王珂　高曉勤　邱靜

【摘要】 目的：研究人精子頂體內(nèi)透明酸酶（HYD）對男性生育力的影響。方法：收集不育男性精液44例，根據(jù)精液常規(guī)檢查結(jié)果分為不育A、B、C、D四組；正常生育男性精液26例為正常生育組。采用改良透明質(zhì)酸鈉-明膠（NaHY-Gelatin）底物膜法檢測精子頂體內(nèi)HYD活性強度、陽性率及反應(yīng)時間，研究精子形態(tài)與HYD活性強弱的關(guān)系。同時采用固定明膠底膜法檢測精子頂體內(nèi)蛋白酶（Acrosin），并對兩種酶檢測結(jié)果作直線相關(guān)分析，精液分析儀進(jìn)行精液質(zhì)量分析。結(jié)果：正常生育組HYD反應(yīng)平均陽性率為（70.84±19.20）%，HYD活性亮區(qū)平均直徑為（38.17±16.41）μm；不育組總體HYD分別為（37.01±35.13）%、（23.05±17.32）μm；不育A組分別為（60.02±29.10）%、（26.92±17.21）μm；不育B組分別為（16.11±4.64）%、（6.90±2.00）μm；不育C組分別為（29.11±11.85）%、（8.22±3.37）μm；不育D組分別為（53.04±28.60）%、（31.40±18.60）μm。正常生育組HYD反應(yīng)陽性率和HYD活性強度與不育B、C組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與A、D組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Acrosin活性檢測的相應(yīng)數(shù)據(jù)證明人精子HYD活性與Acrosin活性呈顯著正相關(guān)（r=0.810）。結(jié)論：精子內(nèi)HYD活性低下是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一；檢測精子頂體內(nèi)HYD可作為臨床評價精子功能的有效指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 精子； 透明質(zhì)酸葡萄糖胺酶； 男性； 不育

【Abstract】 Objective： To investigate the effect of human sperm hyaluronidase on male fertile ability. Method： 44 semen samples of infertile patients were collected， and they were divided into 4 groups （A， B， C， D） according to the results of semen routine examine； 26 samples were collected from normal fertile men as control group. The improved sodium hyaluronate - gelatin substrate film technique was used to determine the acrosomal hyaluronidase active intension， positive reaction rates and the enzyme reaction time in single sperm， the relationship between sperm morphology and hyaluronidase activity were studied； at the same time， acrosin activity was determined by fixed gelatin substrate film technique， and the correlationship of the two acrosomal enzymes was analyzed. CASA was made by sperm quality analyzer . Result： In the control group， the mean positive reaction rate of the sperm hyaluronidase was （70.84±19.20）%， and the mean diameters of hyaluronidase reaction area was （38.17±16.41）?m. The infertile groups were （37.01±35.13）%， （23.05±17.32）?m . In the experimental groups A， B， C and D， the mean positive reaction of hyaluronidase were （60.02±29.10）%， （16.11±4.64）%，（29.11±11.85）% and （53.04±28.60）%； the mean diameters of hyaluronidase reaction area were （26.92±17.21）?m， （6.90±2.00）?m， （8.22±3.37）?m and （31.40±18.60）?m. There were significant statistical difference in the positive reaction rate and active intension of the hyaluronidase between the fertile group and the infertile the group B， C （P<0.01）. There were no significant statistical difference with the group A， D（P>0.05）. There were obviously statistical correlationship between hyaluronidase activity and acrosin activity （r=0.810）. Conclusion： The inactivity of sperm HYD is an important pathological reason of male infertility； detecting the activity of sperm HYD can be an clinical indicator to valuate the sperm function.endprint

【Key words】 Spermatozoa； Hyaluronoglucosaminidase； Male； Infertility

人精子頂體內(nèi)透明質(zhì)酸酶（HYD）為定位于頂體內(nèi)膜、在酸性環(huán)境中具有HYD活性的一種糖基磷脂酰肌醇（GIP）錨著的單鏈膜蛋白[1]，是一種PH-20。由于環(huán)境及多重因素影響，男性不育發(fā)病率在世界上有逐年上升到趨勢[2]。本研究采用一種較新的改良基質(zhì)膜法及細(xì)胞孵育培養(yǎng)等組織學(xué)技術(shù)，通過連續(xù)觀察單個精子內(nèi)HYD活性反應(yīng)的強弱、陽性率高低[3]，對其與精子形態(tài)學(xué)及頂體內(nèi)蛋白酶之間的關(guān)系作了系統(tǒng)的觀察、分析和對比研究。獲取了關(guān)于HYD活性的若干數(shù)據(jù)，以期探明精子的形態(tài)、數(shù)量和活力與HYD活性的密切關(guān)系，以及HYD與頂體內(nèi)其他酶在受精過程中相互影響情況，從理論上為男性不育癥精子內(nèi)HYD的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究男性不育組標(biāo)本均來自貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心不育癥診察室門診就診者，共44例，年齡24～43歲，婚后兩年以上不育。按WHO標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)精液質(zhì)量分析儀檢測及精液常規(guī)檢查分析結(jié)果分為不育A、B、C、D四組。不育A組：精液常規(guī)檢查無異常即不明原因婚后兩年以上不生育者，共13例；不育B組：臨床檢測為少精或無精癥患者，共12例；不育C組：臨床免疫生化檢查為抗精子抗體（AsAb）陽性者，共9例；不育D組：曾有泌尿生殖系統(tǒng)炎癥或疾病史者，共10例。在檢測頂體內(nèi)蛋白酶（Acrosin）時將不育組僅分為兩組，將精液常規(guī)檢測正常的稱為不育AAcrosin組，精液常規(guī)檢測異常的稱為不育BAcrosin組。正常生育組：有子女的健康男性提供的新鮮精液標(biāo)本，常規(guī)檢查各項指標(biāo)均正常，共26例。

1.2 精液標(biāo)本收集 禁欲1周后，于室溫25～30 ℃下按摩取精液，自行液化。

1.3 儀器及設(shè)備 Anke-GL-16 G-Ⅱ高速冷凍離心機；SPX-150C型恒溫恒濕箱；HHS-B型恒溫水浴鍋；Sartorius BS2103電子天平；偉力WLJY9000彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)；Leica DME光學(xué)顯微鏡，Leica DFC顯微照相機及Mias攝影圖像分析系統(tǒng)；SONY數(shù)字照片打印機。

1.4 檢測方法

1.4.1 試劑及底膜制作 （1）HYD檢測法：試劑包括透明質(zhì)酸鈉、明膠、醋酸、醋酸鈉、甲苯胺蘭、甲醛；雙蒸水等。自制為試劑盒備用。（2）Acrosin檢測法：試劑包括明膠、戊二醛、巴比妥鈉醋酸緩沖液、臺盼蘭、pH 7.3磷酸鹽緩沖液、雙蒸水等，自制為試劑盒備用。

1.4.2 標(biāo)本處理 采集的新鮮精液液化后，室溫下以2400 r/m離心10 min，共兩次，以PBS液洗兩次。沉淀物懸浮于2倍以上磷酸鹽緩沖液（PBS液）中，分作雙份備用。

1.4.3 HYD檢測法 將藥盒底膜片取出放入0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4）20 min，以校正pH值。將上述PBS精子懸浮液1～2滴涂于藥盒底膜片，置于37 ℃恒溫恒濕箱孵育。3 h后取出，室溫下干燥，于普通光鏡下觀察孵育結(jié)果。正常組取10例每例增加3張涂片分別于30 min及1、2 h后取出鏡檢（觀察酶最早陽性反應(yīng)時間）。

1.4.4 Acrosin檢測法 將藥盒底膜片置于巴比妥鈉醋酸緩沖液緩沖10 s，取出，干燥后將精子PBS懸浮液1～2滴均勻地鋪在底膜片上，置37 ℃恒濕恒溫箱中孵育（其中不育組標(biāo)本只有AAcrosin、BAcrosin兩組）。2 h后取出，室溫下干燥鏡檢。

1.5 分類標(biāo)準(zhǔn)及觀察指標(biāo)

1.5.1 標(biāo)本分類 以精子質(zhì)量分析儀對每份標(biāo)本進(jìn)行計算機輔助精液分析（CASA）并參考臨床精液常規(guī)檢查項目，以WHO規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)按現(xiàn)有實驗條件分類標(biāo)本。

1.5.2 觀察精子頂體HYD及Acrosin陽性率 終止孵育后，每份孵育涂片在光鏡下均勻選擇5～6個視野，隨機觀察200個精子頭部，出現(xiàn)周圍暈環(huán)者視為陽性反應(yīng)。

1.5.3 酶活性強度 測微尺測量視野下每個精子頭部暈環(huán)直徑（即酶活性亮區(qū)）的大小，取其平均值作為判斷HYD及Acrosin活性強度的指標(biāo)。

1.5.4 酶反應(yīng)時間 HYD孵育片于3 h后取出觀察，其中10例正常生育組標(biāo)本每例增加的涂片從孵育30 min后開始觀察，并在設(shè)定的不同時間內(nèi)計算酶的陽性反應(yīng)率。由于以往研究已證明Acrosin 2 h后反應(yīng)已終止，故直接于孵育2 h后取出鏡檢。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用 字2檢驗，兩種酶的相互作用采用直線相關(guān)性分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HYD的陽性率及活性強度比較

2.1.1 正常生育組 對照未加底物的正常標(biāo)本孵育涂片無消化暈，不能顯示HYD活性，證明該實驗底膜對檢測HYD的特異性。正常生育組的HYD反應(yīng)平均陽性率為（70.84±19.20）%，最高陽性率可達(dá)92.45%；HYD活性亮區(qū)直徑平均為（38.17±16.41）?m，最大直徑可達(dá)150 ?m。

2.1.2 不育A組（不明原因不育組） HYD平均反應(yīng)陽性率為（60.02±29.10）%，最高達(dá)92.86%；HYD活性亮區(qū)平均直徑為（26.92±17.21）?m，最大可達(dá)96 ?m。上述兩項指標(biāo)與正常生育組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.1.3 不育B組 HYD平均反應(yīng)陽性率為（16.11±4.64）%，HYD活性亮區(qū)平均直徑為（6.90±2.00）?m。該組酶活性明顯較正常生育組差，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.821、4.955，P<0.01）。endprint

2.1.4 不育C組 HYD平均反應(yīng)陽性率為（29.11±11.85）%，最高達(dá)78.79%；HYD活性亮區(qū)平均直徑為（8.22±3.37）?m，最大直徑為21 ?m。該組兩項指標(biāo)與正常生育組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.842、5.559，P<0.01）。

2.1.5 不育D組 HYD反應(yīng)平均陽性率為（53.04±28.60）%，最高達(dá)94.78%；HYD活性亮區(qū)平均直徑為（31.40±18.60）?m，最大達(dá)90 ?m。該組兩項指標(biāo)與正常生育組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

上述各組HYD的陽性率及活性亮區(qū)直徑比較均見表1。

2.2 不育組總體情況與正常生育組的比較 不育組總體酶活性較正常生育組差，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.093、2.860，P<0.01），見表2。

2.3 HYD與Acrosin活性相關(guān)性分析 經(jīng)直線相關(guān)分析，不育組精子頂體內(nèi)HYD與Acrosin平均反應(yīng)陽性率呈顯著正相關(guān)性，且存在統(tǒng)計學(xué)意義上的正相關(guān)（r=0.810，P<0.01）。

3 討論

研究表明，精液常規(guī)檢查及精液質(zhì)量分析顯示為少精、精子活力差或畸形精子多的不育組，與正常生育組比較其HYD活性均明顯為低?？芍親YD的活性首先依賴于頂體的完整狀態(tài)?；渭盎盍Σ畹木悠漤旙w也常為畸形（如頂體內(nèi)外膜通透性改變、不完整或缺失），從而導(dǎo)致頂體反應(yīng)前酶活性的散失，降低了精子穿越放射冠的能力。而對于少精癥患者，其使放射冠細(xì)胞分散、放射冠移除顯然極低，還常伴有精子活率低，向前運動能力差以及精子畸形率高等改變[4]。實驗證明在男性不育癥患者的精子中頂體HYD活性與精子濃度呈明顯正相關(guān)，當(dāng)精子濃度低于10×106/mL時HYD活性降到最低[5]。臨床免疫生化檢查為抗精子抗體（AsAb）陽性者，孵育結(jié)果提示其酶反應(yīng)陽性率及酶活性強度均低于正常對照組。從免疫學(xué)觀點來看，分子量超過10 KDa，表面具有一定化學(xué)結(jié)構(gòu)，含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸或自身遠(yuǎn)隔成分的自體蛋白等等，均可成為抗原[6]。人體精液內(nèi)HYD即PH-20已被證明是一種遠(yuǎn)隔自體蛋白抗原。有研究發(fā)現(xiàn)用基因重組技術(shù)得到的重組PH-20，可完全解離圍繞在鼠卵母細(xì)胞周圍的放射冠細(xì)胞，而與抗PH-20抗體共育的頂體完整的精子不能穿透放射冠層到達(dá)透明帶[7]。附睪功能障礙因素（如附睪炎、解脲脲原體感染）亦可引起精子頂體膜破損，使頂體內(nèi)酶流失，導(dǎo)致部分患者不育。有研究證明，附睪功能障礙時，由附睪上皮分泌的精漿中性α-1，4G可以影響精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性，從而影響生育[8]。

研究顯示Acrosin與HYD呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證明受精過程中頂體內(nèi)多種酶系的參與和相互影響，HYD含量及活性的改變，同時會影響其他關(guān)鍵酶在受精過程中的作用，進(jìn)而導(dǎo)致多因素不育[9-12]。

綜上所述，盡管存在多種男性不育相關(guān)因素，精子頂體內(nèi)HYD活性低下是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一，檢測精子頂體內(nèi)HYD可作為臨床評價精子功能的有效指標(biāo)。在行不同類型的人工輔助生育技術(shù)（ART）、卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)（ICSI）時，對所采用精子的篩選亦具有重要的臨床意義。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-03-14） （本文編輯：蔡元元）endprint

2.1.4 不育C組 HYD平均反應(yīng)陽性率為（29.11±11.85）%，最高達(dá)78.79%；HYD活性亮區(qū)平均直徑為（8.22±3.37）?m，最大直徑為21 ?m。該組兩項指標(biāo)與正常生育組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.842、5.559，P<0.01）。

2.1.5 不育D組 HYD反應(yīng)平均陽性率為（53.04±28.60）%，最高達(dá)94.78%；HYD活性亮區(qū)平均直徑為（31.40±18.60）?m，最大達(dá)90 ?m。該組兩項指標(biāo)與正常生育組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

上述各組HYD的陽性率及活性亮區(qū)直徑比較均見表1。

2.2 不育組總體情況與正常生育組的比較 不育組總體酶活性較正常生育組差，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.093、2.860，P<0.01），見表2。

2.3 HYD與Acrosin活性相關(guān)性分析 經(jīng)直線相關(guān)分析，不育組精子頂體內(nèi)HYD與Acrosin平均反應(yīng)陽性率呈顯著正相關(guān)性，且存在統(tǒng)計學(xué)意義上的正相關(guān)（r=0.810，P<0.01）。

3 討論

研究表明，精液常規(guī)檢查及精液質(zhì)量分析顯示為少精、精子活力差或畸形精子多的不育組，與正常生育組比較其HYD活性均明顯為低?？芍親YD的活性首先依賴于頂體的完整狀態(tài)?；渭盎盍Σ畹木悠漤旙w也常為畸形（如頂體內(nèi)外膜通透性改變、不完整或缺失），從而導(dǎo)致頂體反應(yīng)前酶活性的散失，降低了精子穿越放射冠的能力。而對于少精癥患者，其使放射冠細(xì)胞分散、放射冠移除顯然極低，還常伴有精子活率低，向前運動能力差以及精子畸形率高等改變[4]。實驗證明在男性不育癥患者的精子中頂體HYD活性與精子濃度呈明顯正相關(guān)，當(dāng)精子濃度低于10×106/mL時HYD活性降到最低[5]。臨床免疫生化檢查為抗精子抗體（AsAb）陽性者，孵育結(jié)果提示其酶反應(yīng)陽性率及酶活性強度均低于正常對照組。從免疫學(xué)觀點來看，分子量超過10 KDa，表面具有一定化學(xué)結(jié)構(gòu)，含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸或自身遠(yuǎn)隔成分的自體蛋白等等，均可成為抗原[6]。人體精液內(nèi)HYD即PH-20已被證明是一種遠(yuǎn)隔自體蛋白抗原。有研究發(fā)現(xiàn)用基因重組技術(shù)得到的重組PH-20，可完全解離圍繞在鼠卵母細(xì)胞周圍的放射冠細(xì)胞，而與抗PH-20抗體共育的頂體完整的精子不能穿透放射冠層到達(dá)透明帶[7]。附睪功能障礙因素（如附睪炎、解脲脲原體感染）亦可引起精子頂體膜破損，使頂體內(nèi)酶流失，導(dǎo)致部分患者不育。有研究證明，附睪功能障礙時，由附睪上皮分泌的精漿中性α-1，4G可以影響精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性，從而影響生育[8]。

研究顯示Acrosin與HYD呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證明受精過程中頂體內(nèi)多種酶系的參與和相互影響，HYD含量及活性的改變，同時會影響其他關(guān)鍵酶在受精過程中的作用，進(jìn)而導(dǎo)致多因素不育[9-12]。

綜上所述，盡管存在多種男性不育相關(guān)因素，精子頂體內(nèi)HYD活性低下是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一，檢測精子頂體內(nèi)HYD可作為臨床評價精子功能的有效指標(biāo)。在行不同類型的人工輔助生育技術(shù)（ART）、卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)（ICSI）時，對所采用精子的篩選亦具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2014-03-14） （本文編輯：蔡元元）endprint

2.1.4 不育C組 HYD平均反應(yīng)陽性率為（29.11±11.85）%，最高達(dá)78.79%；HYD活性亮區(qū)平均直徑為（8.22±3.37）?m，最大直徑為21 ?m。該組兩項指標(biāo)與正常生育組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.842、5.559，P<0.01）。

2.1.5 不育D組 HYD反應(yīng)平均陽性率為（53.04±28.60）%，最高達(dá)94.78%；HYD活性亮區(qū)平均直徑為（31.40±18.60）?m，最大達(dá)90 ?m。該組兩項指標(biāo)與正常生育組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

上述各組HYD的陽性率及活性亮區(qū)直徑比較均見表1。

2.2 不育組總體情況與正常生育組的比較 不育組總體酶活性較正常生育組差，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.093、2.860，P<0.01），見表2。

2.3 HYD與Acrosin活性相關(guān)性分析 經(jīng)直線相關(guān)分析，不育組精子頂體內(nèi)HYD與Acrosin平均反應(yīng)陽性率呈顯著正相關(guān)性，且存在統(tǒng)計學(xué)意義上的正相關(guān)（r=0.810，P<0.01）。

3 討論

研究表明，精液常規(guī)檢查及精液質(zhì)量分析顯示為少精、精子活力差或畸形精子多的不育組，與正常生育組比較其HYD活性均明顯為低?？芍親YD的活性首先依賴于頂體的完整狀態(tài)?；渭盎盍Σ畹木悠漤旙w也常為畸形（如頂體內(nèi)外膜通透性改變、不完整或缺失），從而導(dǎo)致頂體反應(yīng)前酶活性的散失，降低了精子穿越放射冠的能力。而對于少精癥患者，其使放射冠細(xì)胞分散、放射冠移除顯然極低，還常伴有精子活率低，向前運動能力差以及精子畸形率高等改變[4]。實驗證明在男性不育癥患者的精子中頂體HYD活性與精子濃度呈明顯正相關(guān)，當(dāng)精子濃度低于10×106/mL時HYD活性降到最低[5]。臨床免疫生化檢查為抗精子抗體（AsAb）陽性者，孵育結(jié)果提示其酶反應(yīng)陽性率及酶活性強度均低于正常對照組。從免疫學(xué)觀點來看，分子量超過10 KDa，表面具有一定化學(xué)結(jié)構(gòu)，含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸或自身遠(yuǎn)隔成分的自體蛋白等等，均可成為抗原[6]。人體精液內(nèi)HYD即PH-20已被證明是一種遠(yuǎn)隔自體蛋白抗原。有研究發(fā)現(xiàn)用基因重組技術(shù)得到的重組PH-20，可完全解離圍繞在鼠卵母細(xì)胞周圍的放射冠細(xì)胞，而與抗PH-20抗體共育的頂體完整的精子不能穿透放射冠層到達(dá)透明帶[7]。附睪功能障礙因素（如附睪炎、解脲脲原體感染）亦可引起精子頂體膜破損，使頂體內(nèi)酶流失，導(dǎo)致部分患者不育。有研究證明，附睪功能障礙時，由附睪上皮分泌的精漿中性α-1，4G可以影響精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性，從而影響生育[8]。

研究顯示Acrosin與HYD呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證明受精過程中頂體內(nèi)多種酶系的參與和相互影響，HYD含量及活性的改變，同時會影響其他關(guān)鍵酶在受精過程中的作用，進(jìn)而導(dǎo)致多因素不育[9-12]。

綜上所述，盡管存在多種男性不育相關(guān)因素，精子頂體內(nèi)HYD活性低下是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一，檢測精子頂體內(nèi)HYD可作為臨床評價精子功能的有效指標(biāo)。在行不同類型的人工輔助生育技術(shù)（ART）、卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)（ICSI）時，對所采用精子的篩選亦具有重要的臨床意義。

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