戴冠蘋，孫濤，苗良田，李清艷，肖冬光，張學(xué)禮

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

3 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

工業(yè)生物技術(shù)

RBS文庫(kù)調(diào)控重組大腸桿菌β-胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因提高β-胡蘿卜素合成能力

戴冠蘋1,2,3*，孫濤1,2,3*，苗良田1,2,3，李清艷2,3，肖冬光1，張學(xué)禮2,3

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

3 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

β-胡蘿卜素屬于類胡蘿卜素家族的一員，在藥品、保健品、化妝品和食品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。本研究通過(guò)用RBS文庫(kù)對(duì)重組大腸桿菌CAR005中β-胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵基因dxs、idi和crt操縱子進(jìn)行調(diào)控來(lái)提高β-胡蘿卜素合成能力。研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因分別用RBS文庫(kù)調(diào)控后，與起始菌株相比β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高分別有7%、11%和17%的提高，表明使用RBS文庫(kù)調(diào)控比使用多個(gè)固定強(qiáng)度啟動(dòng)子調(diào)控能篩選到更有利于目標(biāo)產(chǎn)品合成的基因表達(dá)強(qiáng)度。三基因組合調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量相對(duì)于CAR005菌株提高了35%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，單基因文庫(kù)篩選到的最優(yōu)強(qiáng)度對(duì)于組合調(diào)控來(lái)說(shuō)，未必是最優(yōu)強(qiáng)度。本研究為利用基因表達(dá)調(diào)控優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑提供了一種新的方案。

β-胡蘿卜素，RBS文庫(kù)，基因表達(dá)調(diào)控，大腸桿菌

β-胡蘿卜素 (β-carotene) 是類胡蘿卜素家族中的典型代表，是一種優(yōu)良的天然黃色色素，在人體和動(dòng)物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為維生素A，同時(shí)其本身具有良好的預(yù)防“3C”即癌癥、心血管疾病和白內(nèi)障的作用，也能提高機(jī)體的免疫功能，兼具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-4]。世界上已有50多個(gè)國(guó)家地區(qū)批準(zhǔn)使用，目前廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品和保健品行業(yè)[5-6]。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)生物基化學(xué)品因其具有綠色清潔的生產(chǎn)工藝和更高的生產(chǎn)特異性而得到越來(lái)越多的關(guān)注[4,7]。

自然界中的多種生物均能合成β-胡蘿卜素[8-10]。大腸桿菌遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)單，以大腸桿菌作為出發(fā)菌株，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建生產(chǎn)類胡蘿卜素的基因工程菌，已成為包括β-胡蘿卜素在內(nèi)的多種類胡蘿卜素產(chǎn)品生產(chǎn)的新模式[11-15]。對(duì)產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌的遺傳改造主要集中在過(guò)表達(dá)大腸桿菌自身的2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑) 中的關(guān)鍵基因和過(guò)表達(dá)外源的甲羥戊酸途徑 (MVA途徑)。Yuan等[11]為了鑒定MEP途經(jīng)的限速步驟，利用同源重組的方法，用T5啟動(dòng)子在染色體上分別替換了MEP途徑的各基因的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)調(diào)控dxs、idi、ispB、ispDF基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別提高了100%、40%、20%和40%。用T5啟動(dòng)子對(duì)這4個(gè)基因進(jìn)行組合調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了6.3倍，達(dá)到6 mg/g干重細(xì)胞。Suh[16]用強(qiáng)啟動(dòng)子T5調(diào)控MEP途經(jīng)的關(guān)鍵基因dxs、idi和ispDF后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量比對(duì)照提高了4.5倍。Yoon等將MVA途經(jīng)的下游3個(gè)基因和β-胡蘿卜素合成相關(guān)基因以質(zhì)粒形式在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)，在外源添加甲羥戊酸的情況下，產(chǎn)量達(dá)503 mg/L，含量達(dá)49.3 mg/g細(xì)胞干重[12-13]。Nam等以質(zhì)粒形式過(guò)表達(dá)MEP途徑中的dxs基因和外源MVA途徑基因，將β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高到2.47 g/L[17]。

以前的絕大部分研究都是使用強(qiáng)啟動(dòng)子(如T7、T5和Trc) 來(lái)調(diào)控MEP或MVA途徑中的關(guān)鍵基因，從而提高β-胡蘿卜素的合成能力。然而，研究表明強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)于獲得目的產(chǎn)物的最大代謝流量來(lái)說(shuō)并不一定是最優(yōu)的[18-20]。

我們首次用多個(gè)固定強(qiáng)度的調(diào)控元件去調(diào)控MEP途徑各基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MEP途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)閐xs和idi基因；并且證明使用多個(gè)不同強(qiáng)度的調(diào)控元件對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控比僅使用強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控更為有效[21]。我們用同樣方法對(duì)β-胡蘿卜素合成途徑的5個(gè)模塊進(jìn)行系統(tǒng)研究，得到CAR005菌株，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)2.16 g/L，含量達(dá)60 mg/g 干重細(xì)胞[22]。選取多個(gè)固定強(qiáng)度的調(diào)控元件雖然比僅使用強(qiáng)啟動(dòng)子更能獲得較好的表達(dá)強(qiáng)度，但是由于調(diào)控元件的數(shù)量和強(qiáng)度范圍有限，往往也并不能獲得最優(yōu)的表達(dá)強(qiáng)度。

原核生物mRNA上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS) 是位于起始密碼子AUG上游3–9個(gè)富含嘌呤核苷酸的序列，與核糖體小亞基16sRNA富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)。RBS的序列和蛋白翻譯速率密切相關(guān)，能顯著影響目的蛋白的表達(dá)量。我們前期利用RBS文庫(kù) (序列為CAGGAGRNNNNNN)調(diào)控了E. coli ATCC 8739染色體上的β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)，隨機(jī)選29個(gè)菌測(cè)定β-半乳糖苷酶活性，活性范圍是lacZ基因原始啟動(dòng)子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的0.17–8.6倍，說(shuō)明RBS文庫(kù)可以有效調(diào)控基因，并且調(diào)控范圍較大[23]。本研究擬用RBS區(qū)文庫(kù)對(duì)CAR005中β-胡蘿卜素代謝途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行精確調(diào)控，研究其是否比使用多個(gè)固定強(qiáng)度調(diào)控元件更有利于β-胡蘿卜素的生產(chǎn)，同時(shí)也為代謝工程中基因表達(dá)的精確調(diào)控提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑

氨芐青霉素和氯霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA Marker trans2K，購(gòu)自大連寶生物工程公司；限制性內(nèi)切酶PacⅠ、BamHⅠ、DpnⅠ、T4 DNA連接酶、快連酶、T4多聚核苷酸激酶購(gòu)自NEB公司；胡蘿卜素標(biāo)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司 (Cat. No. C4582)；其他試劑均為分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Shimadzu UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)；PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉(zhuǎn)儀MicroPulser；臺(tái)式高速離心機(jī)，Eppendorf 5415D；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1200。

1.1.3菌株

本研究所用的菌株見(jiàn)表1。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this study

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化鈉；氨芐青霉素、氯霉素終濃度分別為100、34 μg/mL。LB固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

無(wú)鹽蔗糖培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10%的蔗糖。無(wú)鹽蔗糖固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。好氧培養(yǎng)：將保存于?80 ℃的菌種在LB平板上劃線活化，挑取單菌落接種到15 mm×100 mm試管 (含4 mL LB培養(yǎng)基)中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL三角瓶 (含10 mL LB培養(yǎng)基) 中，30 ℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h。收集菌液用于測(cè)定β-胡蘿卜素含量。

1.2.2 RBS文庫(kù)調(diào)控β-胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因

本研究通過(guò)兩步同源重組的方法構(gòu)建基因的RBS文庫(kù)，獲得的重組菌株中無(wú)抗生素基因和FRT序列殘留[24]。第一步同源重組，在將要調(diào)控的基因ATG的前面插入一個(gè)cat-sacB基因片段。第二步同源重組中，cat-sacB基因簇被帶有RBS文庫(kù)的DNA片段取代。含RBS文庫(kù)的DNA片段是由一對(duì)長(zhǎng)引物，以M1-93基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增而來(lái)；上游引物包括待調(diào)控基因原始啟動(dòng)子外的50 bp堿基和與M1-93的人工啟動(dòng)子同源的20 bp堿基。下游引物包括待調(diào)控基因的起始密碼子后的50 bp堿基 (基因的+1到+50區(qū))、RBS區(qū)兼并引物片段(CAGGAGRNNNNNN) 和與M1-93的人工啟動(dòng)子同源的21 bp堿基。兩步同源重組的步驟見(jiàn)圖1?？寺〉暮Y選是通過(guò)在含有蔗糖的無(wú)鹽LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)完成的。在蔗糖存在的情況下，表達(dá)sacB基因的菌株因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過(guò)程中積累果聚糖對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性而被殺死。cat-sacB基因簇被替換掉的細(xì)胞通過(guò)富集而被篩選出來(lái)[21-23]。

圖1 RBS文庫(kù)構(gòu)建流程圖 (A：第一步同源重組；B：第二步同源重組)Fig. 1 Modulation of gene expression with RBS library by the two-step recombination method. (A) The first recombination step. (B) The second recombination step.

對(duì)于dxs基因，使用dxs-cat-F/dxs-cat-R引物 (表2)，以pXZ-CS[26]為模板，PCR擴(kuò)增出DNA片段，將該片段純化后電轉(zhuǎn)入含有pKD46[25]的待調(diào)控菌株CAR005的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素、氯霉素的LB平板中培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單克隆，用引物cat-up/dxs-381-down進(jìn)行 PCR驗(yàn)證 (表2)，驗(yàn)證正確的克隆命名為Dxs-cat-sacB。另外，使用dxs-up-p/dxs-RBSL-down引物 (表2)，以 M1-93菌株的基因組DNA模板，PCR擴(kuò)增出RBS庫(kù)片段，將該片段純化后電轉(zhuǎn)入Dxs-cat-sacB的感受態(tài)細(xì)胞中，在250 mL三角瓶 (含50 mL無(wú)鹽蔗糖培養(yǎng)基) 中培養(yǎng)12 h。然后將菌液稀釋、涂布到2個(gè)無(wú)鹽蔗糖平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。每個(gè)平板得到300個(gè)左右重組子，共600個(gè)左右重組子。隨機(jī)挑取100個(gè)克隆分別在氯霉素平板和LB平板上進(jìn)行初篩，90%以上都為重組成功菌株 (不能在氯霉素平板上生長(zhǎng))。隨機(jī)選5個(gè)菌株測(cè)序，RBS區(qū)域的序列各不相同，表明庫(kù)的多樣性比較豐富。

隨機(jī)挑選30個(gè)單克隆，用引物p-yanzheng/dxs-381-down (表2) 進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，挑選15個(gè)驗(yàn)證正確、顏色比較黃的克隆命名為 dxs1、dxs2、…、dxs15，用于測(cè)定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。采用同樣的方法調(diào)控idi基因和crt操縱子，所用的引物序列見(jiàn)表2。

1.2.3 RBS文庫(kù)組合調(diào)控β-胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因

采用上述兩步同源重組法，對(duì)β-胡蘿卜素合成途徑中的3個(gè)關(guān)鍵基因 (包括dxs、idi和crt操縱子) 進(jìn)行組合調(diào)控。組合調(diào)控方法為：選取單基因調(diào)控后產(chǎn)量提高最高的菌株crtE3為出發(fā)菌株，對(duì)dxs基因進(jìn)行RBS文庫(kù)調(diào)控，挑選30個(gè)驗(yàn)證正確、顏色較黃的克隆命名為crtE3-dxs1、crtE3-dxs2、…、crtE3-dxs30，用于測(cè)定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。同時(shí)，使用引物dxs-up-p/dxs-381-down (表2)，以dxs單基因RBS文庫(kù)調(diào)控后產(chǎn)量最高的菌株dxs15為模板，PCR擴(kuò)增出DNA片段，利用該調(diào)控元件調(diào)控crtE3菌株的dxs基因，篩選驗(yàn)證正確的菌株，命名為crtE3-dxs15A，用于測(cè)定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。采用同樣的方法，選取crt操縱子和dxs基因組合調(diào)

控后產(chǎn)量最高的菌株為出發(fā)菌株，對(duì)idi基因進(jìn)行RBS文庫(kù)調(diào)控。

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this work

1.2.4 β-胡蘿卜素產(chǎn)量的檢測(cè)方法

通過(guò)測(cè)定丙酮萃取的β-胡蘿卜素在453 nm下的吸光度來(lái)確定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。取500 μL菌液于14 000 r/min離心3–5 min，無(wú)菌水清洗后，用1 mL丙酮懸浮沉淀，在55 ℃黑暗條件下萃取15 min，然后將樣品在14 000 r/min下離心10 min，將含有β-胡蘿卜素的上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。紫外分光光度計(jì)453 nm下測(cè)定β-胡蘿卜素吸光度值，并計(jì)算其對(duì)細(xì)胞濁度(OD600) 的相對(duì)值，表示單位菌體β-胡蘿卜素的相對(duì)產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵基因dxs、idi和crt操縱子單獨(dú)調(diào)控

我們構(gòu)建產(chǎn)β-胡蘿卜素重組大腸桿菌CAR005時(shí)，發(fā)現(xiàn)dxs、idi和crt操縱子是β-胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵基因。本研究從CAR005出發(fā)，使用兩步同源重組方法 (圖1)，分別構(gòu)建了dxs、idi和crt操縱子的RBS文庫(kù)，分別隨機(jī)挑選15個(gè)菌株，測(cè)定β-胡蘿卜素產(chǎn)量，以驗(yàn)證RBS文庫(kù)調(diào)控是否優(yōu)于固定強(qiáng)度調(diào)控，并進(jìn)一步提高重組菌株中β-胡蘿卜素產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，3個(gè)基因構(gòu)建RBS文庫(kù)后，都篩選到β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的菌株，dxs基因調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株為dxs15，相對(duì)于CAR005產(chǎn)量提高了7%。idi基因調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株為idi10，相對(duì)于CAR005產(chǎn)量提高了11%。crt操縱子調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株為crtE3，相對(duì)于CAR005產(chǎn)量提高了17%。不過(guò)crt操縱子基因調(diào)控后菌體生長(zhǎng)有所下降。因?yàn)槌霭l(fā)菌株CAR005中dxs、idi和crt操縱子的調(diào)控元件為固定強(qiáng)度中選出的最優(yōu)強(qiáng)度，RBS文庫(kù)調(diào)控后均得到β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的菌株，表明RBS文庫(kù)調(diào)控相對(duì)于多個(gè)固定強(qiáng)度調(diào)控，能篩選到更有利于β-胡蘿卜素合成的表達(dá)強(qiáng)度。單基因調(diào)控β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株的RBS序列見(jiàn)表3。

2.2 crt操縱子和dxs基因組合調(diào)控結(jié)果

三基因分別調(diào)控后，調(diào)控crt操縱子的文庫(kù)中挑到產(chǎn)量最高的菌株crtE3，產(chǎn)量相對(duì)于CAR005提高了17%，而另外兩個(gè)基因文庫(kù)調(diào)控后產(chǎn)量最高的分別提高了7%和11%，因此從crtE3出發(fā)，文庫(kù)調(diào)控dxs基因。同時(shí)，用dxs的RBS文庫(kù)中產(chǎn)量最高的菌株dxs15的調(diào)控元件去調(diào)控crtE3中的dxs基因。由圖3可知，組合調(diào)控crt操縱子和dxs基因后，只有crtE3-dxs3和crtE3-dxs4產(chǎn)量比crtE3略高，β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別是CAR005的1.19倍和1.18倍，表明在crtE3菌株中，dxs基因的表達(dá)強(qiáng)度已經(jīng)不是β-胡蘿卜素合成的限制因素。另外，dxs15的調(diào)控元件調(diào)控crtE3的dxs基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量相對(duì)于CAR005只提高了8%，而相對(duì)于crtE3產(chǎn)量反而有所下降。表明單基因文庫(kù)篩選到的最優(yōu)強(qiáng)度對(duì)于組合調(diào)控來(lái)說(shuō)，未必是最優(yōu)的強(qiáng)度。β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株crtE3-dxs3的dxs基因的RBS序列見(jiàn)表3。

2.3 crt操縱子、dxs和idi基因組合調(diào)控結(jié)果

圖2 RBS文庫(kù)調(diào)控dxs, idi和crt操縱子后β-胡蘿卜素相對(duì)產(chǎn)量 (A：RBS文庫(kù)調(diào)控dxs基因；B：RBS文庫(kù)調(diào)控idi基因；C：RBS文庫(kù)調(diào)控crtE操縱子)Fig. 2 Relative β-carotene production by E. coli strains after modulating dxs, idi and crt operon of strain CAR005 with RBS libraries. β-carotene yield was compared to parent strain CAR005. (A) Modulating dxs gene. (B) Modulating idi gene. (C) Modulating crt operon.

表3 代表性菌株的dxs、idi和crt基因的RBS序列Table 3 RBS sequence of dxs, idi and crt genes of representative strains

圖3 crt操縱子和dxs基因組合調(diào)控后β-胡蘿卜素相對(duì)產(chǎn)量Fig. 3 Relative β-carotene yield after combined modulation of crt operon and dxs genes expression.

圖4 crt操縱子、dxs和idi基因組合調(diào)控后β-胡蘿卜素相對(duì)產(chǎn)量Fig. 4 Relative β-carotene yield after combined modulation of crt operon, dxs and idi genes expression.

選取兩基因組合調(diào)控β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高的菌株crtE3-dxs3為出發(fā)菌株，進(jìn)一步使用RBS文庫(kù)及idi的RBS文庫(kù)中產(chǎn)量最高的菌株idi10的調(diào)控元件去調(diào)控idi基因。由結(jié)果可知 (圖4)，組合調(diào)控crt操縱子、dxs和idi基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量有明顯提高，所選的30個(gè)菌株中，28個(gè)菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量均高于出發(fā)菌株crtE3-dxs3。產(chǎn)量最高菌株crtE3-dxs3-idi20的β-胡蘿卜素產(chǎn)量是CAR005的1.32倍。另外，idi單基因RBS文庫(kù)得到的最優(yōu)強(qiáng)度調(diào)控crtE3-dxs3的idi基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量?jī)H為CAR005的1.23倍，遠(yuǎn)低于文庫(kù)調(diào)控所得的最高產(chǎn)量菌株，進(jìn)一步說(shuō)明單基因文庫(kù)篩選到的最優(yōu)強(qiáng)度對(duì)于組合調(diào)控來(lái)說(shuō)，未必是最優(yōu)強(qiáng)度。

將所有RBS文庫(kù)調(diào)控中產(chǎn)量最高的菌株，一起做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由結(jié)果可知，建庫(kù)時(shí)只挑一個(gè)克隆去培養(yǎng)測(cè)定的結(jié)果與3次重復(fù)結(jié)果基本是一致，說(shuō)明建庫(kù)時(shí)挑多個(gè)克隆、不設(shè)重復(fù)去篩選高產(chǎn)菌株的方法可行。經(jīng)RBS文庫(kù)組合調(diào)控β-胡蘿卜素合成途徑中的3個(gè)關(guān)鍵基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量相對(duì)于出發(fā)菌株提高了35%。β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株crtE3-dxs3-idi20的idi基因的RBS序列見(jiàn)表3。

圖5 調(diào)控β-胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因后β-胡蘿卜素的相對(duì)產(chǎn)量Fig. 5 Relative β-carotene yield of engineered E. coli strains after modulating key β-carotene synthesis genes expression. Three repeats were performed for each strain, and the error bars represented standard deviation.

3 結(jié)論

本文利用RBS文庫(kù)調(diào)控的方法對(duì)β-胡蘿卜素合成途徑中的3個(gè)關(guān)鍵基因dxs、idi和crt操縱子進(jìn)行了單基因調(diào)控和組合調(diào)控，使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了35%。研究發(fā)現(xiàn)，使用RBS文庫(kù)調(diào)控比使用多個(gè)固定強(qiáng)度調(diào)控的效果更好，能篩選到更有利于目標(biāo)產(chǎn)品合成的基因表達(dá)強(qiáng)度。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，單基因文庫(kù)篩選到的最優(yōu)強(qiáng)度對(duì)于組合調(diào)控來(lái)說(shuō)，未必是最優(yōu)強(qiáng)度。本研究為利用基因表達(dá)調(diào)控優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑提供了一種新的方案。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Modulating expression of key genes within β-carotene synthetic pathway in recombinant Escherichia coli with RBS library to improve β-carotene production

Guanping Dai1,2,3＊, Tao Sun1,2,3＊, Liangtian Miao1,2,3, Qingyan Li2,3, Dongguang Xiao1, and Xueli Zhang2,3

1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China
2 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
3 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

β-carotene belongs to carotenoids family, widely applied in pharmaceuticals, neutraceuticals, cosmetics and food industries. In this study, three key genes (dxs, idi, and crt operon) within β-carotene synthetic pathway in recombinant Escherichia coli strain CAR005 were modulated with RBS Library to improve β-carotene production. There were 7%, 11% and 17% increase of β-carotene yield respectively after modulating dxs, idi and crt operon genes with RBS Library, demonstrating that modulating gene expression with regulatory parts libraries would have more opportunities to obtain optimal production of target compound. Combined modulation of crt operon, dxs and idi genes led to 35% increase of β-carotene yield compared to parent strain CAR005. The optimal gene expression strength identified in single gene modulation would not be the optimal strength when used in combined modulation. Our study provides a new strategy for improving production of target compound through modulation of gene expression.

β-carotene, RBS library, modulation of gene expression, Escherichia coli

November 9, 2013; Accepted: December 13, 2013

Xueli Zhang. Tel/Fax: 86-22-84861983; E-mail: zhang_xl@tib.cas.cn

戴冠蘋, 孫濤, 苗良田, 等. RBS文庫(kù)調(diào)控重組大腸桿菌β-胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因提高β-胡蘿卜素合成能力. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8): 1193?1203.

Dai GP, Sun T, Miao LT, et al. Modulating expression of key genes within β-carotene synthetic pathway in recombinant

Escherichia coli with RBS library to improve β-carotene production. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1193?1203.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CBA00800), Tianjin Key Technology R&D Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No. 12ZCZDSY14700), National Natural Science Foundation of China (No. 31100047), the Hundred Talent Program of the Chinese Academy of Sciences.

Qingyan Li. Tel/Fax: 86-22-84861946; E-mail: li_qy@tib.cas.cn

*These authors contributed equally to this work.

國(guó)家基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CBA00800)，天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 12ZCZDSY14700)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31100047), 中國(guó)科學(xué)院百人計(jì)劃資助。

時(shí)間：2014-02-25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130570.html