張 婭，張根葆,2，季 娜,王 斐,吳 娟,2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室;2.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

蛇毒是毒蛇腺分泌的一種天然的蛋白質(zhì)毒液，其經(jīng)過分離純化后的某些成分已經(jīng)被精致成制劑并運(yùn)用于臨床，如蘄蛇酶和去纖酶[1]。蛇毒PCA是一種具有抗凝活性的蛋白質(zhì)，能特異性水解血漿PC的酰胺鍵，直接激活血漿PC[2]。近些年來，心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)等危重疾病中血漿PC活性的變化受到了較多關(guān)注[3-5]，研究發(fā)現(xiàn)[6]，MIRI過程中血漿PC受損將導(dǎo)致凝血功能紊亂，是導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征的一個(gè)重要機(jī)制，但血漿PC活性改變?cè)贛IRI的發(fā)生發(fā)展過程中連續(xù)報(bào)道較少，機(jī)制亦少見探討?？赡芘c目前PC活性的檢測(cè)方法尚未完全統(tǒng)一有關(guān)。自蛇毒PC激活物Protac應(yīng)用以來，真正形成商品化的PC活性檢測(cè)產(chǎn)品甚少且進(jìn)口價(jià)格昂貴，使臨床應(yīng)用受到限制。近年來本室從皖南五步蛇粗毒分離純化所得PCA，前期研究[7]顯示，其可敏感地反映心肌梗死大鼠血漿PC活性的連續(xù)變化，本實(shí)驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上擬通過建立大鼠在體MIRI模型，使用五步蛇毒蛋白C激活劑通過發(fā)色底物法檢測(cè)MIRI大鼠血漿蛋白C活性變化，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 MC-2000雙通道血凝儀(德國(guó)美創(chuàng)公司)；Model 680酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；超低溫冰箱(日本三洋公司)；HX-300S動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；RM6240生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)；APTT檢測(cè)試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司)；血漿游離蛋白S試劑盒(上海郎頓生物技術(shù)有限公司)；戊巴比妥(上海試劑二廠)；蛋白C激活劑(由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供)。

1.2 動(dòng)物及分組 30只雄性SD大鼠(由蘇州市工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供)，清潔級(jí)，體質(zhì)量(250±30)g，許可證號(hào)：SCXK(蘇)20130001。隨機(jī)分成對(duì)照組(C)和缺血再灌注組(IR)，每組15只。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型 大鼠采用3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)腹腔麻醉后連接RM6240系統(tǒng)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，行氣管切開術(shù)，呼吸機(jī)輔助呼吸，腋下沿胸骨左緣依次分離組織,暴露心臟左冠狀動(dòng)脈前降支，并于左心耳下1～2 mm處穿一5-0絲線。待心電圖平穩(wěn)后，放一細(xì)小聚乙烯管在絲線與血管之間，拉緊絲線使細(xì)小聚乙烯管壓迫血管從而阻斷血流。結(jié)扎后心電圖顯示ST段抬高或T波高聳，30 min后剪斷結(jié)扎線、取出乳膠管使心肌恢復(fù)血流120 min。C組大鼠僅穿線30 min后取出絲線，不結(jié)扎。

1.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) IR組大鼠分別在心臟再灌注0、60、120 min時(shí)間點(diǎn)(C組取線后0、60、120 min)從頸總動(dòng)脈取血1 ml，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，0.5 ml血液樣本以3 000 r/min離心30 min取血漿于-80 ℃保存，用于檢測(cè)FPS含量。0.5 ml血液樣本以3 000 r/min離心15 min取血漿50 μl于-20 ℃保存待測(cè)PC活性，100 μl測(cè)定APTT(4 h內(nèi)完畢)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速取出心臟，冰鹽水沖洗，常規(guī)固定，HE染色。

2 結(jié)果

2.1 各處理組大鼠心肌形態(tài)及功能變化 光鏡下可見IR大鼠心肌組織細(xì)胞核固縮、間質(zhì)水腫、局部變性、纖維及肌絲明顯紊亂、橫紋模糊不清或消失(圖1)。心電圖顯示，心肌缺血時(shí)T波高聳或ST段抬高,再灌注后高聳的T波下降或抬高的ST段下降且隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，T波、ST段又有所回升(表1)。

A：IR組心肌組織；B：C組心肌組織

圖1 SD大鼠心肌形態(tài)學(xué)變化的組間對(duì)比(HE×400)

Fig 1 Myocardial morphology changes between the two groups of rats (HE×400)

表1 大鼠心電圖變化的組間比較Tab 1 ECG(mV)changes between the two groups of rats

與C組比較：aP<0.01；與缺血時(shí)比較：bP<0.01

2.2 各處理組大鼠血漿PC活性變化 從圖2可見，與C組比較，IR組大鼠血漿PC活性呈動(dòng)態(tài)變化，心肌缺血時(shí)下降18%(P<0.01)，再灌注60 min回升(高于缺血時(shí)15%(P<0.01)),再灌注120 min再次下降17%(P<0.01)。

與C組比較：**P<0.01；與缺血時(shí)比較：△P<0.05

2.3 各處理組大鼠血漿FPS含量的變化 從圖3可見，與C組比較，血漿FPS含量缺血時(shí)無明顯改變，再灌注60 min明顯升高(P<0.01)且高于缺血時(shí)(P<0.05)，再灌注120 min顯著下降(P<0.05)。

與C組比較：cP<0.01；與缺血時(shí)比較：fP<0.05

2.4 各處理組大鼠血漿APTT(s)的變化 隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)APTT明顯縮短，與C組比較，再灌注60 min縮短(P<0.05)，再灌注120 min縮短更加顯著(P<0.01)。見表2。

表2 大鼠血漿APTT變化的組間比較Tab 2 Comparison of the APTT changes between the two groups of

與C組比較☆P<0.05，☆☆P<0.01；與缺血組比較##P<0.01

3 討論

急性心肌梗死的常用治療方法為再通術(shù)，然而大量的研究證實(shí)心肌缺血再灌注可引起凝血途徑激活、血栓形成，使本已受損的心肌進(jìn)一步惡化[8]，MIRI的發(fā)生發(fā)展過程中血漿PC活性發(fā)生了顯著改變。血漿PC系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)的生理性抗凝組分，包括PC、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白、蛋白質(zhì)S及蛋白質(zhì)C的抑制物等部分，它們可使活化的因子Ⅷ及因子Ⅴ滅活，從而起到抗凝效應(yīng)，血漿中的蛋白質(zhì)S是活化蛋白質(zhì)C的輔助因子，可使其對(duì)活化的因子Ⅷ及因子Ⅴ滅活作用大大增強(qiáng)。研究證實(shí)血漿PC不足或缺乏是導(dǎo)致血栓性疾病的因素之一[9]。結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支可引起心肌缺血缺氧、血管內(nèi)皮受損導(dǎo)致凝血和抗凝功能失衡[10]，同時(shí)激活血漿PC系統(tǒng)。有研究表明心肌缺血時(shí)血漿中內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)含量增加[7],血漿PC與大量EPCR結(jié)合加速了消耗，導(dǎo)致其活性下降。冠狀動(dòng)脈再通后氧自由基隨著血流的急劇增加而增多，血管內(nèi)皮受損加重[11-12],凝血和抗凝系統(tǒng)進(jìn)一步破壞，血液呈高凝狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)中亦顯示APTT縮短，同時(shí)血漿FPS含量代償性增多，可以大大增強(qiáng)血漿PC的活性[13]，從而導(dǎo)致再灌注初期血漿PC活性回升。有研究表明血漿FPS含量改變是血栓性疾病的一個(gè)獨(dú)立因素[14]。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，血管內(nèi)皮的持續(xù)損傷，血液呈高凝狀態(tài)，凝血因子持續(xù)消耗,血漿FPS含量下降，血漿PC也在抗凝過程中被大量消耗。因此，血漿PC活性的變化可以較靈敏地反映MIRI各個(gè)階段的變化,檢測(cè)血漿PC活性變化對(duì)MIRI的病情監(jiān)測(cè)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

以五步蛇毒PCA制備的血漿蛋白C活性檢測(cè)試劑經(jīng)前期應(yīng)用發(fā)現(xiàn)具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[15]，本實(shí)驗(yàn)通過發(fā)色底物法，用我們自己制備的血漿蛋白C檢測(cè)試劑，與缺血前比較，檢測(cè)到MIRI大鼠血漿PC活性在缺血30 min時(shí)下降18%，再灌注60 min時(shí)點(diǎn)上升15%，再灌注120 min時(shí)點(diǎn)卻再次下降17%；與此相對(duì)應(yīng)，血漿FPS含量缺血30 min時(shí)無明顯改變，再灌注60 min時(shí)點(diǎn)明顯升高，再灌注120 min時(shí)點(diǎn)顯著下降；同時(shí)，與C組相比較，MIRI大鼠血漿APTT隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)APTT明顯縮短。

由此得出結(jié)論，我們用五步蛇毒PCA制備的血漿蛋白C活性檢測(cè)試劑能檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)性MIRI大鼠血漿PC活性呈動(dòng)態(tài)變化，可以為臨床心肌缺血再灌注損傷患者的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 覃公平,王云獻(xiàn),韋傳寶.中國(guó)毒蛇學(xué)[M].2版.廣西：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1998:19．

[2] MURAKAMI MT,ARNI RK.Thrombomodu-lin-independentActivation of protein C and specificity of hemo-statically active snake venom serine prot-einases[J].Biolo Chem,2005,280(47):39309-39315.

[3] MAQBOOL S,RASTOGI V,SETH A,etal.Protein-C deficiency presenting as pulmonary embolism and myocardial infarction in the same patient[J].Thromb J,2013,11(1):19.

[4] TATLI E,OZCELIK F,AKTOK M,etal.Plasma fibrinogen level may predict critical coronary artery stenosis in young adults with myocardial infarction[J].Cardiol J,2009,16(4):317-320.

[5] RAIVIO P,FERNANDEZ JA,KUITUNEN A,etal.Activation of protein C and hemodynamic recovery after coronary artery bypass surgery[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2007,133(1):44-51.

[6] AMARAL A,OPAL SM,VINCENT JL.Coagulation in sepsis[J].Intensive Care Med,2004,30(6):1032-1040.

[7] 王斐，張根葆，黃璐，等.尖吻蝮蛇毒PCA在急性心肌梗死診斷中應(yīng)用[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013，32(5):352-355.

[8] 董化江，單娜娜，羅悅晨，等.左旋精氨酸對(duì)急性心肌缺血/再灌注損傷大鼠內(nèi)皮素-1的影響[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2011,23(12):731-733.

[9] POMP ER,DOGGEN CJ,VOS HL,etal.Polymorphisms in the protein C gene as risk factor for venous thrombosis[J].Thromb Haemost,2009,101(1):62-67.

[10] CHEN Jianxiong,ZENG Heng,TUO Qinhui,etal.NADPH oxidase modulates myocardial Akt,ERK1/2 activation,and angiogenesis after hypoxia-reoxygenation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292(4):H1664-1674．

[11] TRITTO I,ZUCHI C,VITALE S,etal.Therapy against reperfusion-induced microvascular injury[J].Curr Pharm Des,2013,19(25):4586-4596.

[12] STANGER O1,AIGNER I,SCHIEMTTA W,etal.Antioxidant supplementation attenuates oxidative stress in patients undergoing coronary artery bypass graft surgery[J].Tohoku J Exp Med，2014,232(2):145-154.

[13] 羅自強(qiáng),朱大年.生理學(xué)[M]．7版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：67．

[14] 王宗奎，林方昭，肖小璞，等.蛋白C、蛋白S的研究與應(yīng)用[J].中國(guó)輸血雜志,2010,23(4):322-326.

[15] 張根葆，陳冬云，周志泳，等.蝮蛇毒蛋白C激活物的純化與抗血小板活性[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,24(1):8-10.