吳小瓊，張賢，薛偉，劉新華

(1.安順職業(yè)技術(shù)學院，貴州 安順 561000;2.貴州大學精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

新型香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物的合成及其抗腫瘤活性*

吳小瓊1，張賢2，薛偉2，劉新華2

(1.安順職業(yè)技術(shù)學院，貴州 安順 561000;2.貴州大學精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

以3-乙?；?6-香豆素為起始原料，設(shè)計并合成了一系列新型香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和元素分析表征。初步體外生物活性測定結(jié)果表明:丁硫基乙酰三氟甲基苯基香豆素二氫吡唑(6a)和丙硫基乙酰苯基香豆素二氫吡唑(6f)對癌細胞SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2具有較高的抑制增殖活性。用改進的TRAP法測試了6a，6e和6f的端粒酶活性，其中6f具有很強的抑制活性，其IC50為(1.27±0.18)μM。

香豆素;二氫吡唑;藥物設(shè)計;合成;抗癌活性;端粒酶活性

端粒酶是一種腫瘤標志物，已成為抗腫瘤藥物篩選的新靶點［1-2］。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的催化亞甲基，這種催化酶是端粒酶活性的關(guān)鍵。目前，靶向端粒酶的抗腫瘤治療有兩種策略:一是直接通過抑制端粒酶的催化亞基活性(hTERT)或其RNA模板，從而抑制端粒酶活性。另一種是間接抑制端粒酶亞單位與G-四鏈體穩(wěn)定劑，端粒聚合酶或HSP90抑制劑的結(jié)合［3-4］。最近，一些優(yōu)良抗癌效果的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑被報道，如BIBR15324，但這些抑制劑的選擇性不高，對人體正常細胞毒性較大。因此，發(fā)現(xiàn)并合成高效、高選擇性端粒酶抑制劑是抗癌藥物發(fā)展的迫切需要。

3，4-二氫吡唑衍生物具有多種生物活性［5-7］。本課題組曾報道［8］過類似化合物的合成及其抗腫瘤活性，尤其是基于端粒酶靶標的新型3，4-二氫吡唑衍生物的設(shè)計、合成及構(gòu)效關(guān)系。研究結(jié)果表明:當在3，4-二氫吡唑骨架上接入香豆素基團時可得到具有更高抗腫瘤活性的化合物。

本課題組通過計算機虛擬篩選，已經(jīng)確定了高電子密度的香豆素環(huán)上方的活性空間。與此同時也發(fā)現(xiàn)了一種基于hTERT(3DU6)晶體結(jié)構(gòu)的小分子抑制劑的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。由于得到了結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)信息，可以利用分子模擬與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)相結(jié)合指導(dǎo)目標化合物的設(shè)計，以便更有效地進行綁定，從而增加藥物的效力。為此，對計算機生成二氫吡唑香豆素硫代乙酮與hTERT的活性位點的分子對接模型進行了分析。引入三氟甲基便形成一個鹵鍵，苯基二氫吡唑環(huán)固定到一個更穩(wěn)定的疏水區(qū)，加強了端粒酶抑制活性。我們也注意到活性位點附近的親水性作用的重要性，以及該基團的關(guān)鍵位置(硫酮)在溶劑的暴露區(qū)域的結(jié)合位點，同時，芳香環(huán)的平面疏水基團可以結(jié)合的疏水性空腔的面積，所以，在設(shè)計中用帶環(huán)的化合物作為S部分的取代基團?；谝陨戏治?，且少有文獻系統(tǒng)報道上述骨架的設(shè)計合成，為了尋找并發(fā)現(xiàn)新的具有抗癌活性高效端粒酶抑制劑，本文設(shè)計并合成了一系列新型三氟甲基苯基硫代乙酮二氫吡唑香豆素。

本文以3-乙酰基-6-香豆素(1)為起始原料，與2-三氟甲基苯(2a)［或苯(2f)］經(jīng)克萊森縮合反應(yīng)制得6-氯香豆素-取代苯基-α，β-不飽和酮(3a，3f);3與硫醇經(jīng)SN2反應(yīng)制得3-［1-(2-溴乙?；?-5-取代苯基-4，5-二氫吡唑-6-氯香豆素(4a，4f);4與取代硫醇(5a～5g)經(jīng)取代反應(yīng)合成了7個新型的香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g，Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和元素分析表征。測定了6a～6g對SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2的體外抗腫瘤活性。并用改進的TRAP法測試了6a，6e和6f的端粒酶活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點儀(溫度未校正);400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標);Elementar Vario-III型元素分析儀;BioRad 550型酶標儀。

1，3和4參考文獻［8］方法合成;其余所用試劑均為分析純。

1.2 6a～6g的合成(以6a為例)

在反應(yīng)瓶中加入4a 10 mmol和氯仿20 mL，攪拌使其溶解;加入叔丁基硫醇(5a)10 mmol，KHCO38 mmol和催化劑KI 0.1 g，于40℃～50℃反應(yīng)3 h。冷卻至室溫，加少量水，靜置沉淀;過濾，濾餅經(jīng)二氧化硅柱色譜［洗脫劑:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=68∶1］純化得無色晶體6a。

用類似的方法合成無色晶體6b～6g。

6a:收率75%，m.p.176℃～177℃;1H NMR δ:0.88(t，J=8.0 Hz，3H，CH3)，1.32(m，2H，CH2in Bu)，1.55(m，2H，CH2in Bu)，2.67(t，J=4.0 Hz，2H，6-H)，3.17(dd，J=20.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.77(m，2H，6-H)，3.93 (dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.75 (dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.17～7.58(m，7H，ArH)，8.65(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C25H22N2O3SF3Cl:C 57.42，H 4.24，N 5.36;found C 57.75，H 3.93，N 5.69。

6b:收率68%，m.p.143℃～145℃;1H NMR δ:3.18(dd，J=4.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Ha)，3.75～3.90(m，2H，6-H)，4.00(dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.85(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，6.30～6.47(m，2H，3″，4″-H)，7.22～7.60(m，8H，ArH，5″-H)，8.61(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C25H16N2O4SF3Cl:C 57.09，H 3.32，N 5.12;found C 56.71，H 3.29，N 5.40。

6c:收率77%，m.p.147℃～148℃;1H NMR δ:3.12(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.92(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.18～4.49(m，2H，6-H)，5.72(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.10(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，7.28～7.46(m，9H，ArH)，7.71(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，8.63(s，1H，4'-H); Anal.calcd for C27H17N2O3SF3ClBr:C 52.15，H 2.76，N 4.50;found C 51.87，H 3.03，N 4.81。

6d:收率69%，m.p.150℃～151℃;1H NMR δ:3.16(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，4.05(dd，J=18.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.09～4.34(m，2H，6-H)，5.65(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.11～7.71(m，10H，ArH)，8.00(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，8.61(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C27H17N3O5SF3Cl:C 55.16，H 2.91，N 7.15;found C 54.87;H 3.09，N 7.48。

6e:收率63%，m.p.165℃～167℃;1H NMR δ:3.15(dd，J=18.0 Hz，1H，4-Ha)，4.05(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.33～4.79 (m，2H，6-H)，5.77(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz， 1H，5-H)，7.16～7.47(m，7H，ArH)，7.85(d，J=4.0 Hz，1H，ArH)，8.69(d，3H，4'-H，Py-H);Anal.calcd for C25H16N4O3SF3Cl:C 55.10，H 2.96，N 10.28;found C 55.35，H 3.14，N 9.89。

6f:收率72%，m.p.175℃～176℃;1H NMR δ:0.90(t，J=8.0 Hz，3H，CH3in Pr)，1.61～2.53(m，4H，CH2in Pr)，3.15(dd，J=20.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.70(m，2H，6-H)，3.87 (dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.71 (dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.09～7.35(m，8H，ArH)，8.64(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C23H21N2O3SCl:C 62.65，H 4.80，N 6.35;found C 63.02，H 5.11，N 5.95。

6g:收率67%，m.p.149℃～151℃;1H NMR δ:3.13(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.90(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.10～4.43(m，2H，6-H)，5.65(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，6.97～7.41(m，13H，ArH)，8.63(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C26H19N2O3SCl:C 65.75，H 4.03，N 5.90;found C 66.01，H 4.27，N 5.62。

1.3 活性測試

［8］方法測定6a～6g和5-Fu的抗癌活性和端粒酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗癌活性

以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為陽性對照，考察了6a～6f對SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2的細胞毒活性，實驗結(jié)果見表1。從表1可見，6a和6f對SGC-7901和MGC-803表現(xiàn)出較好的細胞毒活性，而且超過了5-Fu的細胞毒活性。6f對Bcap-37抗癌活性也要比5-Fu強，其IC50為(4.59±0.77)μM。

從表1的活性數(shù)據(jù)可以得出以下結(jié)論:6a～6g可以分為兩類，即在硫原子的末端含有直鏈取代基化合物(6a，6f)和環(huán)狀取代的化合物(6b，6c，6d)，其中6a和6f對SGC-7901，HepG-2，Bcap-37和MGC-803細胞系表現(xiàn)出較為明顯的抗癌活性，而大多數(shù)其它環(huán)狀取代基團的化合物對上述細胞系只表現(xiàn)出中強度的抗癌活性。

表1 6a～6g的體外抗癌活性aTab le 1 Anticancer activities of 6a～6g in vitro

表2 6a，6e和6f對端粒酶抑制活性Table 2 The inhibitory activities of 6a，6e and 6f on telomerase

2.2 端粒酶活性

以MGC-803為研究對象，從中提取出了端粒酶，并選用溴化乙錠和BIBR1532作為對照測試了6a，6e和6f對端粒酶的抑制作用，實驗結(jié)果見表2。從表2可見，6f對端粒酶表現(xiàn)出很強的抑制活性，其IC50為(1.27±0.18)μM。表1和表2數(shù)據(jù)表明:6f的抗增殖活性和端粒酶活性之間具有良好的相關(guān)性，初步說明6f是通過抑制端粒酶而抑制癌細胞生長的，表現(xiàn)出比其它化合物更高的抑制活性。三氟甲基可能具有局部偶極矩匹配結(jié)合的位點，使偶極矩的方向相反，導(dǎo)致較高的活性。這也為我們進一步優(yōu)化具有抗癌活性以作為潛在的端粒酶抑制劑的二氫吡唑結(jié)構(gòu)指出了方向。

3 結(jié)論

設(shè)計并合成了7個新型的香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g)。初步體外生物活性測定結(jié)果表明:丁硫基乙酰三氟甲基苯基香豆素二氫吡唑(6a)和丙硫基乙酰苯基香豆素二氫吡唑(6f)對癌細胞SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2具有較高的抑制增殖活性。6f對端粒酶具有很強的抑制活性，其IC50為(1.27±0.18)μM。

參考文獻

［1］Corey D R.Telomeres and telomerase:From discovery to clinical trials［J］.Chem Biol，2009，16:1219-1223.

［2］Ding Z，Wu C J，Jaskelioff M，et al.Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases［J］.Cell，2012，148(5):896-907.

［3］Harley C B.Telomerase and cancer therapeutics［J］.Nat Rev Cancer，2008，8(3):167-179.

［4］Shay JW，Keith W N.Targeting telomerase for cancer therapeutics［J］.Br JCancer，2008，98(4):677-683.

［5］劉新華，白林山，王世范.5-(2-羥基苯基)-3-甲基吡唑酰胺衍生物的合成與殺菌活性［J］.合成化學，2006，14(2):147-149.

［6］劉新華，白林山，王世范.新型吡唑硫代酰胺衍生物的合成與殺菌活性［J］.合成化學，2006，14(3): 272-275.

［7］白林山，劉會峰，劉新華.新型色酮衍生物的設(shè)計合成與抗癌活性［J］.合成化學，2010，18(6): 671-674.

［8］Liu X H，Li J，Shi JB，etal.Design and Synthesis of novel 5-phenyl-N-piperidine ethanone containing 4，5-dihydropyrazole derivatives as potential antitumor agents［J］.European Journal of Medicinal Chemistry，2012，51(3):294-299.

Synthesis and Anticancer Activities of Novel Coumarin-dihydropyrazole Thio-ethanone Derivatives

WU Xiao-qiong1，ZHANG Xian2，XUEWei2，LIU Xin-hua2
(1.Anshun Professional Technology Institute，Anshun 561000，China; 2.Center for Research and Development of Fine Chemicals，Guizhou University，Guiyang 550025，China)

A series novel coumarin-dihydropyrazole thio-ethanone derivativeswere designed and synthesized from 3-acetyl-6-coumarin.The structureswere characterized by1H NMR and elemental analysis.The preliminary in vitro biological activities tests showed that［(butylthio)acetyl］-5-［2-(trifluoromethyl)phenyl］-dihydropyrazole(6a)and［(propylthio)acetyl］-5-［2-(trifluoromethyl)phenyl］-dihydropyrazole(6f)exhibited high anticancer activities against SGC-7901，MGC-803，Bcap-37 and HepG-2 cell lines.6a，6e and 6f were tested against telomerase by a modified TRAP assay and 6f showed themost potent inhibitory activity with IC50value of(1.27±0.18)μM.

coumarin;dihydropyrazole;drug molecular design;synthesis;anticancer activity;telomerase activity

O621.3;R914.5

A

1005-1511(2014)02-0164-04

2013-09-09;

2013-11-12

國家自然科學基金資助項目(21272008)

吳小瓊(1967-)，女，漢族，貴州安順人，副教授，主要從事有機化學的研究。

劉新華，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:xhliuhx@163.com