能生成終產(chǎn)物15-甲基-11-十六烯酸甲酯.單菌株與混合菌降解產(chǎn)物都被引入羰基，說明可能存在表面活性劑的促進(jìn)作用，這與前期研究4種單菌株都具有較強(qiáng)的產(chǎn)表面活性劑能力相符[15].

Schink[16]在不飽和烴的厭氧降解開拓性研究中，檢測到了1-十六碳烯礦化產(chǎn)物醋酸鹽.這與本研究中B.cereus降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)乙酸酐相類似.Grossi等[17]發(fā)現(xiàn)在硫酸鹽還原菌(D.aliphaticivorans)厭氧作用下會(huì)氧化1-十六碳烯C-1處的雙鍵形成伯醇，并在C-2，C-3，或在飽和端近頂端碳[C-(ω-1)]上增加碳單元形成帶甲基的支鏈.在降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)B.cereus和K.variicola能使終產(chǎn)物近頂端碳甲基化，可說明B.cereus和K.variicola可能有厭氧條件下降解1-十六碳烯的潛力.

1-十九碳烯(1-Nonadecene)能分別在R.planticola、S.marcescens及K.variicola等作用下轉(zhuǎn)化為Z-4-十九烯醇乙酸酯(Z-4-Nonadecen-1-ol acetate).這說明上述單菌株可能先將烯烴代謝為不飽和醇后產(chǎn)生某些雙鍵的位移.但在圖2(d)和圖2(f)中沒有發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物，可能是由于B.cereus的抑制作用導(dǎo)致，混合菌中沒有發(fā)現(xiàn)1-十九碳烯降解.

2.2.4 炔烴的降解

Tavassoli等[18]利用原油中分離的微生物降解瀝青質(zhì)，培養(yǎng)20天后,瀝青質(zhì)紅外光譜分析中C≡C峰消失.而本研究中圖2(e)14.470 minK.variicola及圖2(f)15.217 min混合菌培養(yǎng)5天后其降解產(chǎn)物中都發(fā)現(xiàn)有Z-6-十五烯醇-乙酸酯，而其它單菌株中未發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物.這說明K.variicola可以用于短期內(nèi)降解瀝青質(zhì)，減輕油田生產(chǎn)過程中瀝青質(zhì)引起的堵塞油井、出油管線及地面設(shè)施等現(xiàn)象.

2.2.5 環(huán)烷烴的降解

環(huán)烷烴在石油餾份中占有較大比例.對(duì)于不含支鏈的環(huán)烷烴的降解，其與鏈烴的次末端降解途徑相似：首先氧化產(chǎn)生環(huán)烷醇，接著脫氫得酮，然后氧化得內(nèi)酯，或直接開環(huán)，生成脂肪酸[19].實(shí)際上，B.cereus和K.variicola純培養(yǎng)5天后降解圖譜檢測出13-十四碳烯-1-醇乙酸酯,如圖2(d)14.167 min和圖2(e)14.156 min所示.可推測環(huán)十四烷先被氧化成環(huán)烷醇，然后在臨近的β位發(fā)生C-C鍵斷裂形成烯醇，接著與游離的醋酸形成酯鹽.混合菌中可能受到環(huán)烷烴的抑制作用而未發(fā)現(xiàn)此降解產(chǎn)物.

單菌株及混合菌對(duì)6種物質(zhì)的降解情況，如表1所示.K.variicola可以降解列舉物質(zhì)中的5種，屬于優(yōu)勢菌種.單菌株及混合菌株對(duì)1-十六碳烯都有一定程度地降解，B.cereus和混合菌中卻未發(fā)現(xiàn)1-十九碳烯降解產(chǎn)物，這說明同種類型烯烴中，分子量越大越難被微生物利用.

表1 單菌株及混合菌對(duì)6種物質(zhì)降解情況

注：—— 表示未發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物; ***表示中間體.

3 結(jié)論

在以柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基中，K.variicola是優(yōu)勢菌種，培養(yǎng)5天降解率高達(dá)54.87%；R.planticola降解率最低，僅為41.83%；混合菌株降解率為64.27%，相比單菌株的降解率，有明顯地提高.

從4種單菌株及混合菌不同程度地降解1-十六碳烯可知，1-十六碳烯的氧化代謝途徑為：菌株首先把1-十六碳烯末端氧化并產(chǎn)生雙鍵位移，生成順-11-十六碳醛或順-7-十六碳醛，然后經(jīng)歷脫氫酶作用生成順，順-7,10-十六碳二烯醛，最后被氧化和甲基化為15-甲基-11-十六烯酸甲酯.

不同微生物對(duì)不同石油烴的成分具有不同的降解能力.R.planticola和K.variicola具有脫烷基功能，對(duì)一定的支鏈烴有降解效果；S.marcescens和B.cereus能氧化不飽和醛基；R.planticola和S.marcescens只能初步氧化1-十六烯，而B.cereus和K.variicola可以氧化1-十六烯為終產(chǎn)物羧酸；R.planticola、S.marcescens和K.variicola可以降解1-十九碳烯；K.variicola可以降解炔烴，其它3種單菌株均無此功能；B.cereus和K.variicola可以降解環(huán)烷烴.

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