杜次，李菁，唐云濤，彭清忠

1 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000

2 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000

蛇足石杉賴(lài)氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達(dá)及其功能分析

杜次1,2，李菁1,2，唐云濤1,2，彭清忠1,2

1 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000

2 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000

賴(lài)氨酸脫羧酶 (Lysine decarboxylase, LDC) 是抗老年癡呆藥——石杉?jí)A甲生物合成的第一個(gè)酶。為了研究蛇足石杉中LDC的特性和功能，以其總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到2個(gè)賴(lài)氨酸脫羧酶基因LDC1和LDC2，克隆至pMD?19-T中測(cè)序發(fā)現(xiàn)，兩基因同源性為95.3%，分別編碼212和202個(gè)氨基酸。將兩基因引入pET-32a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC1和pET-32a(+)/LDC2，分別轉(zhuǎn)入BL21(ED3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在30 ℃條件下獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物Trx-LDC1和Trx-LDC2；采用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，建立酶促反應(yīng)體系分析其脫羧酶活性，薄層層析 (TLC) 檢測(cè)表明重組融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2均能催化賴(lài)氨酸脫羧生成尸胺。利用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)LDC1和LDC2理化性質(zhì)存在差異，但預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)基本一致。

蛇足石杉，賴(lài)氨酸脫羧酶，基因克隆，原核表達(dá)，酶活性，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛇足石杉[Huperzia serrata (Thumb.) Trev.]為石杉科石杉屬蕨類(lèi)植物，別名千層塔、金不換、蛇足草等，系我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，常用于治療瘀血腫痛、跌打損傷、肌肉痙攣、精神分裂等疾病[1-2]。上世紀(jì)80年代我國(guó)科學(xué)家首次從蛇足石杉中分離出石杉?jí)A甲 (Huperzine A)，后經(jīng)研究證明是一種高效、可逆、選擇性強(qiáng)的乙酰膽堿酯酶抑制劑，治療老年癡呆癥 (Alzheimer's disease, AD) 療效顯著，而且具有毒性低、生物利用率高、易穿透血腦屏障、藥效長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[2-4]。由于優(yōu)于同類(lèi)其他藥物，石杉?jí)A甲作為新一代治療老年癡呆藥物引起醫(yī)藥界的極度重視，而其藥源植物蛇足石杉也受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

蛇足石杉生長(zhǎng)緩慢、資源更新周期長(zhǎng)，而石杉?jí)A甲在全草中含量甚微，近些年由于提取石杉?jí)A甲的高額利潤(rùn)，對(duì)野生蛇足石杉進(jìn)行地毯式采收，使得該類(lèi)植物資源日趨枯竭。一些學(xué)者嘗試尋求新途徑獲取石杉?jí)A甲，如化學(xué)合成法、組織培養(yǎng)法、微生物發(fā)酵法等[5-10]，雖取得一些進(jìn)展，但離生產(chǎn)實(shí)踐有很遠(yuǎn)距離。解決資源短缺和實(shí)現(xiàn)新途徑生產(chǎn)石杉?jí)A甲，首先有必要從分子水平理解石杉?jí)A甲的生物合成機(jī)制。目前一些研究表明，石杉?jí)A甲生物合成是以賴(lài)氨酸脫羧酶 (Lysine decarboxylase, LDC)介導(dǎo)賴(lài)氨酸脫羧開(kāi)始，接著由銅氨氧化酶(Copper amine oxidase) 催化尸胺生成四氫吡啶(2,3,4,5-Tetrahydropyridine)，然后經(jīng)過(guò)一系列的酶促反應(yīng)生成石杉?jí)A甲[3,11-12]。Sun等[13]曾對(duì)蛇足石杉中銅氨氧化酶基因進(jìn)行克隆和功能鑒定，但是目前尚未見(jiàn)賴(lài)氨酸脫羧酶基因功能表征方面的研究報(bào)道，而關(guān)于石杉?jí)A甲整個(gè)合成途徑中的關(guān)鍵基因和調(diào)控機(jī)理也知之甚少。鑒于此，本研究擬采用RT-PCR方法從蛇足石杉中克隆賴(lài)氨酸脫羧基因，對(duì)其進(jìn)行重組表達(dá)和功能分析，以及生物信息學(xué)分析，以期豐富賴(lài)氨酸脫羧酶家族分子信息，為闡明蛇足石杉中石杉?jí)A甲生物合成機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌JM109，質(zhì)粒pET-32a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pMD?19-T購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.1.2酶和試劑

Ex Taq?DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、NcoⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶，DL2 000 DNA marker，Protein molecular weight marker (Low)，Total RNA提取試劑 RNAiso Plus，PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0和MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0均購(gòu)自TaKaRa公司；Ni-NTA SefinoseTMResin Kit，IPTG和磷酸吡哆醛均購(gòu)自上海生物工程有限公司；賴(lài)氨酸 (L-lysine) 和尸胺 (Cadaverine) 購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3材料

蛇足石杉樣品采自湖南省古丈縣高望界自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)吉首大學(xué)張代貴高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為蛇足石杉。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成

野外采集蛇足石杉完整植株 (帶土壤)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從植株上剪取幼嫩葉片約100 mg，置于液氮預(yù)冷的研缽中迅速研磨成粉，立即使用RNAiso Plus試劑提取總RNA。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，提取的總RNA于–70 ℃保存?zhèn)溆谩＠肨aKaRa公司提供的PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按其說(shuō)明書(shū)操作流程，以蛇足石杉總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 LDC基因克隆與測(cè)序

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索賴(lài)氨酸脫羧酶相關(guān)基因進(jìn)行同源比對(duì)，根據(jù)序列保守區(qū)域，采用vector NTI軟件設(shè)計(jì)一對(duì)包含全長(zhǎng)LDC基因的擴(kuò)增引物L(fēng)DC-F和LDC-R (表1)，以cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增蛇足石杉的LDC基因片段。配制50 μL反應(yīng)體系：10×Ex PCR緩沖液5.0 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4.0 μL，引物 (LDC-F和LDC-R) 各1.0 μL，Ex Taq聚合酶0.25 μL，cDNA 4.0 μL，補(bǔ)加ddH2O至終體積50 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化，電泳檢測(cè)純化結(jié)果，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。按廠家說(shuō)明書(shū)將純化的DNA片段連接至載體pMD?19-T上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，通過(guò)氨芐抗性和藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，從檢測(cè)合格的重組菌株中提取質(zhì)粒，送TaKaRa公司測(cè)序。

1.2.3 LDC基因的原核表達(dá)

根據(jù)LDC基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物L(fēng)DC-eF和LDC-eR (表1)，分別在引物5'端引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以1.2.2中的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，采用限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切；同時(shí)對(duì)表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切。采用MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，分光光度計(jì)檢測(cè)各酶切產(chǎn)物濃度。利用T4 DNA連接酶于4 ℃對(duì)兩純化產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，在氨芐和氯霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從平板上挑取多個(gè)菌落進(jìn)行全菌PCR檢測(cè)，提取相應(yīng)克隆子的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。

將鑒定的陽(yáng)性克隆子接種至LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床培養(yǎng)3?4 h (OD600約為1.0)，添加IPTG (終濃度260 μg/mL)，繼續(xù)30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng) (150 r/min) 4 h。同時(shí)以空載體重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)作對(duì)照。取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于1.5 mL離心管中，離心收集菌體，用PBS洗滌和重懸菌體。重懸菌液分2份，其中一份加入2 μL溶菌酶 (100 mg/mL)，室溫靜置10 min后反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，收集上清液和沉淀。分別在上清、沉淀、全菌 (另一份) 和對(duì)照組全菌中加入等體積的2×上樣緩沖液，沸水浴3 min，短暫離心后于12%的SDS-PAGE中電泳檢測(cè)。

1.2.4表達(dá)產(chǎn)物純化及活性鑒定

將重組菌接種于1 L液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，PBS洗滌3次，使用Ni-NTA SefinoseTMResin蛋白純化試劑盒中的結(jié)合緩沖液重懸菌體，溶菌酶酶解，冰浴超聲破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心收集上清液。按照試劑盒操作說(shuō)明，采用Ni-NTA純化柱進(jìn)行重組蛋白純化，12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化結(jié)果。

在1.5 mL離心管中配制500 μL酶反應(yīng)體系，使各試劑終濃度分別為：磷酸鉀緩沖液(pH 8.0) 100 mmol/L、磷酸吡哆醛 (PALP) 0.20 mmol/L、賴(lài)氨酸10.0 mmol/L、重組賴(lài)氨酸脫羧酶1.00 mg/mL。將反應(yīng)混合液于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)至出現(xiàn)渾濁，向反應(yīng)液中加入1滴濃HCl混勻，然后加入500 μL氯仿劇烈振蕩，10 000 r/min離心10 min棄去兩相中間不溶物。氮吹儀40 ℃吹干，干燥后的兩相殘留物用1 mol/L的HCl溶解，取溶解后的上清用丹磺酰氯衍生劑進(jìn)行衍生，同時(shí)對(duì)賴(lài)氨酸和尸胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行丹磺酰氯衍生，氯仿萃取濃縮衍生物進(jìn)行薄層層析 (TLC) 檢測(cè)，展開(kāi)劑為氯仿、乙醚、三乙胺 (配比為8∶1∶2)。使用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀(CAMAG ATS 4，瑞士) 點(diǎn)樣，全自動(dòng)展開(kāi)儀(CAMAG ADC 2，瑞士) 進(jìn)行展開(kāi)，然后用TLC Visualizer進(jìn)行檢測(cè)成像。

1.2.5 LDC基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

LDC基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy Bioinformatics Resource Portal 提供的在線工具Protparam (http://web.expasy.org/ protparam/)；LDC蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)搜索分別采用在線工具PROSITE (http://prosite.expasy.org/) 和NCBI 在線工具 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ structure/cdd/wrpsb.cgi/)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和三維建模采用SWISS-MODEL (http:// swissmodel.expasy.org/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LDC基因的克隆和序列分析

根據(jù)植物賴(lài)氨酸脫羧酶相關(guān)基因和EST同源序列設(shè)計(jì)保守引物，利用RT-PCR技術(shù)從蛇足石杉莖尖嫩葉總RNA中擴(kuò)增獲得2個(gè)基因片段，如圖1所示，長(zhǎng)度分別約為1 100 bp和650 bp。對(duì)擴(kuò)增所得的2個(gè)基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序，采用Vector NTI 軟件分析，發(fā)現(xiàn)兩序列均包含有完整開(kāi)放閱讀框，長(zhǎng)度分別為639 bp和609 bp，編碼212個(gè)和202個(gè)氨基酸，兩編碼基因分別命名為L(zhǎng)DC1和LDC2；同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，LDC1除在3'末端比LDC2多出30 bp小片段外，其余序列均完全一致，兩者同源性為95.3%。將2個(gè)基因送GenBank注冊(cè)，Accession number分別為JQ308624.1和JQ308625.1。

2.2 賴(lài)氨酸脫羧酶基因的原核表達(dá)

采用1.2.3中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，分別在LDC基因起始密碼部位引入NcoⅠ酶切位點(diǎn)，終止密碼后引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。純化的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切、回收后，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行連接，即構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC，構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。

重組質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，通過(guò)PCR擴(kuò)增和NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切篩選陽(yáng)性克隆子。將鑒定正確的重組菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，含pET-32a(+)/LDC1的重組菌株和含pET-32a(+)/LDC2的重組菌株分別產(chǎn)生Trx-LDC1和Trx-LDC2融合蛋白，如圖3A所示。Trx-LDC1和Trx-LDC2融合蛋白大小約為40 kDa，在重組菌破碎后的上清液和沉淀部分均存在，其中沉淀部分含量較高，表明融合蛋白的可溶性比例較少。根據(jù)融合蛋白所帶組氨酸標(biāo)簽，采用Ni-NTA柱對(duì)可溶性重組蛋白進(jìn)行純化，獲得純度較高的融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2，如圖3B所示。

2.3 重組賴(lài)氨酸脫羧酶的活性鑒定

按照文獻(xiàn)[14]和[15]方法分別建立Trx-LDC1和Trx-LDC2融合蛋白酶促反應(yīng)體系，37 ℃進(jìn)行催化反應(yīng)后加入濃HCl終止反應(yīng)，并通過(guò)氯仿萃取去除重組融合蛋白；兩液相反應(yīng)物干燥后與丹磺酰氯進(jìn)行酰基化衍生反應(yīng)，由于丹磺酰基具有強(qiáng)烈熒光，衍生物能利用薄層層析 (TLC) 進(jìn)行檢測(cè)，如圖4所示，兩融合蛋白反應(yīng)體系中均有尸胺生成 (泳道2和3)，而加熱滅活的融合蛋白反應(yīng)體系中未檢測(cè)到尸胺(泳道4和5)，據(jù)此，可以推測(cè)融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2具有賴(lài)氨酸脫羧酶活性，能催化賴(lài)氨酸脫羧生成尸胺。

圖1 賴(lài)氨酸脫羧酶基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig. 1 RT-PCR amplification of LDC gene from Huperzia serrata. M: DNA marker; 1, 2: RT-PCR products of LDC gene; ct: control.

圖2 重組質(zhì)粒pET-32a(+)/LDC的構(gòu)建Fig. 2 Construction of recombinant plasmid pET-32a(+)/LDC.

圖3 重組蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2的SDS-PAGE電泳Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant Trx-LDC1 and Trx-LDC2. (A) Unpurified recombinant fusion proteins. (B) Purified recombinant fusion proteins. M: protein molecular weight markers; 1, 2 and 3: supernatant, precipitation and entire cell from BL21(DE3) transformants including pET32a(+)/LDC1 respectively; 4, 5 and 6: supernatant, precipitation and entire cell from BL21(DE3) transformants including pET32a(+)/LDC2 respectively; ct: recombinant cells only with pET-32a(+). LDC1: purified Trx-LDC1; LDC2: purified Trx-LDC2.

圖4 重組蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2酶促反應(yīng)的TLC檢測(cè)Fig. 4 TLC detection of recombinant Trx-LDC1/ Trx-LDC2 enzyme reaction. 1: Cadaverine (Cad); 2, 3: products of Trx-LDC1/Trx-LDC2 enzyme reaction respectively; 4, 5: products of boiling-inactivated Trx-LDC1/Trx-LDC2 enzyme reaction respectively; 6: L-lysine.

2.4 LDC基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4.1 LDC理化性質(zhì)

LDC1基因預(yù)測(cè)編碼212個(gè)氨基酸，LDC2編碼202個(gè)氨基酸，根據(jù)ExPASy Bioinformatics Resource Portal 提供的在線工具Protparam對(duì)兩基因編碼蛋白進(jìn)行分析，推測(cè)LDC1分子式為C1035H1650N274O302S10，分子量為23.08 kDa，等電點(diǎn)PI為5.59；帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)為28，帶正電殘基(Arg + Lys)為23；LDC1的不穩(wěn)定系數(shù)為31.96，脂肪系數(shù)為97.45，親水系數(shù)為0.008。LDC2分子式為C985H1589N267O282S9，分子量為21.97 kDa，等電點(diǎn)PI為7.74；帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)為24，帶正電殘基(Arg + Lys)為25；LDC2的不穩(wěn)定系數(shù)為25.59，脂肪系數(shù)為100.35，親水系數(shù)為0.013。結(jié)果表明兩蛋白理化性質(zhì)有一些差異。

2.4.2 LDC的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)在線軟件對(duì)LDC1和LDC2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示LDC1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成，分別占43.8%和34.4%，無(wú)規(guī)則卷曲占21.8%；同樣LDC2的二級(jí)結(jié)構(gòu)也主要由α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成，分別占43.5%和34.2%，無(wú)規(guī)則卷曲占22.3%。由SWISS-MODEL在線分析軟件對(duì)LDC1和LDC2進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模建，得到三維模型如圖5所示。雖然LDC1比LDC2在C末端多出10個(gè)氨基酸，但從二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和三維結(jié)構(gòu)模建可知，LDC1和LDC2的高級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，從而表現(xiàn)出相同的生物活性。

圖5 LDC1和LDC2的三維結(jié)構(gòu)模建Fig. 5 Predicted three-dimensional structures of LDC1 and LDC2.

3 討論

目前有關(guān)石杉?jí)A甲生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)理及關(guān)鍵基因功能的研究資料非常匱乏。一些研究表明賴(lài)氨酸脫羧酶是參與石杉?jí)A甲生物合成的第一個(gè)酶/入口酶[3,11-12]，但是在蛇足石杉和其他石杉科植物中均未見(jiàn)編碼該酶基因的研究報(bào)道。本研究根據(jù)其他植物賴(lài)氨酸脫羧酶基因和推測(cè)的EST序列設(shè)計(jì)保守引物，從蛇足石杉中成功克隆出2個(gè)賴(lài)氨酸脫酶基因 (LDC1和LDC2)，同源性達(dá)95%，即LDC1除在3'末端比LDC2多30 bp外，其余序列均一致；由于兩者的編碼蛋白LDC1比LDC2多10個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析表明LDC1和LDC2理化性質(zhì)存在差異，但是其預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)基本一致，這與其后分析的兩重組表達(dá)蛋白均具有催化賴(lài)氨酸脫羧基功能相印證。根據(jù)這些結(jié)果我們可以推測(cè)LDC1在C末端多出的10個(gè)氨基酸并非其酶活性中心或底物結(jié)合區(qū)域序列，或也非其他必需氨基酸序列，不影響該酶的結(jié)構(gòu)和功能；蛇足石杉中為什么存在如此形式的2個(gè)LDC基因尚不清楚，但在此可進(jìn)一步推測(cè)LDC1和LDC2可能來(lái)源于同一祖先基因，在進(jìn)化過(guò)程中LDC1出現(xiàn)冗余片段，或者一個(gè)基因是另一個(gè)基因整合到植物染色體中的拷貝形式，整合過(guò)程中發(fā)生了插入或缺失突變等。另外，通過(guò)氨基酸序列相似性比對(duì)還發(fā)現(xiàn)，LDC1和LDC2蛋白序列與野芭蕉Musa balbisiana (BAG70979.1)、玉米Zea mays (NP001148565.1)、蒺藜苜蓿Medicago truncatula (XP003588965.1) 和擬南芥Arabidopsis thaliana (CAB87668.1) 推測(cè)的LDC氨基酸序列具有較高的同源性 (數(shù)據(jù)未提供)，該結(jié)果是否暗示低等蕨類(lèi)蛇足石杉與上述高等植物在進(jìn)化上有較近親緣關(guān)系有待研究。

為了驗(yàn)證克隆獲得的2個(gè)LDC基因功能，我們將其引入可溶性表達(dá)載體pET-32a(+)，分別于37 ℃、30 ℃和25 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明37 ℃條件下表達(dá)量最高，但重組蛋白均為包涵體，25 ℃表達(dá)量非常低，幾乎檢測(cè)不到重組蛋白 (數(shù)據(jù)未提供)；30 ℃重組蛋白以包涵體和可溶性?xún)煞N形式存在，但可溶性表達(dá)量比較低。如果要提高可溶性蛋白表達(dá)水平，還需對(duì)表達(dá)條件做進(jìn)一步探討。將30 ℃誘導(dǎo)的可溶性蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2進(jìn)行分離和純化后，我們?cè)啻螄L試用腸激酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切，遺憾的是酶切過(guò)程中蛋白變性產(chǎn)生沉淀析出，最后我們選用融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2進(jìn)行酶活性分析，酶促反應(yīng)結(jié)果表明它們均具有催化賴(lài)氨酸脫羧生成尸胺的能力。根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果中底物賴(lài)氨酸和產(chǎn)物尸胺的比例，可初步確定重組融合蛋白總體酶活性力比較低，其主要原因可能是酶反應(yīng)條件不適宜所致，當(dāng)然也不排除融合蛋白TrxA片段空間位阻效應(yīng)妨礙LDC與底物結(jié)合等其他因素的影響。

雖然已有學(xué)者研究了大豆Glycine max、煙草Nicotiana glauca、多葉羽扇豆Lupinus polyphyllus和柳葉黃薇Heimia salicifolia等植物的賴(lài)氨酸脫羧酶活性和功能[16-20]，但是至今有關(guān)植物L(fēng)DC的分子信息仍然知之甚少。本研究首次從蛇足石杉中分離出2個(gè)LDC基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析和原核重組表達(dá)研究了其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和酶活性，這些結(jié)果為進(jìn)一步闡述LDC的生物學(xué)功能及其編碼蛋白的酶學(xué)性質(zhì)奠定基礎(chǔ)。石杉?jí)A甲作為新一代治療老年癡呆的珍稀藥物，隨著對(duì)其生物合成入口酶LDC及代謝過(guò)程中其他關(guān)鍵酶 (基因) 的逐步認(rèn)識(shí)，將能全面解析其生物合成路徑和分子作用機(jī)制，為通過(guò)生物技術(shù) (如組織/細(xì)胞培養(yǎng)、代謝工程等) 手段解決石杉?jí)A甲藥源問(wèn)題提供科學(xué)依據(jù)。

REFERENCES

[1] Guo B, Xu LL, Wei YH, et al. Research advances of Huperzia serrata (Thunb.) Trev.. Chin J Chin Mater Med, 2009, 34(16): 2018–2023 (in Chinese).

郭斌, 徐玲玲, 尉亞輝, 等. 千層塔的研究進(jìn)展.中國(guó)中藥雜志, 2009, 34(16): 2018–2023.

[2] Ma XQ, Tan CH, Zhu DY, et al. A survey of potential huperzine A natural resources in China: Huperziaceae. J Ethnopharmacol, 2006, 104(1/2): 54–67.

[3] Ma XQ, Tan CH, Zhu DY, et al. Huperzine A from Huperzia species--an ethnopharmacological review. J Ethnopharmacol, 2007, 113(1): 15–34.

[4] Wang R, Yan H, Tang XC. Progress in studies of huperzine A, a natural cholinesterase inhibitor from Chinese herbal medicine. Acta Pharmacol Sin, 2006, 27(1): 1–26.

[5] Takahiro K, Satoshi Y, Tohru F. Total synthesis of (-)-huperzine A. Org Lett, 2009, 11(22): 5354–5356.

[6] Zeng FX, Jiang HL, Yang YS, et al. Progress in synthesis and structural modification of huperzine A. Prog Chem, 2000, 12(1): 63–76 (in Chinese).

曾繁星, 蔣華良, 楊玉社, 等. 石杉?jí)A甲的合成及結(jié)構(gòu)改造研究進(jìn)展. 化學(xué)進(jìn)展, 2000, 12(1): 63–76.

[7] Szypu?a W, Pietrosiuk A, Suchocki P, et al. Somatic embryogenesis and in vitro culture of Huperzia selago shoots as a potential source of huperzine A. Plant Sci, 2005, 168(6): 1443–1452.

[8] Ma X, Gang DR. In vitro production of huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer's disease. Phytochemistry, 2008, 69(10): 2022–2028.

[9] Zhu D, Wang J, Zeng Q, et al. A novel endophytic huperzine A-producing fungus, Shiraia sp. Slf14, isolated from Huperzia serrata. J Appl Microbiol, 2010, 109(4): 1469–1478.

[10] Wang Y, Zeng QG, Zhang ZB, et al. Isolation and characterization of endophytic huperzine A-producing fungi from Huperzia serrata. J Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38(9): 1267–1278.

[11] Ma X, Gang DR. The Lycopodium alkaloids. Nat Prod Rep, 2004, 21(6): 752–772.

[12] Bunsupa S, Katayama K, Ikeura E, et al. Lysine decarboxylase catalyzes the first step of quinolizidine alkaloid biosynthesis and coevolved with alkaloid production in Leguminosae. Plant Cell, 2012, 24(3): 1202–1216.

[13] Sun JY, Morita H, Chen GS, et al. Molecular cloning and characterization of copper amine oxidase from Huperzia serrata. Bioorg Med Chem Lett, 2012, 22(18): 5784–5790.

[14] Kamio Y, Terawaki Y. Purification and properties of Selenomonas ruminantium lysine decarboxylase. J Bacteriol, 1983, 153(2): 658–664.

[15] Wang FQ, Liu F, Meng Y, et al. Biogenic amines in salted duck analyzed by TLC combined with HPLC. Food Sci, 2011, 32(14): 273–276 (in Chinese).

王鳳芹, 劉芳, 孟勇. TLC和HPLC法相結(jié)合分析鹽水鴨中的生物胺. 食品科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 32(14): 273–276.

[16] Kim HS, Kim BH, Cho YD. Purification and characterization of monomeric lysine decarboxylase from soybean (Glycine max) axes. Arch Biochem Biophys, 1998, 354(1): 40–46.

[17] Ohe M, Scoccianti V, Bagni N, et al. Putative occurrence of lysine decarboxylase isoforms in soybean (Glycine max) seedlings. Amino Acids, 2009, 36(1): 65–70.

[18] Bagni N, Creus J, Pistocchi R. Distribution of cadaverine and lysine decarboxylase activity in Nicotiana glauca plants. J Plant Physiol, 1986, 125(1/2): 9–15.

[19] Schoofs G, Teichmann S, Hartmann T, et al. Lysine decarboxylase in plants and its integration in quinolizidine alkaloid biosynthesis. Phytochemistry, 1983, 22(1): 65–69.

[20] Pelosi LA, Rother A, Edwards JM. Lysine decarboxylase activity and alkaloid production in Heimia salicifolia cultures. Phytochemistry, 1986, 25(10): 2315–2319.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Cloning, prokaryotic expression and characterization of lysine decarboxylase gene from Huperzia serrata

Ci Du1,2, Jing Li1,2, Yuntao Tang1,2, and Qingzhong Peng1,2

1 College of Biology and Environmental Sciences Jishou University, Jishou 416000, Hunan, China
2 Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization, College of Hunan Province, Jishou 416000, Hunan, China

Huperzine A is a promising drug to treat Alzheimer's disease (AD). To date, its biosynthetic pathway is still unknown. Lysine decarboxylase (LDC) has been proposed to catalyze the first-step of the biosynthesis of huperzine A. To identify and characterize LDCs from Huperzia serrata, we isolated two LDC fragments (LDC1 and LDC2) from leaves of H. serrata by RT-PCR and then cloned them into pMD?19-T vector. Sequence analysis showed that LDC1 and LDC2 genes shared 95.3% identity and encoded the protein of 212 and 202 amino acid residues respectively. Thus, we ligated LDC genes into pET-32a(+) to obtain recombinant expressing vectors pET-32a(+)/LDC1 and pET-32a(+)/LDC2 respectively. We further introduced two expression vectors into Escherichia coli BL21(DE3) and cultured positive colonies of E. coli in liquid LB medium. After inducing for 4 hours with 260 μg/mL IPTG at 30 ℃, soluble recombinant Trx-LDC1 and Trx-LDC2 were obtained and isolated for purification using a Ni-NTA affinity chromatography. We incubated purified recombinant proteins with L-lysine in the enzyme reaction buffer at 37 ℃ and then derived the reaction products using dansyl chloride. It was found that both Trx-LDC1 and Trx-LDC2 had decarboxylase activity, could convert L-lysine into cadaverine by way of thin layer chromatography assay. Further, bioinformatics analysis indicated that deduced LDC1 and LDC2 had different physicochemical properties, but similar secondary and three-dimensional structures.

Huperzia serrata, lysine decarboxylase, gene cloning, prokaryotic expression, enzyme activity, structure prediction

October 15, 2013; Accepted: December 10, 2013

Qingzhong Peng. Tel: +86-743-8725365; E-mail: qzpengjsu@163.com

杜次, 李菁, 唐云濤, 等. 蛇足石杉賴(lài)氨酸脫羧酶基因的克隆、原核表達(dá)及其功能分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8):1299?1307.

Du C, Li J, Tang YT, et al. Cloning, prokaryotic expression and characterization of lysine decarboxylase gene from Huperziaserrata. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1299?1307.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31260081), Scientific Research Fund of Hunan Provincial Education Department (No. 13A078).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31260081)，湖南省教育廳科學(xué)研究基金 (No. 13A078) 資助。