耿 明，王翠翠，高光凱，毛蕊琪，曹永成，劉曉紅

·論著·

Ⅱ型減壓病家兔脊髓神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的變化研究

耿 明，王翠翠，高光凱，毛蕊琪，曹永成，劉曉紅

目的 電鏡觀察Ⅱ型減壓病家兔脊髓神經(jīng)軸突的超微結(jié)構(gòu)改變，探討減壓病所致脊髓損傷的機(jī)制。方法 將15只新西蘭大耳白家兔按數(shù)字表法隨機(jī)分為3組:減壓病組、安全減壓組和正常對(duì)照組，每組5只。減壓病組行快速減壓制作減壓病動(dòng)物模型，安全減壓組采用安全減壓，正常對(duì)照組行常壓空氣暴露，各組動(dòng)物出艙后30 min內(nèi)處死，取脊髓組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果 減壓病組神經(jīng)細(xì)胞水腫，細(xì)胞內(nèi)線粒體輕度腫脹，游離核糖體聚集;軸突水腫，髓鞘松解、褶曲，部分剝離，軸突內(nèi)線粒體腫脹，微管排列紊亂，并見(jiàn)許多大小不等的空泡形成。安全減壓組神經(jīng)細(xì)胞和軸突輕度水腫，胞質(zhì)和軸索內(nèi)可見(jiàn)小空泡形成，髓鞘板層結(jié)構(gòu)松散。正常對(duì)照組脊髓組織超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯改變。結(jié)論 神經(jīng)纖維水腫、軸突脫髓鞘為Ⅱ型減壓病家兔脊髓損傷的基本病變，脊髓血管內(nèi)氣泡及“原位氣泡”可能同為導(dǎo)致脊髓損傷的直接原因。

Ⅱ型減壓病;脊髓;神經(jīng)軸突;透射電鏡

減壓病(decompression sickness，DCS)是潛水、航空和航天人員的常見(jiàn)職業(yè)病，由于機(jī)體外部壓力下降過(guò)快，導(dǎo)致體內(nèi)組織中溶解的惰性氣體快速溢出，形成氣泡在體內(nèi)游離，引起一系列的病理生理改變，可對(duì)機(jī)體各個(gè)臟器產(chǎn)生影響，造成身體機(jī)能的嚴(yán)重障礙引發(fā)休克或死亡［1］，嚴(yán)重威脅潛水和航空人員安全。Ⅱ型DCS主要是因?yàn)闅怏w氣泡充塞于人體的呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)，造成身體機(jī)能的嚴(yán)重障礙，主要癥狀有頭昏、耳鳴、暈眩、視覺(jué)模糊、四肢協(xié)調(diào)障礙等，嚴(yán)重者可引起休克、死亡［2-3］。DSC導(dǎo)致的脊髓損傷已有較多研究，筆者前期通過(guò)建立Ⅱ型DSC家兔模型，觀察了DSC所致脊髓損傷的組織病理學(xué)改變，旨在了解脊髓特別是神經(jīng)軸突的超微結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步探討脊髓損傷與臨床癥狀的內(nèi)在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性新西蘭大耳白家兔15只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購(gòu)自山東魯抗集團(tuán)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK，魯20100005)，按數(shù)字表法隨機(jī)分為DCS組、安全減壓組和正常對(duì)照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前，家兔飼養(yǎng)1周以上以適應(yīng)環(huán)境。環(huán)境條件:普通清潔級(jí)，室溫23～25℃，濕度50.0% ～56.0%，光照時(shí)間6:00-18:00。

1.2 DSC動(dòng)物模型制備及各組處理方法 DCS組按照高光凱等［4］報(bào)道的方法制備家兔Ⅱ型DCS模型:動(dòng)物置于加壓艙內(nèi)，5 min空氣加壓至800 kPa (絕對(duì)壓)，停留60 min，3～5 min快速減至常壓后出艙。安全減壓組加壓方法與DCS組一致，但參照海軍潛水安全減壓方案減到常壓［5］。正常對(duì)照組置于加壓艙內(nèi)，常壓空氣暴露，持續(xù)通風(fēng)，暴露60 min結(jié)束后出艙。觀察各組動(dòng)物出艙后的行為學(xué)表現(xiàn)，出艙后30 min內(nèi)處死并采集標(biāo)本。

1.3 標(biāo)本采集和超微結(jié)構(gòu)觀察 各組動(dòng)物出艙后30 min內(nèi)，用10 mg/kg鹽酸氯胺酮和氟哌利多溶液肌肉注射麻醉、處死，取胸腰段脊髓組織，制作成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm大小的電鏡標(biāo)本，迅速入2.5%戊二醛預(yù)固定，1%鋨酸后固定，EPON812包埋，徠卡超薄切片機(jī)切片，切片厚度60～70 nm，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色，用JEOL-1400型電子透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn) DCS組快速減壓出艙后，5只家兔均出現(xiàn)不同程度的DCS癥狀，主要表現(xiàn)為瘙癢、呼吸頻快、躁動(dòng)不安等，并表現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)下肢活動(dòng)障礙，其中2只病情嚴(yán)重，分別于出艙后30、43 min死亡;安全減壓組活動(dòng)正常，未見(jiàn)明顯DCS癥狀;正常對(duì)照組活動(dòng)正常。

2.2 解剖結(jié)果 DCS組脊髓呈灰白色，剖開(kāi)可見(jiàn)較多出血點(diǎn)和淤血，質(zhì)軟;正常對(duì)照組脊髓呈灰白色，質(zhì)地柔軟;安全減壓組基本同正常對(duì)照組。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組軸索被髓鞘包繞，髓鞘呈及其規(guī)則的同心圓狀排列，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常(圖1A);安全減壓組軸索被髓鞘包繞，髓鞘呈同心圓狀排列，偶見(jiàn)部分區(qū)域松懈、分離(圖1B);神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)個(gè)別線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，偶可見(jiàn)多泡體結(jié)構(gòu)。DCS組病變較輕部位可見(jiàn)軸索與髓鞘板層最內(nèi)層部分分離，髓鞘扭曲、折疊、皺起;軸突內(nèi)線粒體輕度腫脹，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微管輕度擴(kuò)張。病變較重部位可見(jiàn)軸突萎縮，失去與髓鞘的正常比例;線粒體腫脹，髓鞘板層結(jié)構(gòu)大部分松懈扭曲、折疊甚至斷裂崩解(圖1C、D);嚴(yán)重者可見(jiàn)脫髓鞘改變，線粒體高度腫脹，擴(kuò)張的微管和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)深入軸索內(nèi)與神經(jīng)絲形成蜂窩狀結(jié)構(gòu)(圖1E);神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)透明，部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)核周體為空泡形式，線粒體輕度腫脹，核糖體減少、聚集(圖1F)。

圖1 各組兔胸腰段脊髓超微結(jié)構(gòu)圖

3 討論

3.1 Ⅱ型DCS家兔脊髓神經(jīng)軸突改變特點(diǎn) DCS是一類(lèi)在特定環(huán)境下發(fā)生的疾病，脊髓損傷為急性DCS的主要特征之一。本研究顯示，透射電鏡下可見(jiàn)Ⅱ型DCS家兔脊髓的損傷主要在神經(jīng)軸突，包繞軸突的髓鞘板層輕者松解扭曲，重者折疊起皺，嚴(yán)重部位可見(jiàn)髓鞘崩解;軸索水腫變性，失去與髓鞘的正常比例，出現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象，軸索內(nèi)線粒體、微管和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等腫脹，神經(jīng)細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹和線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，游離核糖體部分聚集。這與Francis等［6］對(duì)DCS狗模型的觀察結(jié)果基本吻合。本研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型DCS家兔的中樞神經(jīng)系統(tǒng)改變最嚴(yán)重表現(xiàn)為軸突的脫髓鞘改變。

筆者的前期的研究發(fā)現(xiàn)，DCS家兔脊髓脊膜血管擴(kuò)張，少數(shù)有充血，大多數(shù)為單純性的擴(kuò)張，脊髓白質(zhì)及灰質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張，推斷血管內(nèi)曾有氣泡的產(chǎn)生，氣泡體積逐漸增大或氣泡被運(yùn)送到直徑較小的血管時(shí)使血管擴(kuò)張，氣泡直接或間接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)一系列損傷反應(yīng)。還觀察到在脊髓白質(zhì)也出現(xiàn)了大量的氣泡(原位氣泡)。因此推斷，由于脊髓白質(zhì)的脂肪含量很高，當(dāng)快速減壓時(shí)，飽和的惰性氣體從溶解狀態(tài)逐漸溢出，形成氣泡并增大，使神經(jīng)纖維受到直接機(jī)械性損傷或啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而脊髓灰質(zhì)區(qū)氣泡不明顯，神經(jīng)細(xì)胞受損較輕。

脊髓神經(jīng)屬于混合性神經(jīng)，包括軀體傳入、傳出神經(jīng)纖維和內(nèi)臟傳入、傳出神經(jīng)纖維。因此，脊髓神經(jīng)纖維的損傷極易導(dǎo)致所支配范圍軀體和內(nèi)臟的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)等功能障礙。本實(shí)驗(yàn)中，Ⅱ型DCS家兔的主要癥狀表現(xiàn)為瘙癢、呼吸頻快、躁動(dòng)不安等，并出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)下肢活動(dòng)障礙，這些表現(xiàn)均與脊神經(jīng)受損有關(guān)，

3.2 Ⅱ型減壓病脊髓損傷的機(jī)制 對(duì)于DCS脊髓損傷的機(jī)制，有觀點(diǎn)認(rèn)為是因?yàn)闅馀菰趧?dòng)脈系統(tǒng)形成栓子，栓塞血管，隨后造成毛細(xì)血管和前毛細(xì)血管的阻塞，組織缺血，使軸索受到損傷［7］;也有人提出當(dāng)減壓非常迅速、劇烈時(shí)，靜脈系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的大量氣體栓子，超過(guò)了肺毛細(xì)血管的濾過(guò)能力，所以氣泡進(jìn)入體循環(huán)血管內(nèi)，氣泡激活了機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生趨化因子及血管活性因子使得白細(xì)胞黏附性增強(qiáng)、血管通透性增高，直接或間接激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部組織供血不足受損［8］。動(dòng)物腦及脊髓組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，脊髓白質(zhì)有大量血管周?chē)某鲅?，而灰質(zhì)中并不多見(jiàn)，也表明在造成脊髓損傷的DCS中出現(xiàn)了椎靜脈的梗塞，椎靜脈回流受阻。

Ozdoba等［9］認(rèn)為DCS所致脊髓損傷是由于組織內(nèi)“原位氣泡”形成造成的，他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，因DCS致癱瘓的狗的脊髓中有小氣泡出現(xiàn)。Francis等人［6，10］的研究發(fā)現(xiàn)，在DCS的脊髓白質(zhì)中有大量空泡區(qū)域，電鏡下這些區(qū)域顯示出非常有趣的特征: (1)這些區(qū)域都位于血管外、髓磷脂內(nèi)，尤其是大的軸突的髓磷脂;(2)低倍鏡下觀察，周?chē)M織明顯被擠壓;(3)許多較大的病變區(qū)域含有髓磷脂樣物及受壓的軸突。他們均認(rèn)為存在“原位氣泡”直接導(dǎo)致機(jī)械性損傷的可能。

上述理論可部分解釋DCS所致脊髓損傷的發(fā)生，但是不能完全、徹底解釋DCS的各種表現(xiàn)。筆者在光鏡下觀察到，Ⅱ型DSC家兔的脊膜、脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)血管內(nèi)均有大量擴(kuò)張的血管和空泡區(qū)，表明快速減壓過(guò)程中產(chǎn)生了血管內(nèi)氣泡;同時(shí)觀察到在脊髓白質(zhì)內(nèi)也出現(xiàn)了大量氣泡［11-12］。根據(jù)電鏡下脊髓神經(jīng)改變特點(diǎn)，結(jié)合家兔癥狀綜合分析，筆者推斷脊髓血管內(nèi)氣泡和血管外氣泡即“原位氣泡”，兩者均對(duì)脊髓造成損傷，同為造成神經(jīng)軸突受損的直接原因;而脊髓白質(zhì)出血水腫、神經(jīng)纖維脫髓鞘等，可能為Ⅱ型DCS家兔脊髓損傷后超微結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ)。

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Observation under electrom icroscopy on spinal neuraxon of rabbits w ith typeⅡ decompression sickness

GENGMing，WANG Cui-cui，GAO Guang-kai，MAO Rui-qi，CAO Yong-cheng，LIU Xiao-hong

(Department of Pathology，General Hospital of Jinan Military Command，Jinan 250031，China)

Objective To observe changes in the ultra-structure of spinal neuraxon in rabbits with typeⅡ decompression sickness(DCS)and also to investigate themechanism involved in the damage of spinal cord.Methods Fifteen New Zealand white rabbitswere random ly divided into 3 groups:the DCS group，the safe decompression group and the control group.The rabbits in the DCS group were decompressed in rapid pace to develop the DCSanimalmodel，the animals in the safe decompression group were safely decompressed to normal pressure and the animals in the control group were just exposed to normal air pressure.The animals in all groupswere sacrificed within 30 minutes after they were brought out of the chamber.Then，spinal cord samples were collected for the observation of ultra-structure.Results Edema of neurocytes，slight swelling ofmitochondria and aggregation of free ribosomes could be observed in the rabbits of the DCS group.Electron microscopic detection indicated that there were axon edema，myelin sheath relaxiation，partial demyelination，mitochondria swelling in neuraxon，disturbance in microtubule and bubble formation of various sizes.For the animals in the safe decompression group，slightedema of neurocytes and neuraxon，formation of small bubbles in cytoplasm and axon and loose structure ofmyelin sheath could be observed in them.However，for the animals in the normal control group，therewere no significant changes in the ultra-structure of spinal cord tissue.Conclusion Nerve fiber edema and axon demyelination were primary pathological changes in the animalswith spinal cord damage induced by typeⅡdecompression sickness.Air bubbles in spinal cord vessels and"pre-invasive air bubbles"might be the direct cause for spinal cord damage.

TypeⅡdecompression sickness;Spinal cord;Neural axon;Transmission electron microscope

R845.21

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.008

2013-07-16)

(本文編輯:施 莼)

全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”面上項(xiàng)目資助課題(CWS11J241)

250031 濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院病理科(耿明、王翠翠、毛蕊琪、曹永成、劉曉紅);解放軍第四○一醫(yī)院高壓氧科(高光凱)

劉曉紅，電子信箱:liuxh333@126.com