葛慧華，王文研，張光亞，王士斌

華僑大學生物工程與技術(shù)系，福建 廈門 361021

影響類彈性蛋白多肽自組裝成微球的因素及其作用機制

葛慧華，王文研，張光亞，王士斌

華僑大學生物工程與技術(shù)系，福建 廈門 361021

影響類彈性蛋白多肽 (ELPs) 自組裝成微球的因素較多，目前尚缺乏系統(tǒng)研究。以類彈性蛋白多肽[KV8F]n為對象，利用動態(tài)光散射儀測定了不同條件下其自組裝成微球的粒徑。結(jié)果表明：隨著分子量的增加ELPs形成的微球粒徑也隨之增大，粒徑的均一度減??；當鹽濃度低于0.4 mol/L時，鹽濃度的增加，微球粒徑相應(yīng)增加，而鹽濃度高于0.4 mol/L則呈減少的趨勢，但粒徑均大于1.1 μm；而當ELPs末端融合木聚糖酶和1,3-丙二醇氧化還原酶后，其自組裝形成的微球粒徑急劇減小，約為游離ELPs的1/10，分別為151.0 nm和 174.2 nm。導致這種現(xiàn)象的原因可能是酶分子和ELPs通過靜電引力相互作用后，酶分子的空間位阻妨礙了ELPs分子的聚集。

類彈性蛋白多肽，靜電引力，空間位阻，自組裝，融合蛋白

類彈性蛋白多肽 (Elastin-like polypeptides，ELPs)，由于能智能響應(yīng)溫度，加之良好的生物相容性和穩(wěn)定性，是一種良好的生物材料。它包含數(shù)個重復序列 (VPGXG)，其中X代表除脯氨酸以外的任一氨基酸[1]。類彈性蛋白多肽(ELPs) 自組裝所形成的納米級或微米級顆粒在酶分離純化及固定化、藥物包埋及靶向運輸?shù)确矫鏄O具應(yīng)用潛力。研究者利用ELPs (VPAVG) 220所形成的顆粒 (其平均粒徑為237.5 nm) 包封骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (Bone morphogenetic protein)，其包封率高達94.5%，且14 d以后所包封的蛋白仍然保持活性，顯示了ELPs在骨組織工程領(lǐng)域巨大的潛在用途[2]。最近，研究者發(fā)現(xiàn)，不同類型ELPs在37 ℃條件下可形成粒徑均一的顆粒，其直徑從6 nm到1 602 nm不等[3]，由于能在適宜溫度下形成尺寸合適的顆粒，有望在體內(nèi)和體外得到應(yīng)用；而經(jīng)特殊設(shè)計的ELPs在37 ℃和pH 7時，可自發(fā)形成高度均一的顆粒 (粒徑500 nm左右)，通過在其末端融合角質(zhì)化細胞生長因子，用于蛋白類藥物的定向運送，其治療慢性傷口 (Chronic wounds) 的效果顯著提高[4]。

然而，ELPs所形成的微米/納米顆粒尺寸與多種因素有關(guān)，如：殘基X的類型、多肽鏈長度，溶液中鹽濃度及所融合的目標蛋白性質(zhì)等，目前對此缺乏系統(tǒng)和定量研究，相關(guān)報道很少。而探明影響ELPs自組裝成微納米顆粒的主要因素，可為精確控制其尺寸以適應(yīng)不同情況下的應(yīng)用提供重要信息，基于此，本文探討了不同條件下ELPs自組裝成微球粒徑的大小及分布情況，并對其可能的分子機制進行了闡述。

1 材料與方法

1.1 不同長度ELPs的獲取

本文所使用的ELPs為[KV8F]n，其中n為重復數(shù)，n分別為40、60、80、120及140。這些不同長度的ELPs通過RDL法[5](Recursive directional ligation，RDL)由20個重復的ELPs延長得到 (其分子量為9 kDa)，所得延長后的ELPs對應(yīng)的分子量分別為18 kDa、27 kDa、36 kDa、54 kDa及63 kDa。木聚糖酶和1,3-丙二醇氧化還原酶與ELPs融合基因由本實驗室前期構(gòu)建，前者有191個氨基酸組成，分子量為20 kDa，其等電點為8.9；后者由387個氨基酸組成，分子量為41 kDa，等電點為5.9，通過基因合成的方法獲得這兩個酶的基因序列[6-7]。文中所使用的表達載體為修飾后的pET-22b (+)，表達宿主菌E. coli BL21 (DE3)，二者均為本實驗室保存。所使用的培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基，37 ℃下 250 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導其表達，誘導時間為3 h，之后4 ℃下離心收集菌體，用冷PBS緩沖液重懸菌體，置冰浴中超聲破碎。ELPs 純化采用ITC (Inverse transition cycling，可逆相變循環(huán))法，其詳細操作步驟見文獻[8]。

1.2 ELPs的定量及相變溫度測定

ELPs的定量采用紫外分光光度計測定Trp在280 nm處的消光系數(shù)，建立標準曲線。通過測定ELPs在280 nm處的消光系數(shù)經(jīng)標準曲線計算可得。ELPs相變溫度的測定為：在ELPs的終濃度為25 μmol/L的PBS緩沖液中(pH 6.9)，利用配備有控溫裝置的紫外-可見分光光度計，通過程序升溫 (升溫速率為1 /min℃)，在波長350 nm處測定溶液的光密度，相變溫度的定義為：在程序升溫過程中，溶液吸光度為最大吸光度一半時所對應(yīng)的溫度[9]。

1.3 ELPs粒徑及Zeta電位的測定

將不同長度的ELPs溶解于PBS緩沖液中(pH 6.9)，使其終濃度為25 μmol/L，從配置好的樣品中取1 mL加入樣品池，溫度升高至所設(shè)定的溫度，平衡2 min后，采用動態(tài)光散射 (DLS)測定樣品粒度，文中粒徑大小為樣品中所有顆粒大小平均值，峰寬則是大小分布的標準偏差。而Zeta電位則是從上述樣品中取0.5 mL緩緩注入倒立的彎曲式毛細管樣品池中，當樣品到達樣品池U形管低端時 (防止沖入氣泡)，將樣品池正立，注滿樣品，平衡2 min后，測量Zeta電位。所使用的儀器為英國馬爾文公司的NanoZS Zeta電位儀，樣品粒徑在中科院城市環(huán)境研究所測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同長度ELPs的制備及粒徑掃描溫度的選擇

表達宿主菌E. coli BL21 (DE3)經(jīng)培養(yǎng)，加入IPTG誘導表達后，經(jīng)細胞破碎及ITC (Inverse transition cycling，可逆相變循環(huán)) 分離純化ELPs后，所得ELPs經(jīng)電泳后所得圖譜如圖1所示。由圖可知，不同長度ELPs電泳條帶清晰可見，條帶較窄，易辨認，由其電泳條帶在SDS-PAGE中位置可推測其分子量與預期一致。電泳圖經(jīng)BandScan軟件分析ELPs純度，結(jié)果顯示所有ELPs條帶純度均達98%以上，符合后續(xù)實驗要求。

圖1 不同長度ELPs電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of different ELPs. M: marker; 1: ELPs140; 2: ELPs120; 3: ELPs80; 4: ELPs60; 5: ELPs40.

在氯化鈉終濃度為0.5 mol/L的PBS緩沖液中測定不同長度ELPs在升溫過程中，其在350 nm處吸光值的變化如圖2所示。由圖可知，在很窄的溫度范圍內(nèi) (2–3 ℃)，溶液吸光值急劇上升，這表明ELPs在該溫度范圍內(nèi)發(fā)生了相變，其溶解度顯著降低，且溫度下降時，ELPs又重新溶解在溶液中，即該過程是一個可逆的過程。而隨著ELPs分子量增大其發(fā)生相變的溫度也逐漸下降，這與之前報道吻合[10]。從圖中還可以看出，當溫度為40 ℃時，幾乎所有的ELPs分子均完全發(fā)生相變，其吸光值達到最大，鑒于此，為了保證后續(xù)粒徑測定時溫度的統(tǒng)一性，故在后續(xù)試驗過程中選取樣品池的溫度均為40 ℃。

2.2 不同長度ELPs對所形成微球粒徑的影響

在相同條件下測定了不同長度ELPs自組裝成微球的粒徑大小，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，隨著ELPs分子量的增加，其自組裝所形成的微球粒徑逐漸增大，其粒徑范圍在1.1 μm至3.6 μm之間，其中ELPs60與ELPs80粒徑相差較小，而ELPs120和ELPs140粒徑則相差較大。而從其粒徑分布峰寬則反應(yīng)了粒徑的均一度，隨著ELPs分子量的增加，其峰寬隨之增大，意味著粒徑分布范圍更廣，粒徑的均一度下降。

圖2 不同長度ELPs相變圖Fig. 2 The phrase transition of different ELPs.

表1 ELPs長度對粒徑大小及均一度的影響Table 1 Influence of ELPs on the size and uniform of the particle

通過測定相變前后溶液的Zeta電位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ELPs發(fā)生相變前溶液的Zeta電位一般都在–11.7 mV左右，而發(fā)生相變后其Zeta電位一般都在–0.1 mV，此時，相變后的ELPs分子易發(fā)生聚集從而形成微米級球體，由于分子量大的ELPs分子中含有更多的苯丙氨酸 (F)，該氨基酸中含有共軛的苯環(huán)，分子間更容易通過π-π堆疊相互作用，從而形成較大粒徑的顆粒。而π-π堆疊作用則在分子的自組裝及定向堆積過程中發(fā)揮著重要作用[11-12]。此外，由于苯丙氨酸在ELPs分子中每10個重復出現(xiàn)一次，其均勻分布在ELPs分子中，隨著ELPs分子量的增加，其中的苯丙氨酸可在分子內(nèi)部及分子之間通過π-π堆疊相互作用，這就使得1個或多個ELPs分子在相變過程中通過該方式聚集在一起，聚集的分子越多則最終顆粒粒徑越大。分子量大的ELPs分子通過苯丙氨酸更容易結(jié)合數(shù)量不等的其他ELPs分子，這就導致分子量大的ELPs分子最終自組裝所形成的顆粒粒徑分布的范圍越寬，其均一度也就隨之下降。

2.3 鹽濃度對ELPs所形成微球粒徑的影響

測定了不同鹽濃度下各ELPs自組裝形成微球的粒徑，其中鹽包括氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉和碳酸鉀，使用的ELPs包括ELPs40和ELPs80。圖3是以氯化鈉及ELPs80為例所得的實驗結(jié)果。由圖可知，隨著鹽濃度的增加，粒徑大小呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其粒徑大小在1.7 μm到3.0 μm之間，而峰寬也基本呈現(xiàn)先增后減的趨勢，其變化范圍在0.3 μm到0.7 μm之間。意味著其均一度先減小而后增加。Hong等研究了氯化鈉濃度對離子互補型多肽EAK16-II自組裝成納米顆粒粒徑的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化鈉濃度確實會影響納米顆粒粒徑，在其濃度低于20 mmol/L時，增加鹽濃度會使其粒徑增加，而高于20 mmol/L時，增加鹽濃度則起到相反的結(jié)果[13]。而本實驗過程中也觀察到類似現(xiàn)象。由于鹽濃度的改變主要是改變分子自組裝時靜電相互作用從而影響其聚集成微球[14]，而本文所使用的ELPs中含有堿性氨基酸——賴氨酸 (K)，它在近中性的PBS溶液中會帶正電荷。此外，其他鹽濃度對ELPs粒徑的影響也呈現(xiàn)類似趨勢，但不同鹽出現(xiàn)拐點的濃度有差異，但所有情況下粒徑大小均大于1 109 nm，顆粒均為微米級。

圖3 鹽濃度對粒徑大小及均一度的影響Fig. 3 Influence of salt concentration on the size and uniform of particles.

2.4 外源融合蛋白對ELPs所形成微球粒徑的影響

圖4 融合及未融合ELPs粒徑大小及分布Fig. 4 Particle size and distribution of ELPs with and without fusion proteins. (A) Fusion with 1,3-propanediol oxidoreductase. (B) Fusion with xylanase. (C) Free ELPs.

在ELPs[KV8F]20的N端融合上外源蛋白后，測定了外源蛋白對其形成微球粒徑的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，當ELPs末端融合上外源蛋白后，其自組裝成微球的粒徑急劇減少，融合有1,3-丙二醇氧化還原酶 (PDOR) 的粒徑平均大小為151.0 nm (圖4A)，融合有木聚糖酶的 (圖4B) 的粒徑平均大小為174.2 nm，而同樣游離的ELPs所形成的微球平均粒徑為1 450 nm (圖4C)，約為融合外源蛋白后粒徑的10倍，但其粒徑分布范圍較窄，均一度較好。結(jié)合之前結(jié)果可以看出，雖然ELPs的分子量，鹽濃度和鹽類型均會影響到微球的粒徑，但其范圍均在1.1 μm至3.6 μm之間，但融合外源蛋白后，其粒徑劇降，均小于0.2 μm，與真正意義上的納米顆粒粒徑小于0.1 μm更接近。因此，有望通過調(diào)控外界條件，使融合有外源酶蛋白的ELPs分子自組裝成納米級顆粒，形成“納米酶”，既能穩(wěn)定外源融合酶的結(jié)構(gòu)，又克服了微米級載體存在的傳質(zhì)和催化效率低問題[15-16]，提供一種全新制備納米酶的方法。

ELPs末端融合外源蛋白分子對其粒徑的影響已有報道，Bessa等[2]發(fā)現(xiàn)ELPs [PGVGV]160自組裝形成的顆粒粒徑在1 600 nm左右，而當其末端融合不同長度 (從22到176個氨基酸)的天冬氨酸后，顆粒粒徑顯著下降，粒徑最大約為250 nm，多數(shù)都在50 nm左右。而Yoshihiko等[3]則發(fā)現(xiàn)，在ELPs末端融合角質(zhì)化細胞生長因子(KGF)后，ELPs自組裝形成的顆粒粒徑未發(fā)生顯著變化，融合后粒徑僅減少了20 nm，差異不明顯。但文中均未對該現(xiàn)象作出任何解釋。

此外，融合外源蛋白后導致ELPs粒徑變化這一現(xiàn)象的原因亦無文獻報道。最近，有文獻研究了ELPs融合蛋白后其相變溫度的變化規(guī)律，通過計算融合蛋白的溶劑可及性表面及氨基酸的理化性質(zhì)，經(jīng)相關(guān)性分析表明：蛋白質(zhì)溶劑可及性表面的氨基酸電荷是影響ELPs相變溫度變化的最重要因素[17]。鑒于此，我們通過SWISS-MODEL以同源建模方法[18]構(gòu)建了所融合的1,3-丙二醇氧化還原酶以及木聚糖酶的3D結(jié)構(gòu)，并從PDB數(shù)據(jù)庫找到了人角質(zhì)化細胞生長因子的結(jié)構(gòu) (ID號：1QQL)[19]，通過Accelrys discovery studio visualizer計算了各分子表面的電荷分布，結(jié)果如圖5所示。由圖中可以看出，1,3-丙二醇氧化還原酶表面負電荷較多，人角質(zhì)化細胞生長因子表面正電荷較多，木聚糖酶分子表面負電荷略多于正電荷，此外，Bessa等[2]所融合的蛋白為長度從22到176個的聚天冬氨酸，該氨基酸在中性條件下帶負電荷，其分子表面全部帶負電荷。另一方面，在本文及文獻[2]中所使用的ELPs分子中均含有帶正電荷的Lys，這樣融合外源蛋白后，這些蛋白很容易通過靜電引力和ELPs相互作用并形成相對穩(wěn)定的復合結(jié)構(gòu)，由于所融合分子存在較大的空間位阻 (見圖6A和6B，分子的相互作用通過pyDockWEB建立[20]，PDOR和木聚糖酶與ELPs靜電引力的能量分別為–11.198 kcal/mol和–2.853 kcal/mol)，當ELPs自組裝成顆粒時，就嚴重阻礙了ELPs分子的聚集，從而導致其所形成的顆粒急劇減小。此外，通過VMD[21]計算了融合前ELPs、PDOR和木聚糖酶的溶劑可及性表面積 (SASA)，其大小分別為7 959.24 ?2，16 359.05 ?2和8 218.65 ?2，而當ELPs和PDOR及木聚糖酶融合后，融合蛋白的溶劑可及性表面積分別為23 449.38 ?2及15 103.30 ?2，相比未融合時，融合蛋白的SASA值分別減少了868.91 ?2和1 074.59 ?2。由此可進一步說明PDOR及木聚糖酶與ELPs融合后確實存在較明顯的空間位阻。另一方面，文獻[3]中融合蛋白分子表面雖然也帶有較多的正電荷，但其所用ELPs分子中無帶電氨基酸，融合蛋白和ELPs靜電相互作用很弱，結(jié)合不穩(wěn)定，當ELPs發(fā)生

圖5 幾種蛋白分子可及表面電荷分布Fig. 5 Solvent accessible charge distribution of the proteins. (A) 1,3-propanediol oxidoreductase. (B) Xylanase. (C) Keratinocyte growth factor. The dark grey means the positive charged residues; the light grey means the negative charged residues.

圖6 ELPs與蛋白融合的相互作用Fig. 6 The interaction between the ELPs and fusion protein. (A) 1,3-propanediol oxidoreductase. (B) Xylanase. The fusion proteins are in dark grey, the ELPs are in light grey.

自組裝時，其不能結(jié)合在ELPs分子表面，故空間位阻很小，同游離ELPs相差不大，因此，粒徑減少不明顯。總之，由于融合蛋白和ELPs分子帶相反電荷，分子間容易通過靜電引力相互作用而結(jié)合，由于融合蛋白的空間位阻大，阻礙了更多ELPs分子的聚集，這可能是導致其粒徑顯著下降的重要原因。

3 討論

本文較系統(tǒng)研究了影響ELPs自組裝成微球的影響因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比與鹽濃度和ELPs分子量，ELPs所融合的目標蛋白對其粒徑的影響最大，并提出融合蛋白導致ELPs自組裝成微球粒徑急劇下降的原因是由于其分子表面帶電荷，通過靜電引力與ELPs分子相互結(jié)合，由于融合蛋白較大的空間位阻而妨礙了ELPs分子的聚集。為了進一步證實該論斷，需選擇更多的融合蛋白，從中找出規(guī)律，以期闡明其分子機制，這將是后續(xù)研究的一個重點方向。

了解影響ELPs自組裝成微納米顆粒的因素，并掌握其中的關(guān)鍵要素，為精確控制顆粒的粒徑提供了便利，并能從分子層面探尋該影響因素發(fā)揮作用的機制；另一方面，若能控制顆粒粒徑在一個合適范圍，則能拓寬其應(yīng)用范圍，如在藥物包埋和釋放方面[22]，可提高載藥量，延長藥物釋放時間，在靶向藥物控釋載體方面有很好的發(fā)展前景[23]。此外，由于ELPs在重組酶分離方面具有的巨大優(yōu)勢[24-25]，若融合有重組酶的ELPs能自組裝成納米級顆粒，則可將其作為固定化酶的納米載體，實現(xiàn)酶分離、純化及固定化同步完成，非常有利于過程集成，同時也可考慮將其同膜分離技術(shù)相結(jié)合[26]，以提高催化效率，相關(guān)的研究仍在不斷深入進行中。

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(本文責編 郝麗芳)

Factors and mechanism influencing elastin-like
polypeptides self-assembled into micron-sized particles

Huihua Ge, Wenyan Wang, Guangya Zhang, and Shibin Wang

Department of Bioengineering and Biotechnology, Huaqiao University, Xiamen 361021, Fujian, China

Many factors influence the elastin-like polypeptides (ELPs) self-assembled into micron-sized particles.However, few efforts were made to investigate these factors. Using the ELPs [KV8F]n as the target, we studied systematically the factors with the dynamic light scattering. Our results show that the particle size increased and the uniform of particles decreased with the increase of the molecular weight. The analysis of size variation in self-assembled ELPs in response to changes in salt concentration indicated that the size increased with increasing the salt concentration, and the opposite response was observed when the concentration was above 0.4 mol/L. Under these conditions, the particles are micron-sized and larger than 1.1 μm. However, when the fusions containing the same ELPs and xylanase or 1,3-propanediol oxidoreductase, the size of the self-assembled ELPs particles decreased dramatically, which was only about 1/10 of that of the free ELPs. We proposed that the solvent accessible charged area of the enzymes could interact with the ELPs, the sterical hindrance of the enzymes prevent the aggregation of the ELPs. This might be the most important parameter in altering the particle size sharply.

Elastin-like polypeptides, electrostatic interaction, sterical hindrance, self-assemble, fusion protein

November 5, 2013; Accepted: December 31, 2013

Shibin Wang. Tel: +86-592-6162326; E-mail: sbwang@hqu.edu.cn

葛慧華, 王文研, 張光亞, 等. 影響類彈性蛋白多肽自組裝成微球的因素及其作用機制. 生物工程學報, 2014, 30(8):1274?1282.

Ge HH, Wang WY, Zhang GY, et al. Factors and mechanism influencing elastin-like polypeptides self-assembled intomicron-sized particles. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1274?1282.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21376103, 31170939), Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2013J01048).

國家自然科學基金 (Nos. 21376103，31170939)，福建省自然科學基金 (No. 2013J01048) 資助。

時間：2014-05-23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130560.html