林慧娟,方 東,向 量,謝莉萍,王洪鐘,張貴友,麻彩萍,張榮慶

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,北京 100084)

生物礦化是指生物體通過生物有機(jī)物質(zhì)調(diào)控?zé)o機(jī)礦物,在其體內(nèi)特定部位有序沉積的過程[1]。常見的生物礦物,如牙齒、骨骼、貝殼等可以強(qiáng)化組織、支撐結(jié)構(gòu)與保護(hù)生物體;此外,趨磁細(xì)菌體內(nèi)的磁小體還具有磁力感應(yīng)和導(dǎo)航的功能[1-2]。生物體通過生物有機(jī)質(zhì)調(diào)控生物礦化過程,使生物礦物具有與其多種功能相適應(yīng)的晶型與晶貌。

作為典型的碳酸鈣生物礦物,珍珠具有機(jī)械性能優(yōu)良、結(jié)構(gòu)精細(xì)、形成環(huán)境溫和、生物相容性好等天然礦物和人工合成礦物所不具備的優(yōu)勢。因此,其形成機(jī)理一直被生物學(xué)家、材料學(xué)家等所關(guān)注。由于珍珠和貝殼珍珠層均由文石組成,且其晶貌、物質(zhì)組成相近,對貝殼文石層形成機(jī)理的研究是珍珠形成機(jī)理研究的重要組成部分。天然碳酸鈣礦物相比,貝殼最大的特點(diǎn)是其中含有5%左右的有機(jī)大分子[1-2]。因此,對其生物礦化分子機(jī)理的研究主要集中在這些有機(jī)基質(zhì)(organic matrix),尤其是基質(zhì)蛋白(matrix protein)對晶體生長的調(diào)控作用上。研究表明,基質(zhì)蛋白參與了貝殼有機(jī)框架形成[3]、誘導(dǎo)碳酸鈣結(jié)晶并控制晶體形狀[4]與類型[5]、調(diào)控貝殼礦化過程[6-7]等幾乎整個貝殼形成過程。貝殼一般由棱柱層和珍珠層組成,通常認(rèn)為,棱柱層來源的生物大分子促進(jìn)方解石的形成而珍珠層來源的生物大分子與文石的形成密切相關(guān)[6-11]。因此,貝殼珍珠層來源生物大分子對珍珠的形成具有重要的意義。無定形碳酸鈣(amorphous calcium carbonate,ACC)是碳酸鈣晶體中溶解度最高、最不穩(wěn)定的結(jié)晶形式。早在20世紀(jì)初,人們就在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 ACC[12],但是其分布的有限性和不穩(wěn)定性阻礙了人們對其的研究。研究表明,ACC可以被視為由 Ca2+和形成穩(wěn)定碳酸鈣晶體過程中的中間形[13],生物體通過精密調(diào)控ACC的穩(wěn)定性來控制其晶型轉(zhuǎn)化過程以及礦化產(chǎn)物的晶型與晶貌。2007年Ma 等[19]在合浦珠母貝間液中發(fā)現(xiàn)ACC結(jié)合蛋白以來,對ACC晶型轉(zhuǎn)化及其分子調(diào)控機(jī)制的研究成為了生物礦化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。常溫常壓下,ACC在體外水溶液中很快發(fā)生晶型轉(zhuǎn)化形成穩(wěn)定晶型。轉(zhuǎn)化過程的迅速性是造成研究ACC晶型轉(zhuǎn)化過程具有難度的主要原因。因此,對ACC晶型轉(zhuǎn)化過程中穩(wěn)定性及其機(jī)理的研究,不僅有助于闡明生物體如何調(diào)控 ACC的穩(wěn)定性,也有助于對ACC的晶型轉(zhuǎn)化進(jìn)行體外研究。生物體內(nèi)還存在一些穩(wěn)定的ACC。對其研究表明,其大多含有Mg2+[20]。體外研究表明,人工合成的ACC可以分別被間液[21]和Mg2+[19]穩(wěn)定。

雖然珍珠層基質(zhì)蛋白對于生物礦化具有重要作用,但目前的研究集中在其在無機(jī)離子形成穩(wěn)定晶體過程中的整體作用[6,22-25],對于其在 ACC晶型轉(zhuǎn)化階段中的作用涉及較少。但鑒于ACC的穩(wěn)定及晶型轉(zhuǎn)化在生物礦化中的重要性,不難推測,基質(zhì)蛋白對ACC的穩(wěn)定及晶型轉(zhuǎn)化具有重要作用,且這種作用很有可能伴隨著ACC中Mg2+含量的變化。因此,本研究通過研究合浦珠母貝貝殼珍珠層 EDTA可溶性基質(zhì)蛋白(ESM),對 ACC晶型轉(zhuǎn)化過程中是否具有穩(wěn)定ACC的作用,及在此過程中晶體鎂鈣比的變化,初步探討了貝殼珍珠層基質(zhì)蛋白對ACC穩(wěn)定及晶型轉(zhuǎn)化的作用及其可能的機(jī)制,為闡明生物礦化機(jī)制及體外合成珍珠提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

合浦珠母貝采自廣西北海市珍珠總公司珍珠養(yǎng)殖場。

1.1.2 試劑

CaCl2·2H2O購于 Sigma公司;其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 ACC的制備

以去離子水為溶劑分別制備A溶液(20 mmol/L碳酸鈉,0.2 mol/L氫氧化鈉)和B溶液(20 mmol/L氯化鈣),并于4℃冷卻6 h以上。將等體積A溶液與B溶液于 4℃混合,并迅速混勻后進(jìn)行抽濾以除去水分,將反應(yīng)所得沉淀用丙酮沖洗3次,無水乙醇沖洗3次后,真空晾干24 h。

1.2.2 合浦珠母貝貝殼珍珠層EDTA可溶性基質(zhì)蛋白的提取

取新鮮珍珠貝殼,用2 mol/LNaOH處理3 d后將棱柱層用機(jī)械方法刮除。將珍珠層研磨至粉末狀,取10 g溶解于 50 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)中,于4℃用力攪拌4 d,離心。將蛋白溶液用2 μm濾膜過濾后于3 kD超濾管中3 900 g,4℃離心濃縮并將溶劑替換為Tris-Cl(pH8.0)。采用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行檢測。

1.2.3 ACC體外轉(zhuǎn)化

中的方法[26]并進(jìn)行了細(xì)微調(diào)整。將ACC加入到二甘醇(Diethylene glycol,DEG)中(3.95 mg/mL)。將 1.6mLTris-Cl、MgCl2(1 mmol/L)以及20 μ g/mL貝殼珍珠層EDTA可溶性基質(zhì)蛋白分別加入到 1.24 mLDEG中形成反應(yīng)溶液。將0.76 mLACC-DEG混合溶液加入到反應(yīng)溶液中,取不同轉(zhuǎn)化時間的 ACC離心并用乙醇多次分散去除DEG后進(jìn)行FTIR檢測。為了觀察貝殼珍珠層EDTA可溶性基質(zhì)蛋白在反應(yīng)液中有 Mg2+存在時對 ACC轉(zhuǎn)化的影響,先將 1.36 mLMgCl2(1mmol/L)加入到0.94 mLDEG中,再加入0.76 mLACC-DEG混合溶液,1 h后加入貝殼珍珠層EDTA可溶性基質(zhì)蛋白(20 μg/mL),同樣取不同轉(zhuǎn)化時間的ACC做FTIR檢測。上述溶液濃度均為反應(yīng)體系中的終濃度,MgCl2及蛋白均溶解于Tris-Cl溶液(pH8.0)中。反應(yīng)在室溫環(huán)境下進(jìn)行。

1.2.4 傅立葉變換紅外色譜(FTIR)檢測

將1.2.3中的ACC樣品與KBr混合研磨均勻壓片,測定紅外光譜。FTIR紅外光譜儀系美國 Thermofisher公司的Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀,掃描波數(shù)為4 000～400 cm–1,掃描32次。

1.2.5 X射線衍射(XRD)光譜檢測

將1.2.1中的ACC樣品進(jìn)行XRD檢測。測試參數(shù): 步距 2(°/min),2θ角范圍 10°～120°。X 射線衍射儀系日本理學(xué)公司的D/max 2500立式X射線衍射儀,儀器參數(shù): 40 kV,200 mA,Cu-Kα輻射。

1.2.6 掃描電鏡(SEM)及能譜(EDS)檢測

將 1.2.3干燥的 ACC樣品噴碳鍍膜后利用SEM-EDS聯(lián)用儀進(jìn)行SEM及EDS檢測,掃描電鏡系美國 FEI公司的 QUANTA200F,儀器參數(shù): 加速電壓15 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外制備ACC的性質(zhì)鑒定

圖1 ACC的X射線衍射圖譜Fig.1 XRD pattern of ACC

對制備產(chǎn)物進(jìn)行 XRD 檢測(圖 1)發(fā)現(xiàn),圖譜中只有 20°～40°(2θ)和 40°～50°(2θ)之間分別檢測到一個寬闊的衍射峰,并沒有檢測到方解石、文石等結(jié)晶態(tài)碳酸鈣的任何特征衍射峰,表明在制備過程中 ACC沒有發(fā)生晶型轉(zhuǎn)化。掃描電鏡結(jié)果(圖 2)顯示,制備產(chǎn)物為均勻球狀顆粒,沒有檢測到體外結(jié)晶的方解石晶體的正方體或文石晶體的針簇狀形貌,表明ACC保持了其無定形狀態(tài)。

圖2 掃描電子顯微鏡下ACC的形貌Fig.2 SEM image of ACC

2.2 珍珠層EDTA可溶性基質(zhì)蛋白對ACC穩(wěn)定性及晶型轉(zhuǎn)化的影響

取1.2.3中ACC晶型轉(zhuǎn)化體外反應(yīng)體系中不同反應(yīng)時間的碳酸鈣樣品分別進(jìn)行FTIR檢測。結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)化體系不含有 Mg2+的情況下,ACC在水溶液中反應(yīng)5 min后的樣品便在712 cm–1檢測到典型的方解石吸收峰,表明水溶液中ACC迅速轉(zhuǎn)化為方解石(圖3)。在Tris-Cl緩沖溶液中ACC轉(zhuǎn)化較在水溶液中緩慢,但仍在10 min內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)化形成方解石(圖4A)。加入 20 μg/mL珍珠層 ESM后 ACC的轉(zhuǎn)化速率明顯減慢,在1 h后才發(fā)生轉(zhuǎn)化形成方解石(圖4B)。結(jié)果表明,珍珠層ESM具有穩(wěn)定ACC的作用,穩(wěn)定時間大于1 h。

圖3 水溶液中ACC的轉(zhuǎn)化速率Fig.3 FT-IR spectra of ACC in water at different time intervals

在ACC晶型轉(zhuǎn)化體外反應(yīng)體系中含有1 mmol/L Mg2+的情況下,未加入珍珠層 ESM 時,Mg2+并沒有明顯的穩(wěn)定ACC的作用,ACC在30 min之內(nèi)便發(fā)生轉(zhuǎn)化形成方解石(圖3C),表明1 mmol/L的Mg2+對于ACC的穩(wěn)定作用不及20 μg/mL的珍珠層ESM。但在反應(yīng)體系中加入20 μg/mL珍珠層ESM后,ACC的轉(zhuǎn)化明顯受到抑制,在轉(zhuǎn)化體系中反應(yīng)23 h后仍穩(wěn)定存在而不發(fā)生轉(zhuǎn)化(圖3D)。結(jié)果表明,Mg2+和珍珠層ESM對于ACC的穩(wěn)定具有協(xié)同作用。Mg2+和珍珠層ESM對于ACC的穩(wěn)定時間分別小于30 min和3 h,但體系中同時存在Mg2+和珍珠層ESM時,ACC的穩(wěn)定時間可長達(dá)24 h以上。

在ACC晶型轉(zhuǎn)化體外反應(yīng)體系中含有5 mmol/L Mg2+的情況下,未加入珍珠層ESM時,ACC的穩(wěn)定時間不及3 d(圖3E),ACC在3 d內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化形成方解石。但加入珍珠層ESM后,ACC可被Mg2+和珍珠層ESM的協(xié)同作用穩(wěn)定長達(dá)4 d以上(圖3F)。

2.3 珍珠層 EDTA可溶性基質(zhì)蛋白對晶體鎂鈣比的影響

取1.2.3中ACC晶型轉(zhuǎn)化體外反應(yīng)體系中不同反應(yīng)時間的碳酸鈣樣品分別進(jìn)行能譜檢測,結(jié)果表明(表1),在含有1mmol/L Mg2+且未加入珍珠層ESM的轉(zhuǎn)化體系中,ACC未發(fā)生轉(zhuǎn)化時,ACC中鎂離子相對于鈣離子的含量為2.2%±1.5%,而ACC轉(zhuǎn)化成方解石后這一數(shù)值達(dá)到8.4%±0.7%,增加了282%,說明在未加入珍珠層 ESM 時,隨著時間的推移,Mg2+參與ACC轉(zhuǎn)化為方解石的過程并最終摻入方解石晶體中,使得晶體中 Mg2+含量明顯增加。但在加入珍珠層ESM后,ACC發(fā)生轉(zhuǎn)化前,ACC中鎂離子含量為 1.3%±0.9%,ACC轉(zhuǎn)化成方解石后這一數(shù)值為3.6%±0.4%,雖然鎂離子含量增加了 177%,但明顯小于未加入珍珠層 ESM 的情況。由此可見,珍珠層ESM 可以抑制 ACC晶型轉(zhuǎn)化形成方解石的過程中Mg2+的參與,減少最終形成的方解石中Mg2+的含量。

表1 不同濃度 Mg2+存在的條件下轉(zhuǎn)化前后 ACC中Mg2+/Ca2+(%)的變化Tab.1 Changes of Mg2+/Ca2+(%)in ACC before/after ACC transformation in the systems of different concentrations of Mg2+

2.4 珍珠層 EDTA可溶性基質(zhì)蛋白對晶體形貌的影響

取1.2.3中加入1 mmol/LMg2+的ACC晶型轉(zhuǎn)化體外反應(yīng)體系中不同反應(yīng)時間的碳酸鈣樣品進(jìn)行SEM檢測,結(jié)果表明,未加入珍珠層ESM時,ACC轉(zhuǎn)化形成的方解石有兩種晶貌。一種呈棒槌型多層片狀晶貌,另一種則類似體外結(jié)晶的典型正方體方解石堆疊而成的晶貌。而加入珍珠層ESM后,ACC晶型轉(zhuǎn)化后形成的方解石晶貌則具有明顯的不規(guī)則性,晶貌趨向于球狀,且沒有明顯的分層結(jié)構(gòu)。說明珍珠層ESM可能具有調(diào)節(jié)ACC中離子的排列的作用,從而調(diào)節(jié)ACC轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的晶貌。

3 討論

研究表明,生物體中方解石和文石均由暫態(tài)ACC轉(zhuǎn)化而來[14-15]。同時,生物體內(nèi)的穩(wěn)定ACC作為機(jī)械強(qiáng)化劑和鈣離子和碳酸根離子的暫時貯存位點(diǎn),在生物礦化中也起著重要作用[16-18]。生物體中存在穩(wěn)定性不同的ACC表明,生物體必定通過某種機(jī)制調(diào)節(jié) ACC的穩(wěn)定性,從而使暫態(tài) ACC得以在合適的條件下結(jié)晶,而穩(wěn)定 ACC得以保持其穩(wěn)定狀態(tài)。因此,研究生物體調(diào)節(jié) ACC穩(wěn)定性的機(jī)制,對闡明生物礦化過程以及解釋生物礦化產(chǎn)物具有優(yōu)良材料學(xué)特性的原因具有重要意義。另一方面,通過一些手段提高ACC的穩(wěn)定性并探究其穩(wěn)定機(jī)理,不僅有助于在體外研究ACC的晶型轉(zhuǎn)化過程,更有助于闡明生物體調(diào)節(jié)ACC穩(wěn)定性的機(jī)制,從而進(jìn)一步解釋生物礦化的機(jī)制。同時,提高ACC的穩(wěn)定性也有助于今后對體外模擬珍珠形成的過程進(jìn)行準(zhǔn)確控制。研究表明,向溶液中添加某些成分,如鎂離子[27],磷酸根離子[28],乙二醇[29]等都可以可逆地穩(wěn)定ACC。這些添加劑可能通過吸附在初生晶核上從而抑制碳酸鈣沉淀。也有研究表明,在含有鎂的情況下,從藻類Corallina提取的大分子可以穩(wěn)定ACC[30],說明向溶液中添加兩種以上成分也可以有效穩(wěn)定ACC。這與本研究中,相較于不含有Mg2+的情況,在含有Mg2+的溶液中珍珠層ESM對ACC的穩(wěn)定作用顯著增強(qiáng)一致。

生物礦物的形成環(huán)境復(fù)雜多變,因此其中或多或少會含有一些雜質(zhì)成分。但由于固相的溶解度以及雜質(zhì)離子豐度的限制,這些雜質(zhì)成分的含量非常少,對生物礦物性質(zhì)的影響也較小。但Mg元素對碳酸鈣生物礦物的影響卻受到了廣泛關(guān)注。生物礦化過程中Mg2+整合進(jìn)方解石晶格會使得方解石的溶解度升高[31-32],而溶解度升高往往伴隨著穩(wěn)定性的降低;Mg元素對文石的溶解度的影響則較小,因此,在高M(jìn)g/Ca比的結(jié)晶溶液中則傾向于沉積文石。研究表明,生物來源的方解石中Mg含量受到嚴(yán)格的調(diào)控[33-34]。也有體外研究表明,貝殼棱柱層ESM可顯著降低方解石Mg含量,但貝殼珍珠層ESM卻對方解石中 Mg含量沒有顯著影響[35]。這可能是由于上述研究中方解石體外結(jié)晶過程由飽和離子溶液為開端,因此,貝殼 ESM 的作用體現(xiàn)了由無機(jī)離子轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶體的過程中的整體作用,對于ESM在ACC轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶型階段的作用并沒有進(jìn)行詳細(xì)探討。由于 ACC的晶型轉(zhuǎn)化是珍珠生物礦化的關(guān)鍵步驟,因此本研究主要探討了珍珠層ESM在ACC晶型轉(zhuǎn)化過程中對于Mg2+含量的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明,ACC晶型轉(zhuǎn)化過程中珍珠層ESM可以顯著降低方解石中Mg2+的含量。而珍珠層 ESM 在 Mg2+存在時可以顯著提高ACC的穩(wěn)定性。因此,貝殼珍珠層ESM可能通過抑制Mg2+結(jié)合到ACC,調(diào)節(jié)晶體中鎂含量來穩(wěn)定ACC。同時SEM結(jié)果表明,珍珠層ESM可以調(diào)節(jié)ACC轉(zhuǎn)化形成的方解石的晶貌,使ACC以不同于典型方解石正方體晶貌的形式結(jié)晶。這表明,生物體可能通過珍珠層ESM來塑造ACC的晶貌,從而使其結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)。

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