趙冬敏， 黃欣梅， 劉宇卓， 韓凱凱， 謝星星， 劉曉燕， 李 銀

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

鵝坦布蘇病毒(Goose tembusu virus，GTV)屬于黃病毒科黃病毒屬，該病毒引起坦布蘇病毒病，又稱產(chǎn)蛋下降綜合癥、傳染性卵巢炎，是以產(chǎn)蛋率、采食量顯著下降，出現(xiàn)腦炎樣神經(jīng)癥狀為特征的新型傳染病。2010年4月至11月首次在中國(guó)暴發(fā)并迅速傳播到國(guó)內(nèi)主要鴨鵝養(yǎng)殖地區(qū)，包括浙江、福建、廣東、廣西、安徽、江蘇、江西、河南、山東、河北和北京等省市，給中國(guó)鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過(guò)病原分離和系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷，證實(shí)該病病原為一種新型的坦布蘇病毒病，該病的發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為5% ～10%。2011年和2012年夏秋季，鵝坦布蘇病再次在江蘇等省大面積暴發(fā)，是2010年以來(lái)危害養(yǎng)鴨、鵝業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一［1-3］。

鵝坦布蘇病毒是不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)。鵝坦布蘇病毒基因組大約11000 bp，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì):核衣殼蛋白質(zhì)(C)、外膜蛋白質(zhì)(PrM and M)和囊膜蛋白質(zhì)(E)及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)［4］。囊膜蛋白質(zhì)(E蛋白質(zhì))全長(zhǎng)為500個(gè)氨基酸左右，相對(duì)分子質(zhì)量約為54000，位于成熟病毒顆粒表面，構(gòu)成病毒顆粒的突起。E蛋白質(zhì)是黃病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在病毒吸附、與宿主細(xì)胞膜融合以及病毒組裝過(guò)程中具有重要作用。同時(shí)，E蛋白質(zhì)也是黃病毒主要的抗原成分，含有多種抗原表位，可通過(guò)誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答［5］。

研究結(jié)果表明黃病毒E蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β-折疊組成，在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ區(qū))［6-7］。結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于E蛋白質(zhì)單聚體中央，由120個(gè)左右氨基酸組成的3個(gè)不連續(xù)片段構(gòu)成一個(gè)β桶狀中心結(jié)構(gòu)，起到穩(wěn)定E蛋白質(zhì)二聚體的作用。結(jié)構(gòu)域Ⅱ由2個(gè)不連續(xù)片段組成，折疊成指樣結(jié)構(gòu)。該區(qū)域cd環(huán)富含甘氨酸且完全疏水，在幾乎所有的黃病毒屬病毒中均是保守的，在E蛋白質(zhì)由二聚體向三聚體轉(zhuǎn)變的過(guò)程中插入胞膜，參與病毒與宿主細(xì)胞膜融合，被認(rèn)為是病毒融合肽［8-9］。由此推測(cè)，坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ在病毒感染和致病過(guò)程中具有重要作用。

本研究試圖克隆并表達(dá)鵝坦布蘇病毒JS804株E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ，并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得重組E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ的大量表達(dá)，并通過(guò)Western-blot進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究鵝坦布蘇病毒的生物學(xué)特性、免疫學(xué)功能和血清學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株

含有鵝坦布蘇病毒JS804株全基因的質(zhì)粒、pET28a原核表達(dá)載體，宿主菌DH5α、BL21(DE3)，E蛋白質(zhì)陽(yáng)性血清，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所家禽重大疫病防控項(xiàng)目組保存。

1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠回收試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒等購(gòu)自Axygen公司;pMD18-T載體、T4DNA連接酶、Ex Taq酶、限制性內(nèi)切酶、DNA marker等購(gòu)自大連寶生物有限公司;FLAG抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗小鼠ⅠgG、BCⅠP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 E 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ(E-Ⅰ/Ⅱ)基因的克隆

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的鵝坦布蘇病毒JS804株(登錄號(hào):JF 895923)E基因序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，其中上游引物為E-Ⅰ/Ⅱ-F:5'-GAATTCATGGACTACAAAGACGACGACGACAAATTCAGCTGTCTGGGGATGC-3'，劃線部分為引入的 EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，斜體部分為引入的FLAG標(biāo)簽序列。下 游 引 物 為 E-Ⅰ/Ⅱ-R:5'-GTCGACTCATTTGTCGTCGTCGTCTTTGTAGTCTTTCAGCTTCAAACCC TGC-3'，劃線部分為引入的SalⅠ酶切位點(diǎn)，斜體部分為引入的FLAG標(biāo)簽序列。以上引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為893 bp。

1.3.2 E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ基因的PCR擴(kuò)增以含有鵝坦布蘇病毒JS804株全基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25.0 μl，其中雙蒸水 15.5 μl，10 × PCR buffer 2.5 μl，25.0 mmol/L MgCl21.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μl，上、下游引物(25 pmol/μl)各 1.0 μl，模板 DNA 1.0 μl，Ex Taq(5 U/μl)0.5 μl。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃ 預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。純化的PCR產(chǎn)物片段與pMD18-T克隆載體連接成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌。經(jīng)酶切鑒定后，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBⅠ進(jìn)行在線比對(duì)分析。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將 pMD18-T-E-Ⅰ/ⅠⅠ和 pET28a 質(zhì)粒分別用 EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切。用T4DNA連接酶將酶切后的E-Ⅰ/ⅠⅠ基因分別與 pET28a 載體連接，轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組表達(dá)載體。經(jīng)酶切鑒定后，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定與分析。

1.5 E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析

分別取含pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ重組質(zhì)粒的陽(yáng)性BL21(DE3)菌液，接種于 5 ml含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日取 100 μl接種于 10 ml含有卡那霉素(100 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.3 ～0.4，以終濃度1 mmol/L ⅠPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，分別于誘導(dǎo)后4 h、6 h 取500 μl菌液，12000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用生理鹽水重懸后與4×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，以pET28a空載體進(jìn)行同樣的操作作為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳觀察結(jié)果。

1.6 重組E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ蛋白質(zhì)在菌體中的分布

取5 ml 1 mmol/LⅠPTG誘導(dǎo)4 h的菌液，12000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用3 ml菌體裂解液重懸，超聲波破碎15 min，12000 r/min離心5 min，分別取上清液和沉淀與4×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳觀察結(jié)果，以確定表達(dá)蛋白質(zhì)存在的位置。

1.7 重組蛋白質(zhì)的Western-blot鑒定

重組蛋白質(zhì)經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，采用濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜(NC)膜上，采用70 V電壓，作用 1 h。5%BSA、37℃封閉 2 h，TBST(0.05%Tween-20)洗滌后分別加入FLAG標(biāo)簽單抗和E蛋白質(zhì)陽(yáng)性血清并于4℃過(guò)夜。TBST(0.05%Tween-20)洗滌后加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠 ⅠgG于37℃孵育1 h。TBST(0.05%Tween-20)洗滌后按照BCⅠP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)顯色。

2 結(jié)果

2.1 鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ(E-Ⅰ/Ⅱ)基因的擴(kuò)增

以含有鵝坦布蘇病毒JS804株全基因的質(zhì)粒為模板，用所設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增E基因結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ片段，結(jié)果擴(kuò)增的片段大小約為900 bp左右，與預(yù)期大小相符(圖1)。

圖1 鵝坦布蘇病毒E基因結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of domainsⅠ and Ⅱ of goose tembusu virus E gene

2.2 鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ(E-Ⅰ/Ⅱ)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

提取重組質(zhì)粒 pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別得到2個(gè)片段，大小與預(yù)期相符(圖2)，測(cè)序結(jié)果表明E-Ⅰ/ⅠⅠ片段以正確方式分別插入pET28a載體中且序列正確。

2.3 鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析

將鑒定為陽(yáng)性的細(xì)菌進(jìn)行ⅠPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，以1 mmol/LⅠPTG誘導(dǎo)時(shí)，pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ在誘導(dǎo)后4 h出現(xiàn)目的條帶，大小約為37000的融合蛋白質(zhì)，與預(yù)期蛋白質(zhì)大小一致，在誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高(圖3)。

2.4 重組鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ蛋白質(zhì)在菌體中的分布

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ的酶切鑒定Fig.2 Ⅰdentification of recombinant plasmid pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠby enzyme digestion

圖3 pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ重組蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE 檢測(cè)Fig.3 Analysis of pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠfusion protein by SDS-PAGE

將誘導(dǎo)表達(dá)6 h的細(xì)菌進(jìn)行超聲波裂解，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) pET28a-E-Ⅰ/Ⅱ融合蛋白質(zhì)以包涵體形式存在(圖4)。

2.5 重組鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ蛋白質(zhì)的Western-blot鑒定

Western-blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的全菌蛋白質(zhì)在相對(duì)分子量約為37000的位置有與FLAG標(biāo)簽單抗反應(yīng)的特異條帶(圖5)，說(shuō)明E-Ⅰ/Ⅱ成功與FLAG標(biāo)簽進(jìn)行了融合表達(dá)。

以鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)陽(yáng)性血清為一抗，用Western-blot對(duì)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在37000處有特異性條帶(圖6)，表明該重組蛋白質(zhì)得到正確表達(dá)且具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ重組蛋白質(zhì)在菌體中的分布Fig.4 Distribution of pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠfusion protein in recombinant E.coli

圖5 FLAG單克隆抗體鑒定pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ融合蛋白質(zhì)Fig.5 Western-blot identification of pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠfusion protein against FLAG McAb

圖6 E蛋白質(zhì)陽(yáng)性血清鑒定pET28a-E-Ⅰ/Ⅱ融合蛋白質(zhì)Fig.6 Western-blot identification of pET28a-E-Ⅰ/Ⅱ fusion protein against positive serum for E protein

3 討論

由鵝坦布蘇病毒引起的疫病在中國(guó)屬于新發(fā)傳染病，可引起蛋鴨、種鵝死亡和產(chǎn)蛋下降，幾乎所有鴨、鵝場(chǎng)均遭受了巨大經(jīng)濟(jì)損失，雖然該病已在中國(guó)南方大部分地區(qū)廣泛流行，但對(duì)病原的生物學(xué)特性、致病機(jī)理、流行規(guī)律尚未進(jìn)行深入研究，這給本病的防控帶來(lái)一定困難。

黃病毒屬病毒通過(guò)E蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合而吸附和感染宿主細(xì)胞。因此，E蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞表面受體的相互作用是病毒對(duì)宿主細(xì)胞嗜性和病毒毒力的主要決定因素。硫酸乙酰肝素(HS)是廣泛存在于細(xì)胞表面的一類由二糖重復(fù)單位組成的多糖，表面具有大量負(fù)電荷具有包括介導(dǎo)病原體吸附等在內(nèi)的多種生物學(xué)功能。研究結(jié)果表明黃病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ中帶有大量的正電荷Arg和Lys，可能有助于病毒與HS結(jié)合［10］。

本試驗(yàn)選用pET-28a原核表達(dá)載體成功表達(dá)鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ。表達(dá)的目的蛋白質(zhì)雖以包涵體形式存在，但是通過(guò)簡(jiǎn)單的包涵體變性和復(fù)性等純化步驟后即可獲得高表達(dá)量、單一的目的蛋白質(zhì)，同時(shí)由于攜帶有FLAG標(biāo)簽，其特異性較好，使用廣泛，使得Western-blot檢測(cè)更加簡(jiǎn)便、可信，并利于后續(xù)試驗(yàn)中的特異性檢測(cè)。

綜上所述，本研究實(shí)現(xiàn)了重組鵝坦布蘇病毒E蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ的原核表達(dá)，為研究囊膜蛋白質(zhì)在鵝坦布蘇病毒細(xì)胞感染中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

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