孟秀利， 李 亞， 周 波， 魯國東*(.福建農(nóng)林大學植物保護學院， 福建 福州 350002； 2.浙江大學生物與技術(shù)研究所， 浙江 杭州 30029)

稻瘟病是危害水稻的重要病害,此病在我國南北稻區(qū)每年都不同程度的發(fā)生和流行，產(chǎn)量損失達數(shù)億千克，給我國的糧食安全帶來隱患(鄒聲浩，2009)。鑒于此，弄清楚稻瘟病菌的侵染模式以便更好的控制稻瘟病的流行就變得尤為重要。轉(zhuǎn)錄因子是反式作用因子中最大的家族，對真菌生長發(fā)育和致病性有重要影響。稻瘟病菌侵染水稻時相關(guān)基因的表達離不開轉(zhuǎn)錄因子的參與。關(guān)于稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄因子在侵染時期的作用很多人都有研究。稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄因子MoMSN2敲除后，突變體生長速率明顯下降，菌絲生長致密，并且突變體幾乎不產(chǎn)生分生孢子，不能形成附著胞，且喪失了對水稻的致病性。MoMYB1敲除后也影響了稻瘟病菌的生長速率，分生孢子梗的發(fā)育等(趙倩，2010)。張莉林對稻瘟病菌294個轉(zhuǎn)錄因子進行敲除，發(fā)現(xiàn)49個轉(zhuǎn)錄因子影響了稻瘟菌的生長、產(chǎn)孢和致病性(張莉林，2013)。Sook-Young Park等人研究了206個稻瘟病菌的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)這206個轉(zhuǎn)錄因子50%的與產(chǎn)孢相關(guān)，敲除10個產(chǎn)孢時期特異表達的轉(zhuǎn)錄因子，分生孢子不能形成(Sook-Young Parketal.，2012)。

本實驗在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫中找到稻瘟病菌假定的的轉(zhuǎn)錄因子有500個。通過對500個假定的轉(zhuǎn)錄因子的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)有些序列在稻瘟病菌基因組序列中高度重復，去除這些重復序列后對剩余的486個轉(zhuǎn)錄因子進行RT-PCR篩選， 目的是找到在侵染初期特異表達的轉(zhuǎn)錄因子。這些數(shù)據(jù)的獲得不僅可以讓我們更清楚稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄因子的作用，更重要的是對于研究無毒基因的調(diào)控模式也大有意義。因為有文獻指出，稻瘟病菌的42個預測分泌蛋白中有12個基因在侵染水稻早期顯著表達(李湘龍，2012)，同時Isabelle Fudal等證明無毒基因ACE1在侵染釘?shù)那秩霑r期起重要作用(Isabelle Fudaletal., 2007)，所以找到在侵染時期特異表達的轉(zhuǎn)錄因子對于研究稻瘟病菌無毒基因的表達以及克隆也有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株R88-002由韓國 Kyung Hee 大學的 Jong-Seong Jeon 教授提供, RNA提取試劑盒購于上海普洛生物產(chǎn)品有限公司, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶生物工程有限公司, rTaq酶購于泰京生物技術(shù)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取 R88-002菌株活化后并轉(zhuǎn)接在CM培養(yǎng)基上(20×Nitrate salts 50 ml，1000×Trace element 1 ml,D-glucose 10 g, peptone 2 g, Yeast Extract 1 g, casamino acid 1 g,1000×Vitamin solution 1 ml, Agar 15 g 定容到1000 ml))待菌絲長滿全皿后，用RNA提取試劑盒按說明中方法，提取菌絲RNA。侵染初期材料是采取洋蔥表皮侵染的方法獲得。方法是將新買的洋蔥侵泡一夜后撕取洋蔥表皮，將稻瘟病菌孢子滴到洋蔥疏水表面，放在放有吸水紙的盤中用保鮮膜密封保濕，24 h后用試劑盒提取RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 首先用gDNA Eeaser 去除RNA中的DNA,然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按說明書方法進行。

1.2.3 486個轉(zhuǎn)錄因子引物的設(shè)計 首先在數(shù)據(jù)庫中將這些基因的基因序列找出來，在這些基因序列的CDS區(qū)內(nèi)部設(shè)計正向引物和反向引物，兩個引物之間跨越一個內(nèi)含子，擴增片段大小控制在500 bp以內(nèi)，兩個引物的3，末端以C或G結(jié)束，引物的長度在18-20 bp之間，正向和反向引物的GC含量盡量接近，且GC含量在引物序列中的含量在45%-65%之間。用這些原則進行引物設(shè)計，然后用DNAMAN軟件進行引物的檢驗，對于有嚴重的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物進行重新設(shè)計。引物設(shè)計后，由生工生物工程股份有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 菌絲階段RT-PCR擴增結(jié)果

486個轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)過RT-PCR擴增，共有160個轉(zhuǎn)錄因子在菌絲時期有表達，其余326個轉(zhuǎn)錄因子未檢測到表達。有表達的轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其表達量相對于Tublin基因表達量的高低，分為低、中、高三類，其中比Tublin基因表達量低的有120個，與Tublin表達量相同的有 32個，比Tublin基因表達量高的有8個。這些在菌絲階段有表達的轉(zhuǎn)錄因子對應(yīng)的基因號見表1。

表1 用菌絲的RNA進行RT-PCR篩選結(jié)果Table 1 The screening results using hypha RNA by RT-PCR

2.2 侵染初期特異表達的轉(zhuǎn)錄因子的PCR驗證

為了加快侵染初期特異表達的轉(zhuǎn)錄因子的篩選，我們選擇在菌絲階段不表達的326個轉(zhuǎn)錄因子用稻瘟病菌侵染初期的材料進行再次篩選。經(jīng)過RT-PCR，發(fā)現(xiàn)326個轉(zhuǎn)錄因子中有30個轉(zhuǎn)錄因子在侵染初期特異表達，這些轉(zhuǎn)錄因子對應(yīng)的基因編號是MGG_00080 、MGG_10276 、MGG_10280、MGG_15787、MGG_01887、MGG_01779、MGG_12776、MGG_04213、MGG_10694、MGG_13927 、MGG_10197、MGG_09276、MGG_09312、MGG_03758、MGG_01325、MGG_11457、MGG_17702 、MGG_07674 、MGG_05049、MGG_06453 、MGG_06566、MGG_06269、MGG_06258、MGG_09841、MGG_04401 、MGG_02045、MGG_00780 、MGG_01042 、MGG_09628、MGG_00810。這30個轉(zhuǎn)錄因子按照結(jié)構(gòu)域的不同可以分為10種類型，分別是C2H2 Zinc finger類轉(zhuǎn)錄因子、Zn2Cys6類轉(zhuǎn)錄因子、HMG類轉(zhuǎn)錄因子、Winged helix repressor DNA-binding 類轉(zhuǎn)錄因子、Transcription factor jumonji 類轉(zhuǎn)錄因子、ssDNA-binding transcriptional regulator 轉(zhuǎn)錄因子、Zinc finger MIZ-type 類轉(zhuǎn)錄因子、Homeodomain-like 類轉(zhuǎn)錄因子、Zinc finger DHHC-type和Nucleic acid-binding, OB-fold 類轉(zhuǎn)錄因子。具體分類見表2。

表2 侵染初期特異表達的轉(zhuǎn)錄因子及其類型Table 2 Classification for the 30 TFs based on their protein domain contained

3 結(jié)果與討論

本實驗通過RT-PCR驗證，在稻瘟病菌486個假定的轉(zhuǎn)錄因子中，有160個在稻瘟病菌的菌絲生長階段表達。 從剩余的在菌絲階段不表達的轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了30個在稻瘟病菌侵染洋蔥表皮24 h時特異表達的轉(zhuǎn)錄因子。這30個轉(zhuǎn)錄因子按照結(jié)構(gòu)域的不同可以分為10大類，其中4個含有C2H2 Zinc finger 結(jié)構(gòu)域，9個含有Zn2Cys6 結(jié)構(gòu)域，6個含有HMG 結(jié)構(gòu)域，3個含有Transcription factor jumonji 結(jié)構(gòu)域，還有3個含有Nucleic acid-binding, OB-fold 結(jié)構(gòu)域，含有Winged helix repressor DNA-binding、ssDNA-binding transcriptional regulator、 Homeodomain-like 結(jié)構(gòu)域、zinc finger MIZ-type結(jié)構(gòu)域和 zinc finger DHHC-type結(jié)構(gòu)域的分別含有1個。

本實驗只是對這些轉(zhuǎn)錄因子進行了初步的篩選，并未進行更細致的研究。這些基因在稻瘟病菌侵染初期特異性表達，它們很可能參與了稻瘟病菌的致病過程。敲除這些轉(zhuǎn)錄因子是否會影響稻瘟病菌的致病特性是我們接下來想回答的問題。另外，之前的研究表明，大部分的病原真菌的無毒基因都在其侵染時期特異表達，這30個侵染時期特異表達的轉(zhuǎn)錄因子與無毒基因的關(guān)系是我們今后的研究重點。

李湘龍，柏斌，吳俊，鄧啟云，周波.2012.第二代測序技術(shù)對于水稻和稻瘟菌互作早期轉(zhuǎn)錄組的分析.遺傳，34(1)：102-112.

張莉林.2013.294個稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄因子基因的敲除和功能分析.浙江：浙江大學.

趙倩.2010.稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄因子MoMSN2和MoMYB1 的生物學功能研究.南京：南京農(nóng)業(yè)大學.

鄒聲浩，黃珊，鄭燕梅，方珊如，施碧紅.2009.安徽農(nóng)業(yè)通報，15(24)：23-25.

Fugal I ,Fudal I,Collemare J,B?hnert HU,Melayah D,Lebrun MH.2007.Expression ofMagnaporthegriseaavirulence gene ACE1 Is connected to the initiation of appressorium-mediated penetration.EUKARYOTIC CELL,6(3):546-554.

Park SY,Choi J,Lim SE,Lee GW,Park J,Kim Y,Kong S,Kim SR,Rho HS,Jeon J,Chi MH,Kim S,Khang CH,Kang S,Lee YH.2013.Global expression profiling of transcription factor genes provides new insights into pathogenicity and stress responses in the rice blast fungus.PTHOGENS,9(6):e1003350.