柏文琴，楊魯紅，馬延和

1 山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

3 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

通過(guò)N端引入芳香族氨基酸提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性

柏文琴1,2，楊魯紅1，馬延和2,3

1 山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

3 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

耐熱的木聚糖酶具有用于造紙、麻類(lèi)脫膠和飼料生產(chǎn)等工業(yè)領(lǐng)域的巨大潛力，為了提高11家族堿性木聚糖酶Xyn11A-LC的熱穩(wěn)定性，通過(guò)理性設(shè)計(jì)在N-末端引入了芳香族氨基酸 (T9Y和D14F)。測(cè)定野生型和突變體的性質(zhì)表明，突變體的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性均獲得了提高。突變體的最適反應(yīng)溫度比野生型提高了5 ℃。野生型在65 ℃的Tris/HCl緩沖液 (pH 8.0) 中的半衰期為22 min，而突變體在此條件下的半衰期為106 min。圓二色光譜測(cè)定結(jié)果顯示野生型和突變體的Tm分別為55.3 ℃和67.9 ℃。因此，通過(guò)在N-末端引入芳香族氨基酸可以提高11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性和在高溫下的活性。

木聚糖酶，熱穩(wěn)定性，芳香族氨基酸，疏水作用

木聚糖酶 (EC 3.2.1.8) 是降解植物細(xì)胞壁中半纖維素木聚糖的關(guān)鍵酶。由于具有應(yīng)用于造紙、飼料生產(chǎn)、食品加工、麻類(lèi)脫膠以及生物燃料開(kāi)發(fā)等工業(yè)領(lǐng)域的潛力，木聚糖酶越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注[1]。在許多工業(yè)應(yīng)用過(guò)程中，由于降溫過(guò)程耗費(fèi)能量且工藝繁瑣，或者高溫可以提高底物的溶解度、降低污染率等原因，嗜熱的或耐熱的木聚糖酶顯示出很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[1]。盡管目前分離了大量的木聚糖酶，但是大多數(shù)是中溫酶。因此，需要通過(guò)蛋白質(zhì)工程對(duì)酶進(jìn)行分子改造，提高其嗜熱和/或熱穩(wěn)定性。

目前，通過(guò)序列比對(duì)，晶體結(jié)構(gòu)分析及突變研究，發(fā)現(xiàn)耐熱木聚糖酶和非耐熱木聚糖酶結(jié)構(gòu)非常相似，熱穩(wěn)定性可能僅由大量的微小修飾累計(jì)造成[1]。這些修飾包括提高離子鍵和氫鍵數(shù)目[2-3]、增強(qiáng)分子內(nèi)包裝[2]、額外的疏水相互作用[4-6]、提高表面帶電荷氨基酸數(shù)目及降低對(duì)化學(xué)變化敏感的氨基酸數(shù)目(Ser、Thr、Asn及Qln)[7-8]、 N-末端額外的β-鏈[2]、熱穩(wěn)定區(qū)的存在[9]、高比例的Ser/Thr及高含量的β-折疊[2]、在N-末端或C-末端或α-螺旋位置引入二硫鍵[10-12]。這些修飾可以加強(qiáng)分子內(nèi)和/或分子間的相互作用，從而導(dǎo)致酶分子更加穩(wěn)定。這些信息為提高木聚糖酶的分子改造提供了一定的理論指導(dǎo)。

11家族木聚糖酶N-末端的穩(wěn)定對(duì)酶整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起重要作用。研究表明，用來(lái)源于褐色高溫單孢菌Thermomonospora fusca的嗜熱木聚糖酶TfxA的N-末端33個(gè)氨基酸替換來(lái)源于橄欖綠鏈霉菌Streptomyces olivaceovirdis的中溫酶SoxB相應(yīng)末端，會(huì)提高中溫酶的熱穩(wěn)定性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定性的提高主要由于N-末端的5個(gè)氨基酸的替換 (T11Y、N12H、N13D、F15Y和Y16F)[6]。

前期工作中，我們從芽胞桿菌Bacillus sp. SN5中分離了堿性中溫木聚糖酶Xyn11A-LC，該酶是目前報(bào)道的具有最高催化活性的堿性木聚糖酶 (比活力為4511.9 U/mg)，具有應(yīng)用在工業(yè)領(lǐng)域尤其是紙漿助漂中的巨大潛力 (相關(guān)文章待發(fā)表)。其晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析 (PDB code：4IXL)[13]。通過(guò)與來(lái)源于T. fusca嗜熱木聚糖酶TfxA的N-末端序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析，在Xyn11A-LC的N-末端引入芳香族氨基酸。突變體提高了酶在高溫下的活性及熱穩(wěn)定性，更適合用于工業(yè)領(lǐng)域中。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)和質(zhì)粒pET28a購(gòu)自Novagen公司，分別用作基因表達(dá)的宿主和載體。攜帶堿性木聚糖酶Xyn11A-LC基因的質(zhì)粒作為定點(diǎn)突變的模板。限制性?xún)?nèi)切酶DpnⅠ和Pyrobest DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司。底物山毛櫸木聚糖購(gòu)自Sigma公司。His?Bind純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司。Quick Start? Bradford蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1突變位點(diǎn)的選擇

用在線軟件ClustalW2對(duì)Xyn11A-LC和來(lái)源于T. fusca嗜熱木聚糖酶TfxA[14]進(jìn)行N-末端序列的比對(duì)，尋找TfxA中對(duì)熱穩(wěn)定性起重要作用的5個(gè)氨基酸位點(diǎn) (9Y、10H、11D、13Y和14F) 在Xyn11A-LC中對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)。將其中存在的兩個(gè)差異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變 (T9Y和D14F)。用Swiss-PdbViewer軟件分析野生型和突變體的結(jié)構(gòu)。用Pymol軟件制作結(jié)構(gòu)圖片。

1.2.2定點(diǎn)突變

設(shè)計(jì)以上突變位點(diǎn) (T9Y和D14F) 的突變引物，序列信息見(jiàn)表1。以攜帶Xyn11A-LC基因的質(zhì)粒pET28a-Xyn11A-LC為模板[13]，用高保真的Pyrobest聚合酶，PCR擴(kuò)增全質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。

PCR循環(huán)條件：預(yù)變性：95 2 min℃；擴(kuò)增循環(huán)：95 35 s℃，58 1 min℃，循環(huán)16次；68 ℃延伸20 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

PCR產(chǎn)物用DpnI 37 ℃酶切過(guò)夜，80 ℃處理15 min使酶失活，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4野生型及突變體酶的表達(dá)及純化

將含有野生型和突變體基因的轉(zhuǎn)化子分別在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.6–0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。5 000 ×g離心10 min收集細(xì)胞，超聲破碎后獲得粗酶液。用His?Bind純化試劑盒進(jìn)行蛋白的純化，具體步驟參照操作說(shuō)明書(shū)。用12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后的蛋白純度。用Bio-Rad蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)純化后的蛋白濃度。℃，68 6.5 min

表1 定點(diǎn)突變引物序列Table 1 The primers in site-directed mutation

1.2.5野生型及突變體酶活性及熱穩(wěn)定性的測(cè)定

采用DNS法，具體參照文獻(xiàn)[15]。底物溶液為用Na2HPO4/檸檬酸緩沖液 (pH 7.5) 配制1%濃度的山毛櫸木聚糖。野生型和突變體的最適溫度測(cè)定條件為，酶在50、55、60、65 ℃分別反應(yīng)10 min。

野生型及突變體動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定條件：用Na2HPO4/檸檬酸緩沖液 (pH 7.5) 配制濃度分別1、2、4、6、8、10和12 mg/mL的山毛櫸木聚糖，20 μL酶液 (1 μg/mL) 加入到480 μL上述不同濃度的底物溶液中，置于最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)5 min。用Graphpad Prism 5.0計(jì)算出Vmax和Km。

熱失活的半衰期 (t1/2) 測(cè)定條件：將2 μg/mL的野生型或突變體蛋白，在Tris/HCl緩沖液 (pH 8.0) 中65 ℃保溫不同時(shí)間取樣，測(cè)定殘余酶活。用Excel軟件擬合熱失活曲線，計(jì)算半衰期t1/2[6]。

用圓二色光譜儀 (英國(guó)光物理公司產(chǎn)品)測(cè)定野生型及突變體的Tm值。測(cè)定光譜范圍為200–260 nm，溫度范圍為36–82 ℃。測(cè)定溶液為含有8 μmol/L蛋白樣品的20 mmol/L Tris/HCl (pH 8.0)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析用Global 3?分析軟件 (http://www.photophysics.com/software/global-3-analysis-software)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點(diǎn)的選擇

將Xyn11A-LC與TfxA進(jìn)行N-末端序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)TfxA的熱穩(wěn)定性起重要作用的5個(gè)位點(diǎn) (9Y、10H、11D、13Y和14F) 在Xyn11A-LC中對(duì)應(yīng)的分別為9T、10H、11D、13Y和14F。5個(gè)氨基酸中有2個(gè)位點(diǎn)存在差異，即T9Y和D14F。因此，選擇這兩個(gè)位點(diǎn)定點(diǎn)突變。前期研究工作中已經(jīng)解析了Xyn11A-LC的三維結(jié)構(gòu)[15]，我們利用野生型的結(jié)構(gòu)分析兩個(gè)位點(diǎn)突變后的突變體AI2的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)芳香族氨基酸分別位于β鏈B1和B2上，兩個(gè)苯環(huán)中心距離為6.67 ?，可能存在芳香環(huán)的相互作用，見(jiàn)圖1。因此，選定這兩個(gè)突變位點(diǎn) (T9Y和D14F)，可能會(huì)增強(qiáng)β1-β2鏈之間的穩(wěn)定性。

2.2 定點(diǎn)突變

利用PCR法擴(kuò)增全質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得突變體AI2 (T9Y和D14F) 的PCR產(chǎn)物，大小約為6 kb，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ37 ℃酶切過(guò)夜并熱處理使酶失活后，化學(xué)法轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)，測(cè)序驗(yàn)證了序列的正確。

2.3 野生型與突變體酶的表達(dá)和純化

將轉(zhuǎn)入野生型和突變體質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)菌株，在0.5 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下，37 ℃培養(yǎng)6 h后，超聲破碎獲得粗酶液。用Ni柱親和層析純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的效果見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，盡管只采用Ni柱親和層析純化，但是得到電泳純的野生型和突變體酶。目標(biāo)條帶與預(yù)期的分子量保持一致，突變體的分子量 (27.4 kDa) 略大于野生型 (27.3 kDa)。

圖1 N-端芳香族氨基酸的引入結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Introduction of aromatic acid residues in the N-terminus.

圖2 純化的Xyn11A-LC及突變體的SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified AI2 and Xyn11A-LC. M: the standard protein molecular mass markers; 1-2: the purified AI2 and Xyn11A-LC, respectively.

2.4 野生型和突變體酶的性質(zhì)測(cè)定

2.4.1最適溫度測(cè)定

為了測(cè)定野生型和突變體的最適反應(yīng)溫度，在相同的pH條件下，分別測(cè)定不同溫度下的酶活性，以各自的最高酶活性為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。如圖3所示，突變體AI2的最適溫度都為60 ℃，比野生型提高了5 ℃。

圖3 溫度對(duì)野生型及突變體AI2的活性影響Fig. 3 Effects of temperature on the activity of Xyn11A-LC and AI2.

2.4.2野生型和突變體的熱穩(wěn)定性半衰期測(cè)定

用Tris/HCl緩沖液 (pH 8.0) 將野生型和突變體稀釋到相同濃度，分別置于65 ℃保溫不同時(shí)間取樣，測(cè)定殘余酶活。用Excel軟件擬合熱失活曲線 (圖4)，計(jì)算出野生型和突變體的t1/2分別為22 min和106 min。說(shuō)明N-末端芳香族氨基酸的引入大大提高了酶的熱穩(wěn)定性。

2.4.3野生型和突變體的Tm值測(cè)定

圓二色光譜結(jié)果顯示野生型與突變體的AI2的Tm值分別為55.3 ℃和67.9 ℃，見(jiàn)圖5和表2。與野生型相比較，突變體AI2的Tm值提高了12.6 ℃。這表明芳香族氨基酸的引入明顯提高了熱穩(wěn)定性。

圖4 Xyn11A-LC及突變體AI2在65 ℃、pH 8.0條件下的熱失活曲線圖Fig. 4 Thermal inactivation of Xyn11A-LC and AI2 at 65 ℃ and pH 8.0.

圖5 圓二色光譜測(cè)定Tm值的蛋白變性擬合曲線圖Fig. 5 The melting temperature measurement using CD spectroscopy.

表2 野生型和突變體的酶學(xué)性質(zhì)比較Table 2 Comparison of the enzymatic properties of wild type Xyn11A-LC and the mutant

2.4.4野生型和突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

野生型及突變體在各自最適反應(yīng)條件下，以山毛櫸木聚糖為底物，測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。與野生型相比較，突變體AI2降低了催化活性。芳香族氨基酸的引入增加了酶分子的剛性，但是剛性增加的同時(shí)會(huì)造成酶活性的下降。此外，突變體的Km值下降為2.5 mg/mL，而野生型的Km值為3.3 mg/mL，表明突變體與底物的親和力上升。推測(cè)可能引入的芳香族氨基酸在增強(qiáng)疏水作用的同時(shí)，還可能是潛在的與底物結(jié)合的位點(diǎn)。盡管突變體AI2的催化活性下降，但由于Km值也下降，導(dǎo)致其催化效率 (kcat/Km) 反而高于野生型。

3 討論

理性設(shè)計(jì)是繼DNA重組技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)之后發(fā)展的最早的蛋白質(zhì)工程研究策略，至今仍廣泛應(yīng)用。理性設(shè)計(jì)需要蛋白的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。嗜熱蛋白是通過(guò)結(jié)構(gòu)的微小變化可以獲得較高的穩(wěn)定性。疏水作用、表面離子鍵、縮小疏水表面積和末端的穩(wěn)定對(duì)嗜熱蛋白的熱穩(wěn)定性起重要作用[16-19]。另外氫鍵、二硫鍵和金屬離子結(jié)合力等分子內(nèi)作用力，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)型和氨基酸的組成對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性都有一定的影響[20-23]。蛋白嗜熱機(jī)制的研究，為理性設(shè)計(jì)提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性改造提供了一定的理論指導(dǎo)。

11家族木聚糖酶具有β-果凍卷 (β-jelly roll)折疊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由15個(gè)β-鏈形成兩個(gè)互相纏繞的圍繞催化中心的反向平行β-片層A和B。其C-末端包埋在β-片層的內(nèi)部，而N-末端位于β-片層的側(cè)面，直接暴露在親水環(huán)境中，見(jiàn)圖1。因此提高N-末端的穩(wěn)定性對(duì)于酶的整體穩(wěn)定性起重要作用。目前突變結(jié)果表明，在N-末端引入二硫鍵及疏水作用都可以提高11家族木聚糖酶的嗜熱性[6,11]。來(lái)源于T. fusca的木聚糖酶TfxA是極少數(shù)的11家族嗜熱酶之一[14]。Georis等以通過(guò)定點(diǎn)突變證明了TfxA的熱穩(wěn)定區(qū)主要在N-末端[4]。用TfxA的N末端序列替換來(lái)源于S. olivaceoviridis的中溫木聚糖酶XynB的相應(yīng)序列，融合蛋白的熱穩(wěn)定性明顯提高[24-25]。近一步發(fā)現(xiàn)，N-末端的5個(gè)氨基酸對(duì)酶的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用[6]。

前期研究中獲得了11家族堿性木聚糖酶Xyn11A-LC，該酶是目前分離的具有最高催化活性的堿性木聚糖酶，具有應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域的巨大潛力。但是Xyn11A-LC為中溫酶，最適反應(yīng)溫度55 ℃，在65 ℃時(shí)的半衰期僅22 min。為了提高酶的熱穩(wěn)定性，本文通過(guò)與嗜熱酶TfxA的N-末端序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析，選定兩個(gè)定點(diǎn)突變位點(diǎn) (T9Y和D14F)，構(gòu)建了突變體AI2，分析突變體的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)突變位點(diǎn)分別位于β鏈B1和B2上，二者可能通過(guò)形成疏水作用，增加N-末端B1和B2之間的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高整個(gè)酶分子的穩(wěn)定性。測(cè)定結(jié)果表明，突變體的最適溫度和熱穩(wěn)定性獲得明顯的提高，但是催化活性下降。說(shuō)明在增加蛋白分子的剛性的同時(shí)，酶分子的柔性下降，進(jìn)而造成酶活性的下降。此外，突變體的Km值比野生型低，可能由于引入的芳香族氨基酸位于酶分子催化裂隙，是酶與底物結(jié)合的潛在位點(diǎn)，使底物在較高的溫度下與酶的結(jié)合力提高，從而提高酶的嗜熱性及熱穩(wěn)定性[4]。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Improving thermal stability of xylanase by introducing aromatic residues at the N-terminus

Wenqin Bai1,2, Luhong Yang1, and Yanhe Ma2,3

1 School of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen 041004, Shanxi, China
2 National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
3 National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Thermophilic and alkalophilic xylanases have great potential in the pulp bleaching industry. In order to improve the thermal stability of an alkaline family 11 xylanase Xyn11A-LC, aromatic residues were introduced into the N-terminus of the enzyme by rational design. The mutant increased the optimum temperature by 5 ℃. The wild type had a half-time of 22 min at 65 ℃ and pH 8.0 (Tris-HCl buffer). Under the same condition, the mutant had the half-time of 106 min. CD spectroscopy revealed that the melting temperature (Tm) values of the wild type and mutant were 55.3 ℃ and 67.9 ℃, respectively. These results showed that the introduction of aromatic residues could enhance the thermal stability of Xyn11A-LC.

xylanase, thermal stability, aromatic residues, hydrophobic interaction

April 1, 2014; Accepted: May 19, 2014

Luhong Yang. Tel: +86-357-2051196; E-mail: ylh1010309@126.com

柏文琴, 楊魯紅, 馬延和. 通過(guò)N端引入芳香族氨基酸提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8):1217?1224.

Bai WQ, Yang LH, Ma YH. Improving thermal stability of xylanase by introducing aromatic residues at the N-terminus. ChinJ Biotech, 2014, 30(8): 1217?1224.

Supported by: Chinese Key Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSZD-EW-Z-015), National Natural Science Foundation of China (No. 31301245).

中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (No. KSZD-EW-Z-015), 國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31301245) 資助。

時(shí)間：2014-05-21 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140194.html