張如婧，李招發(fā),2，施偉杰，許瑞安,2

1 華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

TAT-Cytoglobin融合蛋白的原核表達(dá)、純化及生物活性分析

張如婧1，李招發(fā)1,2，施偉杰1，許瑞安1,2

1 華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

旨在利用細(xì)胞穿膜肽TAT的穿膜作用和細(xì)胞珠蛋白 (Cytoglobin, Cygb) 的抗衰老、抗纖維化的功能，將二者通過基因工程的手段融合在一起，以期獲得能夠穿透細(xì)胞屏障的Cygb。通過兩次重疊PCR技術(shù)獲得了TAT-Cygb DNA，將其插入原核表達(dá)載體pET22b質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21, 篩選出可表達(dá)TAT-Cygb融合蛋白的大腸桿菌工程菌株。經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)TAT-Cygb，CM陽離子交換層析 (CM Sepharose Fast Flow Protocol) 獲得純度高達(dá)95%的TAT-Cygb融合蛋白，分子量約23 kDa。生物活性實(shí)驗(yàn)顯示，TAT-Cygb過氧化物酶比活力達(dá)到(422.30±0.36) U/mg。TAT-Cygb預(yù)處理的Hacat細(xì)胞可免受H2O2氧化應(yīng)激的損傷 (RGR=100%)，同時(shí)TAT-Cygb可治療已被H2O2氧化損傷的細(xì)胞 (RGR=98%)，與Cygb處理組相比具有顯著差異 (RGR=79%)。該研究首次成功利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了可穿透細(xì)胞膜的、有生物活性的TAT-Cygb融合蛋白，為繼續(xù)開展Cygb在抗衰老、抗纖維化和抗癌領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞穿膜肽，細(xì)胞珠蛋白，融合蛋白，純化，氧化應(yīng)激

細(xì)胞珠蛋白 (Cytoglobin, Cygb) 是由190個(gè)氨基酸組成、分子量為21.4 kDa的一種細(xì)胞內(nèi)球蛋白，在高等脊椎動(dòng)物各組織中廣泛分布[1]，最初由Kawada等在大鼠肝星狀細(xì)胞 (Hepatic stellate cells，HSC) 中發(fā)現(xiàn)[2]。研究表明Cygb具有過氧化物酶活性，可清除氧自由基，因此可保護(hù)組織免受氧化應(yīng)激的損傷[3-6]。本課題組曾通過siRNA干擾內(nèi)源性Cygb基因，在人肝星狀細(xì)胞系LX-2內(nèi)過表達(dá)Cygb，證明內(nèi)源性Cygb對(duì)過氧化氫及鐵過載兩種氧化應(yīng)激模型導(dǎo)致的肝星狀細(xì)胞損傷都具有顯著性的保護(hù)作用，而體外Cygb對(duì)細(xì)胞內(nèi)的活性氧清除效果不理想，推測(cè)與Cygb進(jìn)出細(xì)胞缺乏相應(yīng)的主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制有關(guān)[7]。因此體外表達(dá)的Cygb成功進(jìn)入細(xì)胞便成為發(fā)揮Cygb作用的前提和關(guān)鍵。

細(xì)胞穿膜肽，即CPPs，又稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域或膜轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，是一種由30個(gè)或者更少氨基酸組成的能夠穿透細(xì)胞膜的多肽，能夠運(yùn)載生物活性物質(zhì)如肽、蛋白、反義核苷酸和脂質(zhì)體等許多物質(zhì)[8-10]。TAT是最短的CPPs之一，含有11個(gè)氨基酸，已證明通過TAT的N端連接的融合蛋白能夠在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎所有檢測(cè)過的細(xì)胞類型[11-13]。本實(shí)驗(yàn)通過將TAT與人源Cygb融合表達(dá)，使Cygb在TAT介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并表現(xiàn)出很好的過氧化物酶等生物活性，有望應(yīng)用于護(hù)膚品行業(yè)，同時(shí)促進(jìn)了Cygb在抗衰老、抗纖維化和抗癌方面的研究[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料

人Cygb質(zhì)粒、pET22b(+)、大腸桿菌Escherichia coli DH5α和E. coli BL21 (DE3) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。Pfu、T4 DNA連接酶、DNA純化凝膠回收試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。NdeⅠ、EcoRⅠ購自大連寶生物工程有限公司。1 kb DNA Ladder購自北京索萊寶科技有限公司。DNA Marker V購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司?；蚬こ桃颰AT-1、TAT-2和TAT-3由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。鼠抗Cygb一抗和羊抗鼠HRP-IgG抗體購自Santa Cruz。CM-Sepharose購自GE醫(yī)療生物科學(xué)公司。人正常肝細(xì)胞株Chang Liver購自復(fù)旦大學(xué)。人永生化角質(zhì)細(xì)胞Hacat購買自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體pET22b-TAT-Cygb的構(gòu)建

通過兩次PCR，利用特異引物基因序列 (表1) 將編碼穿膜肽TAT (YGRKKRRQRRR)以及TAT和Cygb之間的Linker (GGGGSGGGGS) 的核苷酸序列添加到Cygb基因的5′端，并在引物TAT-2和TAT-3中分別加入NdeⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)。第一次PCR以人Cygb質(zhì)粒為模板，用上游引物TAT-1和下游引物TAT-3進(jìn)行擴(kuò)增；第二次PCR以經(jīng)凝膠回收的第一次PCR產(chǎn)物作為模板，用上游引物TAT-2和下游引物TAT-3擴(kuò)增，得到TAT-Cygb成熟蛋白對(duì)應(yīng)的DNA。目的片段回收、酶切后插入至pET22b(+) 載體的NdeⅠ/EcoRⅠ位點(diǎn)之間。轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α后經(jīng)菌落 PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，委托南京金斯瑞公司對(duì)pET22b(+)中插入的TAT-Cygb基因序列進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 TAT-Cygb融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將pET22b-TAT-Cygb表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E. coli BL21宿主菌，菌落PCR鑒定。取陽性克隆接種于乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，10 000 r/min離心收集菌體沉淀，并置于–80 ℃和4 ℃反復(fù)凍融兩次裂解細(xì)菌，用Tris-HCl上樣緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0) 重懸全菌蛋白。15 000 r/min、4 ℃離心15 min收集上清。由于TAT中含有多個(gè)帶正電的氨基酸，使融合蛋白TAT-Cygb等電點(diǎn)升高，因此可通過陽離子交換層析 (CM Sepharose Fast Flow Protocol) 純化蛋白。樣品過柱后，用清洗緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0) 洗去雜蛋白，再用洗脫緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0) 洗脫，收集唯一的洗脫峰即為融合蛋白。經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析脫鹽后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度。

1.2.3 免疫印跡鑒定

純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加鼠抗Cygb一抗 (1∶300)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，再滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體 (1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST和PBS各洗膜3次，最后使用BeyoECL熒光檢測(cè)試劑檢測(cè)目的蛋白，X膠片曝光后顯影、定影。

表1 構(gòu)建融合蛋白TAT-Cygb原核表達(dá)載體所用引物序列Table 1 Primer sequences for the construction of TAT-Cygb expression vectors

1.2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)驗(yàn)證TAT-Cygb的穿膜能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Chang liver細(xì)胞消化后，按30 000細(xì)胞/孔接種于24孔板中，2 mL/孔。培養(yǎng)48 h后，加藥作用細(xì)胞，空白對(duì)照加無血清培養(yǎng)基，陰性對(duì)照加10 μmol/L Cygb的無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加含10 μmol/L TAT-Cygb的無血清培養(yǎng)基。加藥作用1.5 h后，PBS洗3次；固定液室溫作用15 min后，PBS洗3次；通透液室溫孵育20 min后，PBS洗3次；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫作用15 min后，PBS洗3次；封閉液37 ℃孵育1 h后，PBS洗3次；加入抗Cygb鼠抗 (1∶200) 4 ℃孵育過夜后，PBS洗3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體 (1∶1 000) 37 ℃孵育2 h后，PBS洗3次。DAB方法進(jìn)行顯色，具體方法見邁新DAB顯色試劑盒。顯色完全后用中性樹脂封藏。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物活性分析

1) TAT-Cygb蛋白過氧化物酶活性的測(cè)定：利用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定重組TAT-Cygb蛋白的過氧化物酶活性。將波長(zhǎng)470 nm處反應(yīng)體系每分鐘吸光值A(chǔ)變化0.01定義為一個(gè)過氧化物酶活力單位。每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)為比活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得出純化后的重組TAT-Cygb蛋白過氧化物酶活性。

2) TAT-Cygb對(duì)人永生化角質(zhì)細(xì)胞Hacat增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hacat細(xì)胞消化后，按10 000細(xì)胞/孔接種于96孔板中，100 μL/孔。貼壁后加入TAT-Cygb蛋白 (終濃度依次為10、20、30、40、50、60 mg/L)，對(duì)照組加等體積PBS，于37 ℃作用48 h，PBS洗3次，加入10 μL 5 mg/mL MTT (工作濃度0.5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h。棄掉MTT，加DMSO 150 μL，微量振蕩器上振蕩10 min。以DMSO調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于492 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，參照波長(zhǎng)630 nm。

3) TAT-Cygb蛋白抗氧化作用：利用H2O2對(duì)Hacat細(xì)胞的氧化模型來研究TAT-Cygb蛋白抗氧化作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hacat細(xì)胞消化后，按10 000細(xì)胞/孔接種于96孔板中，100 μL/孔。貼壁后加入終濃度為200 μmol/L的H2O2于37 ℃作用48 h，進(jìn)行MTT檢驗(yàn)。TAT-Cygb (60 mg/L，20 mg/L) 或Cygb (60 mg/L，20 mg/L) 分別于H2O2處理前30 min或H2O2處理后30 min加入培養(yǎng)液中。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pET22b-TAT-Cygb的構(gòu)建與鑒定

通過兩次PCR法從人Cygb質(zhì)粒中擴(kuò)增Cygb基因序列，并連接上穿膜肽TAT序列得到TAT-Cygb序列，回收DNA片段長(zhǎng)度約654 bp，與預(yù)計(jì)值相符。將Nde/ⅠEcoRⅠ酶切PCR產(chǎn)物插入pET22b (+)，成功構(gòu)建pET22b-TAT-Cygb原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR、質(zhì)粒酶切圖譜 (圖1A) 及測(cè)序結(jié)果顯示pET22b-TAT-Cygb重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 TAT-Cygb融合蛋白的表達(dá)純化與鑒定

將pET22b-TAT-Cygb表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E. coli BL21宿主菌，涂布LB平板，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增出的654 bp片段的菌落為陽性克隆(圖1B)。菌體裂解后的上清，經(jīng)過陽離子交換(CM Sepharose Fast Flow Protocol) 層析，并經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析脫鹽、過濾除菌后就得到TAT-Cygb蛋白原液。通過該純化工藝，可以獲得純度大于95%的TAT-Cygb蛋白。純化過程中TAT-Cygb蛋白產(chǎn)物的純度分析見圖2A。目的蛋白TAT-Cygb蛋白分子量約為23 kDa，由于TAT中堿性氨基酸比例較高，使其在SDS-PAGE上的遷移率變小，因此顯示的分子量略有偏大。Western blotting分析表明，TAT-Cygb融合蛋白可與鼠抗Cygb發(fā)生特異性反應(yīng)，說明純化的融合蛋白是有活性的TAT-Cygb (圖2B)。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定TAT-Cygb蛋白原液濃度為2.105 g/L。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-TAT-Cygb和BL21陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定Fig. 1 Identification of recombinant expression vector pET22b-TAT-Cygb and BL21 positive transformants. (A) PCR and restriction analysis of pET22b-TAT-Cygb. 1: DNA marker V; 2: 1 kb DNA ladder; 3: pET22b-TAT-Cygb digested with EcoRⅠand NdeⅠ. (B) PCR analysis of BL21 positive transformants. 1:DNA marker V; 2: BL21/pET22b-TAT-Cygb cDNA.

圖2 融合蛋白TAT-Cygb的純化及Western blotting分析Fig. 2 Analysis of the TAT-Cygb fusion proteins purified by CM Sepharose Fast Flow Protocol. (A) SDS-PAGE analysis. 1: protein marker; 2: flow-though; 3: the eluted fractions with 100 mmol/L NaCl; 4: the eluted fractions with 500 mmol/L NaCl; 5: lysate of E. coli BL21 transformed with pET22b-TAT-Cygb; 6, 7: supernatant and sediment of lysate from E. coli BL21 transformed with pET22b-TAT-Cygb. (B) Western blotting analysis. 1: sample from BL21/pET22b; 2: sample from BL21/pET22b-TAT-Cygb.

2.3 細(xì)胞免疫化學(xué)

將人正常肝細(xì)胞株Chang Liver分別用含一定濃度Cygb和TAT-Cygb的無血清DMEM處理后的細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果表明，Cygb處理組細(xì)胞內(nèi)Cygb含量與空白對(duì)照組相差不大，細(xì)胞中含有少量的內(nèi)源性Cygb蛋白，呈略微的淡棕黃色(圖3A，3B)；而TAT-Cygb處理組細(xì)胞與空白對(duì)照組和Cygb處理組相比，著色程度明顯加深，說明穿膜肽TAT可以很好地運(yùn)輸Cygb進(jìn)入細(xì)胞(圖3C)。

圖3 ICC鑒定TAT-Cygb的穿膜作用Fig. 3 Transmembrane ability of TAT-Cygb identified by immunocytochemistry. (A–C) The level of Cygb in Chang Liver. (A1, A2) control Chang Liver. (B1, B2) Chang Liver treated with Cygb. (C1, C2) Chang Liver treated with TAT-Cygb. (A1, B1, C1 magnification 10×; A2, B2, C2 magnification 40×).

2.4 活性分析

2.4.1 過氧化物酶活性測(cè)定

利用愈創(chuàng)木酚法測(cè)得純化后的TAT-Cygb蛋白的過氧化物酶的比活為(422.30±0.36) U/mg。

2.4.2 TAT-Cygb對(duì)人永生化角質(zhì)細(xì)胞Hacat增殖的影響

如圖4所示，隨著作用于細(xì)胞的TAT-Cygb濃度增大，細(xì)胞相對(duì)增殖率呈小幅上升趨勢(shì)，表明在一定濃度范圍內(nèi)，TAT-Cygb不僅對(duì)Hacat細(xì)胞無毒性，還有助于提高細(xì)胞增殖能力。

2.4.3 TAT-Cygb對(duì)氧化反應(yīng)引起的細(xì)胞損傷的作用

如圖5所示，200 μmol/L H2O2對(duì)Hacat細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性，抑制率約24%。在預(yù)處理TAT-Cygb和Cygb蛋白實(shí)驗(yàn)組中，高、低濃度的TAT-Cygb和Cygb蛋白都能在一定程度上保護(hù)細(xì)胞免受H2O2氧化應(yīng)激損傷；在提前30 min加入H2O2處理的治療性實(shí)驗(yàn)組中，高、低濃度的TAT-Cygb蛋白能緩和H2O2對(duì)細(xì)胞造成的損傷，細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為98%和88% (P＜0.01)，而加入Cygb蛋白的細(xì)胞相對(duì)增殖率僅為79%，與H2O2氧化應(yīng)激模型組相比未表現(xiàn)出顯著性差異 (P＞0.05)。這表明與TAT-Cygb相比，Cygb由于缺乏主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞的能力，只能在預(yù)處理Cygb的情況下保護(hù)細(xì)胞，并不能治療被H2O2作用30 min后損傷的細(xì)胞，而TAT-Cygb蛋白不僅可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化攻擊，還能穿透細(xì)胞屏障治療已氧化損傷的細(xì)胞。

圖4 TAT-Cygb蛋白對(duì)Hacat細(xì)胞增殖的影響Fig. 4 Effects of TAT-Cygb protein on Hacat cell proliferation. **P＜0.01.

圖5 TAT-Cygb蛋白的抗氧化作用Fig. 5 The antioxidation of TAT-Cygb protein. 1: normal control; 2: 200 μmol/L H2O2; 3: 20 mg/L protein before 200 μmol/L H2O2; 4: 60 mg/L protein before 200 μmol/L H2O2; 5: 20 mg/L protein after 200 μmol/L H2O2; 6: 60 mg/L protein after 200 μmol/L H2O2. *P＜0.05; **P＜0.01.

3 討論

體外表達(dá)胞內(nèi)Cygb已經(jīng)有不少成功的報(bào)道[16-20]，但Cygb作為一種胞漿蛋白，尚缺乏進(jìn)出細(xì)胞相應(yīng)的主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制[21-24]。本實(shí)驗(yàn)采用基因工程手段在 Cygb 蛋白上連接小分子穿膜肽TAT，即可促使胞內(nèi)蛋白Cygb穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能。通過構(gòu)建pET22b-TATCygb/E. coli BL21表達(dá)工程菌，采用廉價(jià)的乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)表達(dá)TAT-Cygb蛋白。由于TAT含有多個(gè)帶正電的氨基酸，使得TAT-Cygb融合蛋白等電點(diǎn)升高，下游純化非常方便，粗分離的蛋白只需經(jīng)過一步CM Sepharose FastFlow Protocol層析就能得到純度高達(dá)95%的目的蛋白。

因TAT-Cygb蛋白的融合性，需要分別考察組成TAT-Cygb的蛋白或多肽部分的活性。只有確定了TAT能夠?qū)ygb導(dǎo)入細(xì)胞，才能考究Cygb對(duì)于細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)首先利用Western blotting確定了TAT-Cygb能與Cygb抗體結(jié)合，再通過免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了TAT-Cygb的穿膜能力。這在考察TAT穿膜能力的同時(shí)驗(yàn)證了TAT-Cygb中Cygb結(jié)構(gòu)和功能的正確性。

Cygb蛋白具有過氧化酶活性及氧自由基清除劑的作用。本課題組曾用重組Cygb蛋白作用于過氧化氫氧化應(yīng)激損傷的肝星狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Cygb蛋白對(duì)氧化損傷細(xì)胞無明顯治療作用[7]，推測(cè)Cygb蛋白因缺乏細(xì)胞表面受體或其他的主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制，較難被細(xì)胞吸收并在胞內(nèi)發(fā)揮作用。因此，本實(shí)驗(yàn)借助穿膜肽TAT的功能，將TAT-Cygb融合蛋白作用于氧化損傷的人永生化角質(zhì)細(xì)胞Hacat，證明TAT-Cygb不僅可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，還能治療已損傷的細(xì)胞。這進(jìn)一步驗(yàn)證了TAT-Cygb可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮抗氧化的作用。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地將穿膜肽TAT與Cygb融合表達(dá)，克服了胞內(nèi)蛋白Cygb無法穿透細(xì)胞膜發(fā)揮生物學(xué)功能的難題，使Cygb蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化、消除自由基、增加膠原表達(dá)、促進(jìn)新生血管生成和抗炎癥等功能成為可能。本文為研究Cygb在抗氧化、抗炎癥、抗肝纖維化和抗癌領(lǐng)域的作用和具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為加速藥物新靶點(diǎn)開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Expression, purification, and characterization of fusion protein TAT-Cytoglobin

Rujing Zhang1, Zhaofa Li1,2, Weijie Shi1, and Rui'an Xu1,2

1 School of Biomedical Sciences, Huaqiao University, Quanzhou 362021, Fujian, China
2 Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education, Quanzhou 362021, Fujian, China

The aim of this study was to obtain a cell-penetrating cytoglobin (Cygb), which combines the transmembrane function of cell-penetrating peptides TAT with the anti-aging and anti-fibrotic role of cytoglobin. The Cygb gene was complexed with TAT gene by overlapping PCR, inserted into the vector pET22b to construct the recombinant expression plasmid (pET22b-TAT-Cygb) and then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). The fusion protein TAT-Cygb, whose expression was induced by lactose, was purified by CM Sepharose Fast Flow Protocol and verified by Western blotting. The final TAT-Cygb had a molecular weight of 23 kDa with 95% purity, as shown by SDS-PAGE. As demonstrated by bioactivity experiments, TAT-Cygb exhibited a high specific peroxidase activity up to (422.30±0.36) U/mg. Both TAT-Cygb and Cygb pretreatment group could protect Hacat cells against oxidation of H2O2, but only TAT-Cygb treatment group could remedy cells injuried by H2O2(RGR=98%), which was significantly different from Cygb treatment group (RGR=79%). We successfully obtained the bioactive and cell-penetrating fusion protein TAT-Cygb that has the potential application in anti-aging, anti-fibrotic and anti-cancer.

cell-penetrating peptides, cytoglobin, fusion protein, purification, oxidative stress

November 11, 2013; Accepted: December 13, 2013

Zhaofa Li. Tel/Fax: +86-595-22690838; E-mail: lizhaofa@hqu.edu.cn

張如婧, 李招發(fā), 施偉杰, 等. TAT-Cytoglobin融合蛋白的原核表達(dá)、純化及生物活性分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8):1247?1255.

Zhang RJ, Li ZF, Shi WJ, et al. Expression, purification, and characterization of fusion protein TAT-Cytoglobin. Chin JBiotech, 2014, 30(8): 1247?1255.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81072578, 81271692).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 81072578, 81271692) 資助。

時(shí)間：2014-02-25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130573.html